Đồ án Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản

cally linked to the consumption of coleslaw containing cabbage that had been treated with L.liên quan đến 41 trường hợp mắc bệnh và 18 ca tử vong, chủ yếu ở phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh. Từ đó một số trường hợp nhiễm Listeria từ thực phẩm đã được báo cáo, và L. monocytogenes is now widely recognized as an important hazard in the food industry. [ 16 ]monocytogenes đã được công nhận rộng rãi như là một mối nguy hiểm quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm. Listeria được xem là vấn đề nghiêm trọng nhiễm vào các sản phẩm thịt và thịt gia cầm vào những năm 1980. Những năm 1990, Bộ Nông nghiệp Mĩ cho biết có một trận dịch bệnh này từ bánh mì kẹp xúc xích nóng và có thể là các cửa hàng bán thịt ngon dẫn đến ít nhất 101 người bị bệnh khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai nhi bị sinh non. Năm 1999, loài L. monocytogenes đặc biệt cực độc đã tiến triển báo động các viên chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề. Mặc dù “quy định tạm thời” đối với các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn phát hành năm 2003 giúp kiểm soát sự bùng phát vi khuẩn, nhưng rõ ràng đã không thể loại bỏ được bệnh hoàn toàn. Theo Trung tâm y tế dự phòng CDC, ước tính 2.500 người bị bệnh listeriosis nặng mỗi năm, trong số đó có 500 người tử vong. Người có nguy cơ cao có thể mắc bệnh này sau khi ăn thực phẩm thậm chí chỉ nhiễm vài con vi khuẩn. Năm 2006, trong một nỗ lực bảo vệ cộng đồng, Cơ quan lương thực và dược phẩm FDA phê chuẩn tán thành việc sử dụng thuốc xịt khử trùng giúp giảm nhiễm khuẩn các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn. Thuốc phun bao gồm 1 hỗn hợp gồm 6 loại virus vô hại diệt khuẩn L. monocytogenes. 2.2.2. Phân loại Theo George M. Garrity, Julia A.Bell và Timothy G.Lilburn, phân loại học của Listeria spp. Trong giới vi sinh vật như sau: Giới: Bacteria Ngành: Fitmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Listeriaceae Giống: Listeria Lúc đầu Listeria chỉ được biết đến với một hay hai loài chủ yếu là Listeria monocytogenes, về sau thì xác định được 6 loài gồm: Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria seeligeri Listeria ivanovii Listeria grayi Listeria welshimeri Các loài có tính tương đồng về di truyền nên giúp giải thích được kiểu hình tương tự nhau giữ các loài. Khả năng tan huyết là đặc tính nhằm phân biệt giữ các loài. Đến nay chỉ có loài L. monocytogenes cho thấy là tác nhân chính gây bệnh cho người và động vật, khi đó L. invanovii chi gây bệnh cho động vật đặc biệt là thú. 2.2.3. Đặc điểm Hình 2.6: L. monocytogenes. 2.2.3.1. Đặc điểm chung L. monocytogenes là trực khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ từ 1 - 45oC, không tạo bào tử nhưng có chuyển động điển hình khi được cấy ở nhiệt độ 20 - 25oC và có thể phát triển trong tế bào . Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5mm, chiều dài khoảng 1-2mm. Phản ứng catalase dương tính. Sau khi nhuộm Gram ta thấy những tế bào hình que riêng lẻ hoặc những tế bào nối với nhau thành một chuỗi tế bào. Vi khuẩn này có thể tồn tại ở pH rộng từ 4,3 - 9,6. Hình 2.7: Tế bào vi khuẩn L. monocytogenes Gram(+) Hình 2.8: Lông roi của L. monocytogenes Vi khuẩn L. monocytogenes sống rất dai và khác với đa số vi khuẩn khác L. monocytogenes có thể tăng trưởng chậm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C.Hiện nay các nhà khoa học cho rằng con đường nhiễm L. monocytogenes phổ biến nhất là qua thực phẩm. Trong số bảy loại Listeria được biết đến, chỉ có L. monocytogenes mới là tác 11 chủng huyết thanh (sérotypes) trong đó 90% trường hợp bệnh Listeriosis ở người đều do các serotype 1a, 1b và 4b gây nên. Trong ba nhóm vừa kể trên, thì 4b là serotype độc hại nhất. 2.2.3.2. Đặc điểm sinh hóa Tùy từng loài hay từng kiểu huyết thanh mà Listeria. spp có các biểu hiện sinh hóa khác nhau. Đặc điểm sinh hóa chung của Listeria. spp được thể hiện như sau. Bảng 2.4: Đặc điểm sinh hóa của một số loài Listeria Loài Acid sản sinh từ b-Hemolysis1 Manitol Rhamnose Xylose Độc tính2 L. monocytogenes + - + - + L. ivanovii3 + - - + + L. innocua - - V4 - - L. welshimeri - - V4 + - L. seeligeri + - - + - L. grayi5 - + V4 - - 1 Thử nghiệm trên môi trường thạch máu cừu. 2 Thử nghiệm trên chuột. 3 Những chủng lên men ribose được phân thành L. ivanovii subsp. Invanovii và không lên men như L. ivanovii. Lomdiniesis. V4: biotypes thay đổi 5 Bao gồm hai loài phụ L. grayi. Murrayi biến đổi nitrate và L. gayi subsp. Grayi không biến đổi nitrate 2.2.4. Cấu trúc 2.2.4.1. Cấu trúc tế bào Bao vỏ Lông Tiên mao Nhân Vỏ tế bào Màng tế bào Ribosomes Hình 2.9: Cấu tạo tế bào L. monocytogenes. 2.2..4.2. Cấu trúc phân tử Kích thước bộ gen của loài L. monocytogenes khoảng 3,0 Mb (Ganbank/EMBL_accession number AL591824). Những gen qui định tính gây độc nằm trên bộ nhiễm sắc thể của chủng Listeria sản xuất protein cho phép tạo yếu tố điều hòa giúp chúng thích nghi với điều kiện môi trường khác nhau và điều kiện đặc tính gây độc. Bảng 2.5: Bộ gen của loài L. monocytogenes L. monocytogenes Kích thước nhiễm sắc thể (kb) 2.944.528 Tỉ lệ G+C (%) 39 Tỉ lệ G+C của gen mã hóa protein 38 Tổng số lượng gen mã hóa protein 2.853 Mặt khác, các loài như L.innocua thiếu gen qui định cho một protein tạo độc tố nên không thể mã hóa cho protein đóng vai trò quan trọng cho việc xâm nhập vào tế bào chủ. Điều này có thể giải thích được khả năng gây bệnh giữa các loài khác nhau thuộc cùng giống Listeria. Cả L. monocytogenes và L. ivanovii đều có một tổ hợp gen qui định độc tính với chiều dài 8,2 Kb trên bộ gen, được điều hòa bởi yếu tố PrfA (Positive regulatory factor A).Tổ hợp gen này nằm giữ gen prs và gen ldh trên nhiễm sắc thể. 2.2.5. Yếu tố độc lực PrfA Z hly plcA prfA mpl actA plcB Y X Hình 2.10: Vị trí tổ hợp gen qui định độc tính trong L. monocytogenes. Phần lớn tổ hợp gen này tham gia trong việc xâm nhập vào tế bào chủ và tiến hành chu kỳ xâm nhiễm bên trong các tế bào của tác nhân gây bệnh. Tổ hợp này mã hóa bao gồm 6 gen plcB, hly, mpl, actA, plcB, prfA và có 3 khung đọc mở X, Y, Z. Trong đó gen prfA rất cần thiết cho tính độc của loài L. monocytogenes, có vai trò như yếu tố điều hòa chính nhằm ổn định hoạt động của tổ hợp gen này. Bên cạnh đó, gen hly mã hóa protein tạo sản phẩm listeriolysin O (LLO), plcA mã hóa tạo phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), plcB mã hóa tạo phosphatidulcholine-spefic phospholipase C (PC-PLC). Tương tự như LLO, các phospholipase C này dung giải tế bào chủ bằng cách tạo một lổ nhỏ trên tế bào và phá vở lipid màng tế bào. Vi khuẩn sinh ra một protease mpl phụ thuộc Zn+ có hoạt tính như một vài ngoại độc tố. Ngoài ra có một vài gen c qui định tính gây độc nhưng tổ hợp gen nói trên bao gồm inlA, inlB, inlC mã hóa lần lượt cho internalin A, B và C. Các gen này đóng vai trò quan trọng nhằm nội bộ hóa tế bào chủ do tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên tất cả các gen trong tổ hợp gen gây độc và tất cả các gen nằm ngoài tổ hợp gen này vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào hoạt động của yếu tố prfA. Bảng 2.6: Chức năng của các gen trong hoạt động tạo độc tố của L. monocytogenes. Gen Chức năng prfA Positive regulotory factor A Hoạt hóa cho quá trình lây lan tronh tế bào chủ của vi khuẩn. plcA Phosphatidylinositol-specific phopholipase C Dung giải màng không bào của thể thực bào. plcB Phosphatidylcholine-specific phospholipase C Dung giải màng không bào của thể thực bào. hlyA Listeriolysin O Giải phóng vi khuẩn ra khỏi không bào. Mpl Zinc-dependent metalloprotease Tham gia trong quá trình hoạt động của plcB. actA Actin-polymerizing protein Giúp lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác. inlA Internalin A Nội bộ hóa tế bào chủ. inlB Internalin B Nội bộ hóa tế bào chủ. 2.2.5.1. Listeriolysin O LLO là một yếu tố độc lực chính được sinh ra bởi L. monocytogenes giúp cho L. monocytogenes thoát khỏi các không bào thực bào đầu tiên. Nó là một protein có trọng lượng phân tử 58,5 kDa được tạo thành bởi một chuỗi đơn polypeptide gồm 529 aa. Trình tự đầu N có đặc điểm của trình tự dấu hiệu điển hình ở vi khuẩn Gram dương: phần đầu có tính ái nước và mang điện tích dương được theo sau bởi 20 đầu kỵ nước. Trình tự này mã hóa trực tiếp cho protein và được phân cắt sau vị trí lysine 25. Kết quả là LLO được bắt đầu từ amino acid 26, là một phân tử protein dài 504 aa và có trọng lượng phân tử 55,8 kDa. LLO thuộc về họ độc tố gắn cholesterol được hoạt bởi nhóm thiol được tạo ra bởi hầu hết các vi khuẩn Gram dương. Một số độc tố thuộc họ này như Streptolysin O từ Streptococcus pyogenes, pneumolysin O từ Streptococcus pneumoniae, perfringolysin O từ Clostridium perfringens, cereolysin O từ Bacillus cereus, alveolysin O từ Bacillus alvei … Hoạt tính ly giải của các độc tố này được tăng cường bởi các tác nhân ức chế và bị kìm hãm bởi sự oxy hóa và biểu hiện khi có cholesterol hoặc kháng thể kháng streptolysin O. Cytolysin được hoạt hóa bởi thiol có một cystein đơn ở vùng đầu C làm cho chúng dễ bị bất hoạt bởi sự oxy hóa mặc dù cystein này có thể được thay thế bằng alanine mà không làm mất chức năng ly giải. Chúng tạo nên những lỗ không liên tục với đường kính bên trong lên đến 30 nm trên những màng chứa cholesterol. Cơ chế hoạt động của chúng dựa vào sự tương tác với cholesterol với chức năng không chỉ là vị trí gắn kết mà còn như một tác nhân làm thay đổi hoạt động của enzyme dẫn đến quá trình oligomer hóa của khoảng 20 – 