Đồ án Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính protease đông tụ sữa từ Aspergillus awamori và ứng dụng trong sản xuất phomat

uất phomat. Việc sử dụng enzym làm đông tụ sữa trong công nghiệp sản xuất phomat và thực phẩm đã có từ lâu, có rất nhiều nguồn enzym khác nhau, bao gồm từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Renin là một loại enzym được chiết từ ngăn thứ tư dạ dày bê non, còn có tên khác như men đông tụ sữa. Từ xưa, người ta đã bbiết ứng dụng enzym này để làm động tụ sữa trong sản xuất phomat. Năm 1943 người ta thu được renin dưới dạng tinh thể. Nhiệt độ hoạt động tối thích của enzym là 400C, pH tối thích là 5.6, điểm đẳng điện pI là 4.6. Renin bền trong vùng pH5.3-6.3. Renin không thuỷ phân sâu sắc protein mà chỉ phân cắt thành các peptit. Nhờ đó mà tạo cho phomat không có vị đắng (do thuỷ phân sâu sắc tạo thành các axit amin), hương thơm đặc trưng, an toàn, không độc mà nhờ đó phomat làm từ enzym này có chất lượng cao. Ngoài renin ra, ở nguồn động vật có pepxin được chiết từ dạ dày bò hoặc lợn, enzym này đã được đề xuất là một enzym htay thế một phần renin, việc ứng dụng hoàn toàn pepxin trong sản xuất phomat làm cho phomat có vị đắng, gel tạo thành mềm gây mất nhiều chất béo dẫn đến làm giảm chất lượng phomat. Đã có nhiều những nghiên cứu để sử dụng protease đông tụ sữa từ thực vật bậc cao trong sản xuất phomat. Papain được tách từ nhựa đu đủ, khi mới tách nhựa này ra chúng không có khả năng hoạt động mà phải được hoạt hoá bởi Cystein, enzym này thuỷ phân protein mạnh. Ngoài ra còn có ficin nhựa của giống cây họ sung, và có khả năng đông tụ sữa. nói chung, nguồn enzym từ thực vật này khi sản xuất trong phomat làm sản phẩm có vị đắng, nhão, làm ảnh hưởng đến chất lượng phomat trong quá trình ngâm chín. Nhưng có một enzym thực vật có thể làm thay thế renin đó là bromelain có trong dứa, enzym này đã được sử dụng trong sản xuất phomat có chất lượng tương đối tốt. Nói chung do nguồn enzym đã nói ở trên đều khan hiếm, không thoả mãn về hiệu quả kinh tế, nhất là renin. Do vậy xu hướng trên thế giới hiện nay người ta tập trung nghiên cứu sản xuất enzym đông tụ sữa từ vi sinh vật như vi khuẩn và nấm mốc. Các enzym từ vi khuẩn Streptococus liquifaciens, Micrococus cascolyticus, Bacillus coagulans và Bacillus subtilis theo nghiên cứuvà dã được công nhận có khả năng sử dụng trong sản xuất phomat, đặc biệt là Bacillus subtilis. Protease trung tính của Bacillus subtilis có trong liposom cho vào sữa cừu đã được thanh trùng có tác dụng đối với phomat Machego, khi chín làm tăng hàm lượng protein, không gây vị đắng chất lượng cao hơn[22]. Channe Prakash S. và cộng sự (1998) đã cố định protease đông tụ sữa từ chủng Aspergillus niger MC4 lên glycidyl methacrylate-pentaerythritol triacrylate copolymer GP4 để thuỷ phân liên tục kappa-casein ứng dụng trong sản xuất phomat Người ta đã tách từ phomat Cheddar chất lượng tốt loại lactobaccillus các protease và nghiên cứu ảnh hưởng của các protease này tới vị phomat. Tất cả các vi sinh vật này có hoạt lực protease thấp không phụ thuộc vào nhiệt độ và pH trong quá trình sản xuất phomát này, không bị NaCl làm ảnh hưởng[12]. Protease từ nấm mốc đã được nghiên cứu rộng rãi, theo Sannabathi và Srinivasan [21] thì enzym protease của các giống A. nidulans, A. glaucus, Syncephalasrum raccemosum và Cladosporium herbarum có khả năng thuỷ phân protein lớn hơn renin và enzym này còn chịu được nhiệt độ cao. Ngoài ra người ta còn nghiên cứu đặc tính protease làm đông tụ sữa của các giống A. candidus, A. niger, Rhizophus oligosporuos. Theo Nakanishi thì Nhật bản đã sử dụng enzym protease từ A. oryzae làm động tụ sữa trong sản xuất phomat. Người ta đã so sánh hương vị của phomat oryzae với phomat Gouda làm từ renin và đã nhận sau 4 tuần ngâm chín của phomat oryzae bằng phomat Gouda đã ngâm chín sau 16 tuần, thấy tổng các axit béo bay hơi, tổng các hợp chất chứa sunfua, CO2 của phomat oryzae đều cao hơn phomat Gouda, tất cả các hợp chất trên đều tạo cho phomat oryzae hương vị quyễn rũ hơn Gouda. Trong những năm gần đây, đã có nghiên cứu cho rằng enzym từ Endothia parasitica, Mucor pusilus var. Lindt, Murco michei là một đối tượng có thể thay thế renin. Mỹ đã cho rằng đây là chất thay thế an toàn và phù hợp cho renin trong tiêu chuẩn sản xuất phomat. Enzym protease thu được từ Endothia parasitica đã được sử dụng làm phomat, người ta nhận thấy rằng enzym này làm tăng nhanh quá trình chín của phomat Cheddar, hoạt độ phân giải protein mạnh hơn renin trong đông tụ phomat Edam, Tilsit và phomat béo và trong sản phẩm xuất hiện vị đắng khi lượng enzym này vượt quá 70% so với renin. Moris và Mc Kenzie[13] nhận thấy rằng nếu sử dụng 75% enzym và 25% renin thì chất lượng phomat sau 3 tháng ngâm chín có chất lượng tốt, hương vị quyễn rũ và so với renin thì chất lượng loại phomat này là tương đương. Ngay từ năm 1976, người ta đã sản xuất được phomat Domiati từ chế phẩm renin vi sinh vật từ Endothia parasitica. Enzym từ Mucor pusilus var. Lindt có hoạt độ đông tụ gần giống với renin, khi sử dụng enzym này làm phomat Edam và Gouda có gia nhiệt trong quá trình tách whey đã cho hương vị ưa thích hơn phomat làm từ renin. Martens[16] nhận thấy rằng Gouda làm từ Mucor pusilus var. Lindt đã có chất lượng tương đương với phomat làm từ 50% pepxin-50% renin, ngoài ra người ta nhận thấy vị đắng không còn đáng kể sau khi ngâm chín 14 tháng. Enzym protease làm từ Murco michei đã được Europe kiểm tra và công nhận đạt chất lượng là enzym thay thế renin. Khi người ta đã so sánh xác suất của 15 lô phomat Emmental làm từ enzym này rất giống chất lượng phomat này làm từ renin, không có vị đắng, an toàn và phù hợp cho làm phomat Emmental. Thomason và cộng sự đã sử dụng Murco michei protease trong sản xuât phomat Edam, Tilsit và phomat béo qua nghiên cứu đã nhận thấy phomat làm từ enzym này có hiệu quả động tụ sữa cao, chất lượng tốt chín nhanh, không có vị đắng. Phomat Domia được sản xất từ Murco michei có độ thuỷ phân protein cao và có hàm lượng nitơ hoà tan trong hạt sau khi đông tụ cao hơn ở renin. Người ta đã tiến hành nghiên cứu số lượng lớn phoat Cheddar làm từ enzym này và nhận thấy phomat có chất lượng rất tốt, tương đương chất lượng làm từ renin sau khi chín tới. Ngoài ra phomat làm từ enzym này có hương thơm và kết cấu hấp dẫn. Thông thường trong thực tế sản xuất