80 toxin monomer thành cấu trúc vòng hoặc giống vòng cung. LLO cho thấy sự tương tác kỳ lạ với cholesterol trong dung dịch như sau: protein bị bất hoạt bởi cholesterol nhưng, thay vì giống các độc tố khác, duy trì khả năng gắn trên màng. 1 HU (hemolytic unit) LLO có thể bất hoạt 0,2 ng cholesterol trong khi các sterol khác như epicholesterol và dehydroepiandrosterone là những chất ức chế yếu. Chất oxy hóa HgCl2 và p – chloromercuribenzoate bất hoạt độc tố ở nồng độ 1 mM. Sự ức chế bởi các hợp chất thủy ngân bị đảo ngược bởi dithiothreitol 2 mM hoặc cystein, iodacetic acid 2 mM, iodacetamide 2 mM, 1 mM tosyllysine chloromethyl ketone và 1 mM tosylphenylalanine chloromethyl ketone không ức chế. Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan đến pH của môi trường: nó hoạt động cao nhất ở pH 5,5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7,0. Trái lại, các độc tố được hoạt hóa bằng thiol có phổ pH hoạt động rộng hơn như pH 6.0 đối với pneumolysin, pH 6.5 đối với perfringolysin O và alveolysin, pH 7.0 đối với streptolysin O. Sự phát hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của L. monocytogenes. Sau quá trình thực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hóa LLO. Chính độc tố này sẽ xúc tiến quá trình ly giải không bào và tế bào vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất trong khi đó, môi trường pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO. Sự hư hại của màng tế bào chủ cũng bị ngăn cản bởi sự phân hủy nhanh của LLO trong tế bào chất do sự nhận biết của một trình tự giống PEST. Một trình tự amino acid giàu Proline (P), glutamic acid (E), serine (S) và threonine (T) được gọi là PEST và protein đích để phân hủy. Và đầu N của LLO nằm ở vùng 19 aa (từ 32 – 50) chứng minh đặc điểm này. Một điều thú vị khi loại bỏ motif giống PEST này không chỉ nâng cao độc lực của LLO mà còn sửa đổi các yếu tố độc lực của vi khuẩn. L. monocytogenes bị đột biến, thiếu trình tự PEST LLO, được chứng minh là việc thoát ra khỏi không bào thực bào theo một con đường rất khó khăn. Điều này chứng tỏ rằng vùng này cũng rất quan trọng cho quá trình phá hủy màng. 2.2.5.2. Vai trò của các yếu tố độc lực trong quá trình xâm nhiễm của L. monocytogenes L. monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào của cơ thể vật chủ thông qua cơ chế thực bào. Nếu L. monocytogenes vẫn còn sống sau giai đoạn đầu xâm nhiễm này, nó được cơ thể vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt được gọi là internalin, đáng chú ý là internalin A (InlA), internalin B (InlB). InlA là protenin 88 kDa được mả hóa bởi gen inlA tương tác với E – Carherin tạo điều kiện cho L. monocytogenes đi vào tế bào biểu mô, InlB là protein 65 kDa được mã hóa bởi gen inlB, nhận diện Clq – R (hoặc Met) cho phép L. monocytogenes xâm nhập vào trong nhiều loại tế bào của vật chủ như tế bào gan, nguyên sợi bào và các tế bào biểu mô. Tốc độ xâm nhiễm của tế bào vật chủ nhanh cho phép L. monocytogenes tránh khỏi sự kiểm soát của chức năng miễn dịch. Sau khi xâm nhiễm được vào tế bào vật chủ, L. monocytogenes chủ yếu nằm ở màng đơn của không bào, phân giải màng đơn sơ cấp của không bào, nhờ vào sự kết hợp của hai phân tử gây độc: listeriolysin O (LLO) là protein 58 kDa được mả hóa bởi hly, tạo ra các lỗ trên màng tế bào, hoạt giải độc tính lưu huỳnh là yếu tố cần thiết cho tính độc của Lm. Phosphatidylinositol-phpspholipase C (PI-PLC) là protein 33 kDa được mã hóa bởi gen plcA, kết hợp với Phosphatidylcholine-phospholipase C (PC-PLC, protein 29 kDa được mã hóa bởi plcB), giúp LLO phân giải màng đơn sơ cấp của không bào. Sau khi phân giải màng đơn sơ cấp của không bào, L. monocytogenes được phóng thích vào cytosol, tại đây chúng phát triển và nhân lên, ở nội bào chúng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác, sự di chuyển này đòi hỏi phải có protein bề mặt khác như ActA (protein 67kDa được mã hóa bởi gen ActA), đồng sao chép với PC – PLC và điều chỉnh sự thành lập của protein cấu thành lông đuôi bị phân cự nhằm đưa L. monocytogenes vào màng tế bào chất Tại đây, L. monocytogenes trở thành dạng vỏ bao trong cấu trúc giống như chân giả dạng sợi, xâm nhiễm vào các tế bào cận kề và phân giải màng đôi của không bào thứ cấp. khi màng đôi bị phân giải là dấu hiệu bắt đầu 1 chu trình xâm nhiễm mới, nó phụ thuộc vào hoạt động của PC-PLC và Mpl (là metallprotease 60 kDa được mã hóa bởi gen mpl). 2.2.6. Con đường xâm nhiễm Hình 2.11: Quá trình xâm nhiễm và tác hại của L. monocytogenes. Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể qua đường tiêu hóa, L. monocytogenes tiếp tục di chuyển qua dạ dày rồi đi vào các mô ở ruột non của vật chủ, bao gồm các tế bào biểu mô và các đại thực bào của mảng Peyer. Trong suốt quá trình di chuyển chúng sẽ không gây ra những thương tổn mô học nếu liều lượng nhiễm không đủ lớn. Trong dịch lympho hoặc máu thì L. monocytogenes di chuyển rất nhanh đến hạch bạch huyết, lá lách và gan rồi nhanh chóng đi sâu vào không bào, hầu hết vi khuẩn xâm nhập và phá hủy khong bào nhờ kết hợp với pH thấp, các enzyme thủy phân và oxi hóa trong không bào. Listeriolysin dung giải Lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác đại thực bào hình 2.12: Quá trình xâm nhiễm và lây lan của Listeria monocytogenes Từ không bào chúng sẽ đi vào tế bào chất và nhân lên trong vòng 30 phút sau khi xâm nhiễm, từ 40-60 phút ở trong tế bào gan và đại thực bào. Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hoàn thanh sau 5-7 ngày. Tuy nhiên nếu không đạt được đáp ứng miễn dịch ở tế bào bạch huyết CD8+ và gamma, interferon gián tiếp hoạt hóa đại thực bào. Nếu tế bào của vật chủ không tạo ra đủ đáp ứng miễn dịch thì Listeria monocytogenes sẻ di chuyển đến các vị trí khác trong cơ thể như não và nhau thai. Sự phát tán ở nội bào và gian bào của L. monocytogenes Hình 2.13: Cách xâm nhiễm nội bào của L. monocytogenes. a)L. monocytogenes xâm nhập vào tế bào. b)Vi khuẩn phát triển nội tại không bào. c,d). Màng của không bào bi phá vở bởi hai phospholipases: PicA, PicB và hình thành các độc tố listeriolysin O. Vi khuẩn di chuyển vào trong tế bào chất, nơi chúng nhân lên và bắt đầu tổng hợp actin. e)Đuôi Actin cho phép vi khuẩn đi vào một tế bào lân cận bằng cách hình thành chổ nhô ra trên màng huyết tương. f)Vi khuân phá vở tế bào thoát ra ngoài và kéo dài chu kỳ. Tóm lại sự xâm nhiễm của L. monocytogenes được mô tả theo các bước nhất định sau: Sự xâm nhiễm và tiếp thu mầm bệnh Thoát khỏi thể thực bào của không bào Nhân lên trong tế bào chất của vật chủ Định hướng di chuyển trong tế bào chất 2.2.7. Khả năng gây bệnh 2.2.7.1. Trên người Bệnh do Listeria gây ra là một bệnh hiếm gặp ở người nhưng vì các triệu chứng rất nguy hiểm và gây tỷ lệ chết khá cao do đó căn bệnh này đã nhận được sự quan tâm của các cấp chính quyền địa phương về vấn đề sức khỏe. Phần lớn người bị nhiễm đều có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ. Thông thường đối với người khỏe mạnh, sự tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm là nguyên nhân gây ra viêm dạ dày – ruột, triệu chứng sốt. Trái lại, L. monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch kém. LM hướng sự kích thích vào hệ thần kinh trung tâm và có các dấu hiệu lâm sàng là viêm màng não và hình thành nên áp – xe. Sự nhiễm trùng là một dạng bệnh khác do listeria gây ra tác động đến các bệnh nhân mang bệnh về miễn dịch. Ngoài các bệnh nói chung này, vi khuẩn này cũng gây nhiễm định vị như viêm màng kết, nhiễm trên da, bệnh của hạch bạch huyết. Ở phụ nữ mang thai, khi người mẹ bị nhiễm Listeria thì không có triệu chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống như bị cảm cúm trong khi kết quả ở bào thai và thai nhi bị ảnh hưởng nghiêm trọng hơn bao gồm sẩy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. 2.2.7.2. Trên động vật Trong số các động vật, bệnh do listeria tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với thời gian ủ bệnh từ 2 đến 6 tuần. Động vật bị nhiễm Listeria khi ăn phải thức ăn nhiễm, qua đường hô hấp hoặc do tiếp xúc trực tiếp. Sự phát bệnh xảy ra kèm theo sự suy giảm miễn dịch đối với tác nhân gây bệnh do các yếu tố gây stress (mang thai, sự đông đúc, sự vận chuyển, điều kiện môi trường kém). Động vật bị nhiễm bệnh do listeria thường sốt, biếng ăn, suy nhược và mất phương hướng Sự biểu hiện bệnh có thể hình thành nên các dấu hiệu lâm sàng như sau: Thần kinh (bệnh quay vòng) như bệnh viêm não và viêm màng não. Dấu hiệu lâm sàng bao gồm sự đần độn, đầu quay về một bên, đi vòng vòng, húc đầu vào vật rắn. Những sự biểu hiện này do sự hình thành các vi áp – xe trong tủy xương, xương sống và trong tiểu não. Nội tạng như nhiễm trùng máu. Ban đầu nó thường xảy ra ở chim, bào thai hoặc động vật khoảng 1 tháng tuổi. Sự nhiễm này xảy ra gây hoại tử gan với các vùng tổn thương màu trắng xám và có thể lan đến lá lách. Sự sinh sản như sẩy thai, đẻ non. Điều này rất hay xảy ra ở động vật ăn cỏ. Vi khuẩn xâm nhiễm vào tử cung thông qua mạch máu và sự sẩy thai thường xảy ra từ 5 - 12 ngày sau khi vi khuẩn tăng trưởng trong nhau. Sự nhiễm ở vú như chứng viêm vú. Triệu chứng này thường do sự nhiễm cận lâm sàng mà không có bằng chứng sưng vú. Sữa do sinh vật tiết ra làm tăng rủi ro nhiễm trong sản phẩm sữa. Viêm mống mắt là triệu chứng thường ít gặp. 2.2.8. Phân bố Listeria monocytogenes phân bố rộng rãi trong môi trường đất, cát, nước. Có thể truyền bệnh qua đường miệng và phân, và đã phân lập được từ thịt nấu chưa chín, gia cầm, sữa tươi chưa thanh trùng, phomat và hải sản. L. monocytogenes