người ta kết hợp các loại emzym từ vi sinh vật khác nhau có khả năng đông tụ phomat theo tỉ lệ nhất định làm cho phomat có hương vị đặc trưng hấp dẫn. Sơ lược về phương pháp sản xuất sản xuất phomat Giới thiệu chung về phomat Phomat có đến hàng nghìn loại khác nhau, rất đa dạng về chủng loại tuy theo đặc điểm mùi vị, hình dáng, hàm lượng chất béo chúng được phân loại theo các cách sau đây[18]: Phân loại theo tác nhân đông tụ cazein hay axit, cũng có loại vừa là kết quả của sự đông tụ cazein bằng cả renin và axit ví dụ như Cottage. Phân loại về hàm lượng nước như phomat cứng ví dụ như Cheddar có hàm ẩm Ê 39%, phomat Havarti có hàm lượng nước Ê50% hoặc loại có hàm lượng nước từ 78-87% thuộc loại phomat mềm. Emmenthat có hàm lượng nước W<56%, Phân loại dựa theo vi khuẩn sử dụng khi ngâm chín phomat như: đa số các loại phomat đều chín nhờ vi khuẩn lactic, phomat Camebert chín nhờ nấm mốc trắng, phomat Gorgonzola và Rocquefort chín nhờ nấm mốc xanh. Phân loại theo cấu trúc phomat, kích thước các lỗ và các loại không có lỗ. Giới thiệu chung về sữa. Sữa là một tập hợp nhiều thành phần, hàm lượng các thành phần cơ bản của sữa có thể giao động trong một phạm vi khá rộng tuỳ thuộc vào sự khác biệt về giống, về điều kiện chăn nuôi. Hợp phần chính của sữa là nước chiếm khoảng 85,5-89,5% bao gồm nước tự do và nước liên kết. Trong thành phần chất khô người ta tìm thấy khoảng 100 chất bao gồm protein, lipit, lactoza, chất khoáng, vitamin, sắc tố, chất khí Protein là một phần quan trọng của sữa, chiếm khoảng 3,4 % trọng lượng của sữa. Protein của sữa bao gồm chủ yếu là cazein, lactalbumin và lactoglobulin. Cazein chứa khoảng 83% protein của sữa. Trong sữa hàm lượng cazein này giao động từ 2,3-2,9% theo khối lượng. Điểm này cazein khác hẳn với lactalbumin và lactoglobulin. Cazein là một protein hoàn thiện, có 3 dạng cazein trong sữa là αs, β và k-cazein chúng khác nhau về lượng phôspho trong phân tử, không nói đến cazein thì nói đến cả 3 loại, trong đó αs- cazein chiếm khoảng 43-65%, β-cazein là 19-35%. Cazein tồn tại ở dạng keo trong sữa, chúng có mức độ phân tán lớn do khả năng hydrat hoá cao và khả năng liên kết của cazein với chất béo. αs- cazein là một hợp phần của cazein, mỗi phân tử của nó có một đầu kị nước và một đầu ưa nước, αs- cazein rất nhạy cảm với ion Ca2+; β-cazein có hai đầu kị nước so với hai phân tử ở giữa, β-cazein không nhạy cảm với Ca2+ ở nhiệt độ thấp; k-cazein có đầu cuối N kị nước còn đầu cuối C chứa nhiều gluxit và ưa nước[14]. Tất cả các loại cazein đều bị photphoril hoá ở những mức độ khác nhau trên gốc Serin và Treonin. Do sự phân bố không đều các diện tích và các mạch bên không cực dọc theo các chuỗi polypeptit nên các cazein tự thân đã có độ tập hợp rất cao. Trong sữa, cazein ở dạng cazenat canxi và cazenat này lại kết hợp với photphat canxi tạo thành phức photphat canxi cazenat (các mixen). Muối canxi của αs- cazein, β-cazein không hoà tan trong nước trong khi muói của canxi của cazein dễ hoà tan trong nước. Chính vì sự phân bố của k-cazein ở mặt ngoài của mixen sẽ tan trong nước như một dạng của dung dịch keo. Đông tụ cazein bằng axit; các phân tử nước cũng liên kết các điện tích của cazein và góp phần duy trì các mixen trong dung dịch. Khi giảm độ pH (do kết quả quá trình lên men tạo ra axit lactic hoặc do axit do con người chủ động đưa vào) các ion H+ của axit sẽ liên kết với mixen mang điện tích âm và làm giảm điện tích của mixen cazein. Khi tới giới hạn, các mixen caze in sẽ đông tụ. Theo lý thuyết điểm dẳng điện pI của cazein là 5,1-5,3. Trong dung dịch nước như điều kiện của sữa, cazein động tụ tốt nhất ở pH 4,5-4,7. Khi cho dư axit, cazein động tụ sẽ tái hoà tan, tạo thành muối và axit. Cazein dễ bị động tụ dưới tác nhân axit, muối, trong môi trường pH thấp. Sự kết tủa cazein trong môi trường axit về bản chất khác sự kết tủa trong môi trường pH thấp, khi tác dụng với axit thì ion canxi của cazein bị tách ra, liên kết muối phức bị phá huỷ tạo kết tủa, kết tủa thu được trong môi trường axit này người ta không thấy có mặt của canxi. Hay nói cách khác là kết tủa cazein trong môi trường axit mang đặc tính của một phản ứng hoá học còn khi tăng nồng độ H+ trong sữa thì mối liên kết giữa nước và các tiểu phần cazein sẽ yếu đi, lớp vỏ solvat mỏng đi đẫn đến sự tích điện giảm xuống, các tiểu phân keo kết hợp với nhau taoh thành sự đông tụ cazein. Đông tụ bằng enzym-renin: dưới tác dụng của renin, cazein–k bị thuỷ phân phá huỷ lớp vỏ háo nước mặt khác cazein–k thông thường phân bố ở mặt ngoài của mỗi mixen do vậy khi mất lớp vỏ háo nước này các ion Ca2+ dễ dàng tiếp xúc với αs- cazein và paracazein làm chúng kết tủa tạo gel. Sự đông tụ của cazein là kết quả sự tạo thành cầu canxi giữa các phân tử cazein cũng như tương tác kị nước giữa các cazein α, β và k. Có thể nói tác động của renin đối với cazein bao gồm 3 bước: Bước 1: renin tấn công lên liên kết peptit ở vị trí Phe105 và Met105 của phân tử cazein-k để tạo thành hai đoạ paracazein -k không tan liên kết với mixen gốc và cazein gluco peptit hoà tan. Paracazein sẽ tương tác kị nước với α và β để tạo thành gel, do tính chất này mà người ta ứng dụng cố định k-cazein với enzym trên gel alginate-Ca, để nâng cao chất lượng hiêu quả trong công nghiệp sản xuất phomat. Bước 2: tạo thành tập hợp. Bước 3: tác động của renin với các cấu tử cazein xảy ra khi ngâm chí phomat. Tốc độ của 3 bước này phụ thuộc chủ yêu svào nhiệt độ và pH. Riêng đối với bước thứ hai thì còn chịu ảnh hưởng của nồng độ canxi, các tính chất của mixen cazein có hoặc lhống có liên kết với serum protein bền tính. Sau khi kết tủa cazein, trong phần nước sữa còn lại chứa α lactabumin, β lactoglobulin và một lượng nhỏ protein albumin. Lactabumin chiếm khoảng 0,5-1% theo khối lượng, 14% so với lượng protein chung, trong phân tử không chứa Ca và P. Lactabumin có 3 dạng là α, β, γ điểm đẳng điện pI là 4,5. Tại pH môi trường xấp xỉ điểm đảng điện lactabumin không bị đông tụ bởi chúng có hoạt độ hydrat hoá lớn. Nhưng khi dưới tác động ở > 700C thì lactabumin bị đông tụ tạo thành dạng bông và không bị đông tụ bởi renin và pepxin. Lactoglobulin chiếm khoảng 0,1% theo khối lượng, 3% so với lượng protein chung. Lactoglobulin có 3 dạng β lactoglobulin epglobulin và pseudoglobulin, điểm đẳng điện là pI 5,3. Tại nhiệt độ 72-750C trong môi trường axit yếu lactoglobulin bị đông tụ dưới tác dụng của renin, pepxin lactoglobulin không bị đông tụ, nhưng khi lên men β lactoglobulin bị biến tính và có thể chuyển vào quện sữa. Các immunoglobin trong sữa bình thường hàm lượng globumin miễn dịch rất thấp, ngược lại trong sữa đầu chúng chiếm tới 90% protein lactoserum. Phương pháp sản xuất phomát Sơ đồ chung sản xuất phomat: Thanh trùng. Thu nhận Làm sạch. Tiêu chuẩn hoá. Làm chín sữa. Cấy chủng lactic Bổ sung PDTS Đông tụ sữa Cắt quệt sữa. Tách nước. ép bánh. Bổ sung muối. Ngâm chín. Bao gói. Bảo quản. Thu nhận và xử lý sữa. Sữa dùng để sản xuất phomat không những phải là sữa tốt, đạt các tiêu chuẩn hoá lý, sinh học như để sản xuất các loại sản phẩm sữa lên men khác mà còn có các yêu cầu đặc biệt khác đó là khả năng đông tụ bởi các renin và khả năng tách nước của phomat. Những đặc tính này phụ thuộc vào từng giống bò, thậm chí từng con riêng biệt. Yếu tố về thời tiết các mùa trong năm cũng ảnh hưởng đến tính chất này của sữa. Công việc xử lý sữa trước khi làm phomat bao gồm: + Làm sạch sữa: quá trìng này giúp loại bỏ đa số vi sinhvật có thể làm giảm chất lượng của sữa. + Thanh trùng sữa: mục đích của việc thanh trùng là hnằm tiêu diệt các vi khuẩn có thể làm ảnh hưởng đến quá trình đông tụ sữa cũng như gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng phomat sau này. Sữa được thanh trùng để làm phomat theo phương pháp Pasteur, ở nhiệt độ70-720C, trong 15-20 giây rồi ngay lập tức làm nguội đến nhiệt độ cần thiết cho quá trình động tụ sữa. Đối với sữa để sản xuất 2 loại phomat Emmenthal và Parmesan thì không được đun nóng quá 400C[18]. Thực tế cho thấy phomat làm từ sữa không thanh trùng thì sản phảm có mùi và hương thơm đặc trưng hơn, hấp dẫn hơn phomat làm từ sữa đã qua thanh trùng. Nhưng ít khi sữa nguyên liệu lại có thể là loại sữa tốt và sạch đến mức độ như vậy để có thể không bị nhiễm tạp làm hỏng sữa không theo ý muốn ở giai đoạn sau. + Làm chín sữa: sau khi thanh trùng làm nguội tới 30-32 0C ta tiến hành làm chín sữa (mục đích làm nguội đến nhiệt độ này là ở nhiệt độ này thì vi khuẩn lactic hoạt động tốt nhất) bằng cách cấy chủng vi khuẩn lactic, tuỳ theo phương pháp sản xuất của từng loại phomat mà tỉ lệ vi khuẩn cho vào là khác nhau khoảng 0,02-0,035%[16], thời gian lên men khoảng 1- 2h đến khi thấy độ axit tăng từ 16-180T đến 32-350T thì dừng với độ axit này thuận lợi cho renin hoạt động. Làm chín sữa là quá trình quan trọng ngâm chín, tạo hương sau này. Để tăng khả năng đông tụ của sữa bởi renin người ta bổ sung một lượng CaCl2 tuỳ theo trường hợp từ 0,15-4%[16,18] hay 5-20 g cho 100 kg sữa, theo Lond. Y(1990) nghiên cứu thì khi bổ sung 0,3g CaCl2 /1lit sữa thì giảm được 27% renin[21], sau khi cho al2 để ít nhất 30 phút trước khi đông tụ sữa. Có thể sử dụng một sôa phụ gia như dùng NaNO3, KNO3 với liều lượng được kiểm soát chặt chẽ nếu không sẽ ảnh hưởng đến quá trình phát triển của hệ vi sinh vât và sự chín sinh học của phomat, dùng caroten hoặc orleana để điều chỉnh màu cho thêm hấp dẫn. Trong một số trường hợp lại sử dụng đến chất tẩy màu làm nhạt màu tự nhiên của phomat từ vàng thành trắng làm nổi hạt mốc xanh. Sản xuất phomat. + Đông tụ sữa: là quá trình quan