là vi khuẩn có mặt khắp nơi trong rau củ có thể nhiễm khuẩn từ đất hoặc từ phân bón. Súc vật ở nông trại có thể nhiễm khuẩn mà không có triệu chứng gì và thực phẩm từ động vật như thịt, thịt gia cầm và các sản phẩm sữa có thể bị nhiễm khuẩn. Trong khi vi khuẩn có thể tìm thấy ở các loại thực phẩm tươi sống như thịt chưa nấu chín, rau củ quả, sữa chưa tiệt trùng và thực phẩm từ sữa tươi, thực phẩm đã chế biến sẵn như rau quả cắt lắt có thể nhiễm khuẩn sau quy trình sản xuất. Các thực phẩm khác ở nhà có thể nhiễm khuẩn L. monocytogenes khi thực phẩm thương mại làm nhiễm khuẩn này trên bề mặt bếp và thực phẩm khác hoặc thông qua nước ép quả đóng hộp. Vi khuẩn này rất bền. Chúng kháng nhiệt (mặc dầu nhiệt độ không cao), muối, nitrite và acid, sống sót ở điều kiện lạnh đông và thậm chí có thể sinh sôi phát triển chậm chạp trong tủ lạnh. Do đó, con người có nguy cơ nhiễm khuẩn cực kỳ cao lưu ý các loại thực phẩm chưa nấu chín kỹ trước khi ăn có thể có rất nhiều L. monocytogenes. Theo Sở giám sát và an toàn thực phẩm thuộc Bộ nông nghiệp, những trường hợp bệnh listeriosis ở Mĩ đều liên quan đến thực phẩm xúc xích nhỏ xông khói, thịt hộp tươi ngon, patê lạnh, xúc xích Ý, pho phát mềm của Pháp, pho mát mềm kiểu Mêhicô, tôm, bơ, rau quả tươi và sữa chưa tiệt trùng. Trận dịch bệnh bùng phát có thể liên quan đến sò hến tôm cua, cá tươi, thủy sản xông khói, lưỡi heo, kem, xà lách gạo, xà lách cải bắp và patê thịt. Vi khuẩn có thể nhiễm vào chúng ta qua các vật dụng nhà bếp như dao, thớt bẩn hoặc từ tay đã bị nhiễm trùng. Nấu nướng thực phẩm và hấp khử trùng sữa đều diệt được vi khuẩn. Tuy nhiên, đối với một số thức ăn làm sẵn (ready to eat products) như thịt gà, cua và thịt nguội như hot dog, deli meats, luncheon meats, v.v…chúng cũng có thể bị nhiễm vào sau giai đoạn nấu nướng và trước khi được cho vào bao. Chúng ta cũng có thể bị nhiễm khuẩn L. monocytogenes nếu có sự tiếp xúc trực tiếp với thú có mang vi khuẩn này. 2.2.9. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam hiện nay Tỉ lệ nhiễm bệnh ở thanh niên khỏe mạnh là rất thấp, khoảng 0.7 trường hợp trên 100.000 người. Tuy nhiên, khả năng nhiễm ở trẻ em thường cao hơn khoảng trên 10 trường hợp trên 100.000 người và ở người già tỉ lệ này là 1.4 trường hợp trên 100.000 người. Phụ nữ mang thai dễ dàng bị nhiễm bệnh gấp 17 lần so với thanh niên khỏe mạnh 2.2.9.1. Tình hình thế giới Nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Thụy Sĩ, nhất là ở Pháp, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này trong thực phẩm như sữa tươi và các sản phẩm chế biến từ sữa, thịt cá tươi sống và các sản phẩm của thịt cá, rau xanh ... là rất cao. Nhiễm trùng do Listeria monocytogenes cũng xảy ra trải rác ở Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Phi cũng như trong khu vực Châu Á Tại Mỹ có khoảng 76 triệu trường hợp bị ngộ độc thực phẩm hàng năm, trong đó tỷ lệ nhiễm do Listeria chỉ khoảng 2.5000 trường hợp nhưng có 500 trường hợp tử vong. Mặc dù con số các ca nhiễm bệnh thấp nhưng tỷ lệ chết cao chiếm từ 20 – 30 % các ca nhiễm bất chấp có sử dụng thuốc kháng vi sinh, cho thấy mức độ nguy hiểm của sự có mặt các loài Listeria trong thực