trọng trong sản xuất phomat, người ta thường sử dụng renin làm tác nhân đông tụ, có thể thay thế một phẩn renin bằng các chế phẩm enzym từ thực vật, vi sinh vật.. có khả năng đông tụ sữa. Nhiệt độ tối ưu của renin là 400C[13,16] nhưng trong thực tế người ta thường tiến hành đông tụ ở 30-320C bởi có thể sử dụng một lượng enzym lớn hơn cần thiết , lượng dư này có lợi cho quá trình chín sinh học và cũng như thu được hạt phomat có độ cứng vừa phải, nhệt độ này cũng phù hợp với nhiệt độ phát triển của hỗn hợp vi khuẩn trong sữa. Lượng enzym đông tụ có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng tới kết cấu của quện sữa, ảnh hưởng tới độ tách nước, tới chất lượng của phomat, tới độ mất các chất béo vào trong nước sữa. Nếu lượng enzym quá lớn sẽ làm tách nước mạnh, làm giảm lượng phomat, quện sữa đặc hơn, trong nước sữa chứa nhiều chất béo hơn. Còn nếu không đủ lượng enzym làm cho quện sữa mềm làm giảm độ tách nước, xử lý quệ n sữa phức tạp hơn. Tuỳ phương pháp cho renin vào với tỉ kệ khác nhau thường từ 0,02-0.04%[6]. Trong thực tế, renin rất bị hạn chế do nguồn nguyên liệu nên người ta thường dùng phối hợp với nguồn protease khác nhau như renin bò, pepxin lợn và protease vi sinh vật. Cắt quệt sữa: sữa được đông tụ sau 40-45 phút sau đó ta tiến hành cắt quệt sữa thành nhiều miếng nhỏ, mục đích của việc cắt này là làm tăng nhanh quá trình tách nước sữa, các hạt phomat được tạo thành được đảo trộn nhẹ nhàng để ngăn chặn sự kết dính giữa các hạt. Ngoài yếu tố cơ học người ta còn dùng các yếu tố nhiệt độ để đẩy nhanh quá trình tách, tuỳ từng loại phomat nhiệt độ có thể là 38-420C hoặc 52-580C tốc độ gia nhiệt khoảng 0,3-0,60C/ phút. Tách nước, ép bánh: sau khi thu được những hạt phomat người ta đổ chúng vào khuôn có lỗ nhỏ để thoát nước khi ép, quá trình ép là quá trìng hạt phomat được kết dính lại thành một khối có hình dạng nhất định, đây cũng là quá trình điều chỉnh hàm lượng nước trong phomat. Đối với từng loại phomat thì các thông số như áp suất nén, thời gian nén, nhiệt độ, pH.. là những thông số cụ thể ví dụ như: đối với phomat cứng áp suất nén trong 24-48h loại Cheddar áp suất nén là 1,0-1,5 bar, 24 giờ, lọai phomat mềm áp suất nén là 0,3-0,4bar, 2-3 giờ. Muối phomat: để tạo vị cho phomat và để cho vi sinh vât phát triển, tác động tốt đến trạng thái, chất lượng tốt khi bảo quản thì người ta thường tiến hành muối phomat. Người ta nhận thấy rằng hoạt tính của vi khuẩn lactic mạnh hơn khi hàm lượng muối của phomat khoảng 0,5%. Muối có tác dụng tạo áp suất thẩm thấu, giữ chất lượng khi bảo quản. mặt khác, vi khuẩn tạo chất thơm rất nhạy cảm với muối còn là tác nhân tạo gas đó chính là sự tạo thành lỗ rỗng trong phomat. Thường thì có các cách muối như: muối trong hạt, muối trong nước muối, muối bằng muối khô. Muối trong hạt là bổ sung muối sau khi tháo một phần nước sữa với lượng là 20-30 cho 100kg sữa[19]. Muối bằng muối khô là rắc thẳng muối khô lên bề mặt phomat, muối sẽ được hoà tan nhờ nước chảy ra từ phomat và thấm vào phía trong phomat còn bằng nước muối là người ta dùng nước muối với nồng độ 16-23%, nhiệt độ muối 150C, thời gian muối tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng từng khối hạt phomat. Ngâm chín, bảo quản: ngâm chín ở 7-12 0C. Đây là quá trình chín sinh học xảy ra đồng thời, sự biến đổi của tất cả các thành phần, protein bị renin thuỷ phân không sâu tạo thành polypeptit, peptit các sản phẩm này thúc đẩy sự hoạt động của vi khuẩn lactic tạo thành axit amin tự do và xuất hiện các axit amin mới, chất béo tạo thành các axit béo tự do bay hơi và không bay hơi, đường lactoza tạo thành axit lactic, axit axetic, axit propionic, rượu, aldehyt tất cả các sản phẩm trên tạo cho hương vị phomat thêm hấp dẫn và là thước đo giá trị dinh dưỡng của phomat. Phần II. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Chủng vi sinh vật + Aspergilus awamori có nguồn gốc từ pháp, lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm thuộc Trường ĐHBK Hà Nội. 2.1.2. Sữa tươi. + Sữa tươi Ba Vì, trước khi sử dụng đã được thanh trùng theo phương pháp pasteur ở nhiệt độ 75-800C trong thời gian 15-30 giây rồi làm nguội ngay và bảo quan ở 4-100C sử dụng trong 48 tiếng. + Sữa gầy. 2.1.3. Chế phẩm renin, lactic. + Renin tinh khiết có nguồn gốc từ Pháp, do trung tâm chăn nuôi dê và thỏ Ba Vì cung cấp. + Các chủng vi khuẩn lactic từ chế phẩm Flora danica MSP-CHR Hansen 2.2. Thiết bị. + Máy so màu quang điện (UV-VIS) hãng Pharmacy + Máy ly tâm lạnh Bekman của Mỹ + Máy sấy hồng ngoại + Máy đo pH + Máy lắc ổn nhiệt Shelab (Mỹ) 2.3. Hoá chất Dung dịch nhuộm: Coomassie brilliant blue 0.1% (w/v), Methanol 3% (v/v), Acetic 10% (v/v). Dung dịch rửa: Methanol 30% (v/v), Acetic 10% (v/v). Đệm mẫu: 0.1 ml Bromophenol blue 10%, 0.3 ml Glycerin 100%, bổ sung nước đến 1 lít. Đệm chạy điện di protein: Tris-HCl 25mM, pH 8.4, Glycerol 0.192M, SDS 0.1% (w/v). 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp vi sinh vật. Phương pháp nuối cấy chìm: Là phương pháp nuôi mà vi sinh vật phát triển trong môI trường lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục. * Môi trường giữ giống. Môi trường giữ giống là môi trường thạch-malt. * Môi trường hoạt hoá giống bao gồm: Đường sacarose 0.5%, Cao nấm men 0.5%, Pepton 0.5%, KH2PO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.05%. Môi trường được đổ vào các bình tam giác 250ml khoảng 100ml dịch nuôi sau đó thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong vòng 20 phút. Cấy chủng từ ống nghiệm vào canh trường và nuôi lắc ở nhiệt độ 300C trong vòng 18giờ. Ta được môi trường đã hoạt hoá * Môi trường nuôi (M1) + Đường sacharose 0.5% + Cao nấm men 0.3% + Pepton 0.5% + KH2PO4 0.1% + MgSO4.7H2O 0.05% Môi trường được đổ vào các bình tam giác 250ml khoảng 100ml dịch nuôi sau đó đem đi thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong vòng 20 phút. Cấy chủng vi sinh vật từ canh trường đã hoạt hoá bằng cách: lấy 5 ml dịnh từ canh trường đã hoạt hoá cho vào môI trường nuôi chế phẩm. Tiến hành nuôI lắc ở 200 vòng/ phút trong vòng 60 giờ ở nhiệt độ 300C ta thu được dịch có chứa enzym protease đông tụ sữa. 2.4.2. Phương pháp hoá sinh 2.4.2.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm của nguyên liệu, mẫu nghiên cứu và chế phẩm emzym được xác định bằng phương pháp sấy mẫu tới trọng lượng không đổi. Độ ẩm được xác đinh bằng công thức: X: Độ ẩm. % a: trọng lượng mẫu nghiên cứu và hôp trước khi sấy, g b: trọng lượng mẫu nghiên cứu trước khi sấy ở 100-1050C đến trọng lượng không đổi, g c: Trọng lượng hộp để sấy, g 2.4.2.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến. Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng thuỷ phân cơ chất bởi enzym trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn Tyrozin để định lượng sản phẩmtương ứng do enzim xúc tác tạo nên. Hoạt độ protease dặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải protein tới peptit và axit amin của enzym. Được biểu thị bằng số đơn vị trên 1g chế phẩm. Hoạt độ riêng của chế phẩm được biểu thị số đơn vị protease trên 1mg của chế phẩm. Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzym trong thời gian 1 phút ở 300C chuyển hoá được một lượng cơ chất tương đương với 1 milimol Tyrozin thành dạng không bị kết tủa bởi axit tricloaxetic (TCA). Hoạt độ protease của dịch emzym được tính bằng đv/g được xác định theo công thức: trong đó D: mật độ quang đo được của mẫu. 4: tỷ lệ giữa thểt tích của hỗn hợp phản ứng và thể tích của dung dịch enzym sau khi bổ sung TCA. TE: Đương lượng tyoyn xác định theo đường chuẩn( đương lượng tyroin là mật độ quang mà 1 mmol tyroin có trong 1ml dụng dịch chuẩn khi phản ứng với thuốc thử Folin có thể được). 10: thời gian thuỷ phân cơ chất, phút. M: lượng chế phẩm enzym( lấy để thuỷ phân cơ chất), tính bằng mg có trong ml dung dich enzym. 1000: hệ số chuyển đổi sang gam chế phẩm. 2.4.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ đông tụ sữa Hoạt độ đông tụ sữa là lượng enzym cần thiết để làm đông tụ dung dịch sữa đã loại mỡ, có nồng độ xác định trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 400C. Để so sánh hoạt độ đông tụ sữa của các chế phẩm khác nhau người ta so sánh thời gian (t) để đông tụ sữa trong cùng một điều kiện phản ứng. Lượng enzym tính bằng miligam, thời gian tính bằng phút hoặc giây. 1(U/ phản ứng) là lượng emzym cần thiết trong 2,5 ml dịch enzym để đông tụ 10 ml sữa gầy hoàn nguyên trong 10 phút ở nhiệt độ 400C. Cách tiến hành: cho 2,5 ml dung dịch enzym vào ống nghiệm thêm 10ml dung dich sữa (12g sữa gầy trong 100 ml dung dịch CaCl2 0,01M) ở 400C. Tất cả các dung dịch phải đạt đến 40 0C trước khi trộn lẫn với nhau. 2.4.2.4. Xác định độ axit của sữa và phomat Độ axit của sữa là số ml dung dịch NaOH hay KOH có nồng độ 0,1M cần thiết để trung hoà lượng axit có trong 100 ml sữa với chất chỉ thị là phenoltalein 1% được tính theo đô Therrner(0T). Ngoài việc xác tính đọ axit theo 0T người ta còn tính lượng axit theo một lượng axit hữu cơ như tính theo số mg axit lactic có trong 100 ml sữa. Độ axit( theo axit lactic) =0T. 0,009( % axit lactic) Đối với phomat cách xác định độ chua như sau: Cho vào bình tam giác có dung tích 250ml 5g phomat đã nghiền với 40 ml nước cất ở nhiệt độ 450C, nhỏ 3-4 giọt chỉ thị phenoltalein 1% và chuẩn bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền không mất trong 30 giây Độ axit được tính: X(0T) = 20.VNaOH Với 20 là hệ số chuyển về 100ml sữa. 2.4.2.5. Phân tách protein bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamit-SDS (SDS-PAGE). Nguyên l