phẩm.tỷ lệ tử vong cao hơn đáng kể so với các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm khác như Escherichia coli O157:H7 (E.coli), Campylobacter.spp và Samonella. Bảng 2.7: So sánh tỷ lệ tử vong gây ra giữa L. monocytogenes và các tác nhân gây bệnh khác Tác nhân gây bệnh Tỷ lệ tử vong (%) Tỷ lệ nhập viên (%) Tổng số ca nhiễm bệnh Campylobacter.spp <1 17.3 gần 1.9 triệu E. coli O157:H7 <1 3.0 gần 62.500 triệu Samonella <1 25.6 gần 1.3 triệu L . monocytogenes 20.0 3.8 2.500 Liateria được xem là vấn đề ghiêm trọng nhiễm vào các sản phẩm thịt và thịt gia cầm vào những năm 1980. vào những năm 1990, Bộ Nông Nghiệp Mỹ cho biết có một trận dịch bệnh nguyên nhân từ bánh mỳ kẹp xúc xích nóng dẫn đến ít nhất 101 người bệnh, khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai nhi sinh non. Năm 1999, loài L. monocytogenes cực độc đã tiến triển báo động các viên chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm giải quyết vấn đề. Người có nguy cơ cao có thể mắc bệnh này sau khi ăn thực phẩm thậm chí nhiễm vài vi khuẩn Bệnh dịch Listeriosis năm 1992 ở Pháp xuất phát từ lưỡi heo, lan truyền qua dao xắt thịt, làm 66 người chết, 22 phụ nữ sẩy thai. Bệnh dịch năm 1993 nhẹ hơn, tìm thấy vi khuẩn trong những hộp chả heo và chỉ có vài ca tử vong. Gần đây nhất, 12/10/2002, dịch Listeriosis tại cac ban Tây Bắc nước Mỹ có 23 người chết và 120 người ngộ độc phải vào bệnh viện, nguuyên nhân là thịt gà của hãng Pilgrim’s Pride nhiễm Listeria monocytogenes. Thịt gà không chỉ gây ngộ độc Listeria mà còn nhiều vi khuẩn khác. Nước dãi gà và ruột gà có sẵn những vi khuẩn gây bệnh như Salmonella, Shigella, Campylobacter. Những khuẩn này không gây bệnh ở gà mà gây bệnh ở người (đau bụng, tiêu chảy, thương hàn). Bảng 2.8: Tỷ lệ phát hiện sự có mặt của L. monocytogenes trong thịt và thịt gia súc của các nghiên cứu ở một số quốc gia trên thế giới Quốc gia Tỷ lệ phát hiện % Số lượng mẫu nhiễm Tây Ban Nha 64 28 Norway 61 71 Anh 60 61 Mỹ 23 6 Belgium và Pháp 10 – 15 48 Ireland 59 91 2.2.9.2. Tình hình Việt Nam Năm 1996, trong số 215 mẫu thực phẩm các loại gồm sữa chua, hải sản đông lạnh, thịt tươi sống, rau xanh và thực phẩm chế biến dùng ngay, Viện Pasteur TP HCM đã phân lập được 2 dòng L . monocytogenes, chiếm tỷ lệ 0.93%. Đến năm 1999, vin65 Vệ Sinh Y Tế Công Cộng cũng đã phân lập được 2 dòng L .monocytogenes từ 20 mẫu thực phẩm, chiếm tỷ lệ 10%. Năm 2006, theo tổng kết của Phòng Kiểm Nghiệm Hóa Lý – Vi Sinh thực phẩm viện Pastuer TPHCM, các mẫu hải sản đông lạnh có tỷ lệ nhiễm L. monocytogenes 23/138 mẫu, chiếm 23.9%. Như vậy tỷ lệ xuất hiện của chủng vi khuẩn này cũng có khuynh hướng gia tăng theo thời gian ở nước ta và thường được tìm thấy ở các mẫu thực phẩm đông lạnh. Theo Quyết định số 2670 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn cấp ngày 29/8/2008 về việc “Công bố danh mục các chỉ tiêu chỉ định kiểm tra đối với l6 hàng thủy sản”, chỉ tiêu L. monocytogenes quy định giới hạn phát hiện là 0cfu/25g đối với hầu hết các loại sản phẩm thủy sản. Bảng 2.9: Giới hạn phát hiện cho phép đối với L. monocytogenes trong sản phẩm thũy hải sản. Loại sản phẩm Giới hạn cho phép đối với L. monocytogenes Th