Đồ án Nhân nhanh PLB mãn thiên hồng (doritaenopsis sp.) trong một số hệ thống nuôi cấy khác nhau

n sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu. Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo được, sự khác nhau về tăng sinh chồi, sự khác nhau về khả năng phát sinh phôi. Chọn cơ quan: hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in – vitro. Ví dụ: Nuôi cấy thân mầm cây để tạo protoplast có khả năng phát sinh phôi. Nuôi cấy lát cắt mỏng ở mô lá cây thuốc lá có thể tái sinh các cơ quan khác nhau như chồi và rễ phụ thuộc vào lớp mỏng tế bào ở bộ phận nào của cây được nuôi cấy và các hocmon được sử dụng. Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào. Tùy vào đối tượng cây thì có tuổi sinh lý khác nhau. Ví dụ: Khả năng tái sinh cao ở lá cây trưởng thành so với lá cây còn non. Ngược lại mẫu non cắt cành của Hedora helix dễ ra mẫu hơn so với mẫu trưởng thành và nuôi cấy lá non phát sinh cơ quan tốt hơn so với nuôi cấy lá trưởng thành. Sức sống của mẫu: Mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in – vitro . Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất ra cây sạch bệnh. Ảnh hưởng của môi trường: Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nhưng các loài khác nhau có thể đòi hỏi môi trường nuôi cấy khác nhau. Samartin (1989) đã sử dụng 6 công thức muối đa lượng khác nhau đối với cây trà Camelia japonica và thấy rằng môi trường MS cho tốc độ sinh trưởng nhanh nhất khi thu mẫu từ cây non. Môi trường MS đã chứng tỏ không thích hợp cho mẫu lấy từ cây già, trong khi môi trường muối loãng hơn (Heller, 1953) lại cho kết quả khá. Tính độc của môi trường MS cũng được quan sát ở một số loài (Sommer, 1982; Vieitez, 1983) do môi trường này chứa hàm lượng muối đa lượng cao, có thể gây độc cho tế bào in – vitro, nhất là protoplast. Phương pháp đơn giản nhất là giảm nồng độ muối khoáng xuống 1/3 hoặc 1/2 (Grosser, 1994). Môi trường cơ bản MS có hàm lượng NH4NO3, KNO3 giảm một nửa, bổ sung thêm glutamine 1,550 mg/l, KCl 750 mg/l rất tốt cho nuôi cấy mô sẹo phôi hoá và giảm tích luỹ tinh bột ở một số giống Citrus (Grosser và Gmitter, 1990). Trong số các muối đa lượng, muối nitơ có ý nghĩa quyết định đến sự tái sinh chồi. Welander (1985) cho biết khi nồng độ NH4NO3 và KNO3 trong MS giảm đi 1/2, đỉnh sinh trưởng của dâu tây phát triển khá hơn, rễ tái sinh mạnh hơn. Giảm muối khoáng trong một số trường hợp có tác dụng tốt đối với sự ra rễ ở một số loài (Murashige, 1977; Hasegawa, 1980; Drew, 1987) như trường hợp chồi hoa hồng ra rễ tốt hơn khi nồng độ nitơ tổng số giảm (Hyndman cs., 1982). Nguồn carbon cũng rất quan trọng đối với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Nồng độ đường 1- 3 % được sử dụng phổ biến. Nồng độ đường sucrose cao hơn 3% tỏ ra độc ở một số trường hợp (Rublue và Kartha, 1985). Chong và Pua (1985) đã sử dụng sucrose, glucose, fructose and sorbitol nồng độ từ 1-7% trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng giống táo Ottawa 3 và thấy rằng nồng độ sucrose 3% là tối ưu cho sinh trưởng, 100% chồi tạo rễ và chất lượng cây con khoẻ mạnh. Trạng thái vật lý của môi trường cũng có ý nghĩa quan trọng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Đa số các trường hợp người ta sử dụng môi trường agar nhưng khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng một số loài, môi trường lỏng tỏ ra tốt hơn (Mellor và Stace Smith, 1969). Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thấp trong môi trường có thể làm giảm các biến dị tế bào soma (Grosser và Gmitter, 1990). Tế bào mô sẹo phôi hoá ở cây có múi có thể nuôi cấy và bảo quản lâu dài trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng. Tính bất định về mặt di truyền: Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp này cũng tạo ra những quần thể biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn. Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng rất ít những biến dị có lợi được báo cáo. Tần số biến bị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. nuôi cấy mô sẹo và tế bào đơn có sự biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất, và biến dị này không di truyền. Nguyên nhân gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ chủ yếu là do những biến đổi trong vật chất di truyền như đứt gãy, chuyển đoạn ADN hoặc đảo đoạn. Những nguyên nhân gây biến dị tế bào soma là: + Kiểu di truyền + Thể bội : cây đa bội thể tần số biến dị cao hơn cây nhị bội + Số lần cấy truyền: số lần cấy truyền càng cao thì tần số biến dị càng lớn + Loại mô. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy: Hiện tượng hóa mẫu hóa nâu hay bị đen là chết mẫu hay làm giảm sự tăng trưởng. Nguyên nhân của hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều tannin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mô sẹo Một số phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: Tách các phần tử phenol ra khỏi môi trường Bổ sung các chất khử redox (oxidation-redution) phenol vào môi trường Ngăn chặn sự hoạt động của enzyme phenolase Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng giống môi trường rắn Mẫu chuẩn bị có vết cắt nhỏ, để ngoài vài giờ trước khi cấy, hay nơi cấy trong môi trường không có ánh sáng. Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thụ chất kìm hãm phenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loại phong lan, nồng độ thường 0,1-0,3%. Tuy nhiên than hoạt tính sẽ làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thụ chất kích thích sinh trưởng và các chất khác. Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide, hấp thụ phenol qua vòng hydrogen, ngăn chặn sự hóa nâu, hiệu quả phụ thuộc vào các loài cây trồng khác nhau. Hiện tượng thủy tinh thể: Nhân giống vô tính in – vitro chỉ có hiệu quả khi cây con được nhân giống chuyển ra đồng ruộng có tỉ lệ sống cao. Có hiện tượng trong nuôi cấy mô là xuất hiện cây in – vitro thủy tinh thể. Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con đễ dàng bị mất nước và tỉ lệ sống thấp. Đây là một dạng bệnh sinh lý. Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường thạch có hàm lượng thạch thấp, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây. Đặc điểm cây thủy tinh thể: Nhận thấy là có sự khác nhau về hình thành lớp sáp ở cây nuôi cấy mô và cây ngoài tự nhiên. Lượng sáp chứa trong cây ngoài vườn ươm cao hơn hẳn cây in vitro. Tế bào có chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước gắn trên nó, gia tăng độ mất nước và tốc độ hô hấp của tế bào trong nhân vô tính và đưa đến sự chết của mô trong nuôi cấy. Ngăn chặn quá trình thủy tinh thể + Giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường + Giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đổi sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi. + Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất. ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng. + Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy +Chuyển cây in – vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến cây bị thủy tinh thể. + Giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt + Tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy. Hệ thống nuôi cấy Bioreactor: Giới thiệu: Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Đầu thế kỉ 21, hàng loạt các công ty về vi nhân giống cây trồng thương mại với quy mô lớn lần lượt ra đời. Tuy nhiên, số công ty thu được lợi nhuận cao vẫn không nhiều. Nguyên nhân chủ yếu là do chi phí cao cho người lao động để thực hiện các công đoạn như cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy. Chính vì vậy, cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp giảm thời gian và công lao động. Một trong những hệ thống tự động được nhiều công ty vi nhân giống thực vật trên thế giới sử dụng là hệ thống nuôi cấy bioreactor do Takayama đề ra vào năm 1981. Bioreator đã từng được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp vi sinh, sản xuất các hoạt chất sinh học có nguồn gốc từ động vật và thực vật. Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được báo cáo đầu tiên vào năm 1981 với nghiên cứu của tác giả Takayama trên đối tượng là cây Begonia (Takayama và Misawa, 1981). Về sau, hệ thống này còn được ứng dụng có hiệu quả trên nhiều loài thực vật khác (Takayama, 1991). Bioreactor được mô tả là một bình phản ứng có những tính chất sau: nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, nuôi cấy trong môi trường lỏng, số lượng mẫu cấy nhiều, có khả năng tự động hóa, vi tính hóa thông qua vi điều khiển các yếu tố môi trường như mức khuấy trộn, thoáng khí, nhiệt độ, oxy hòa tan, pH, v.v… (Paek và cộng sự, 2005). Cấu trúc và phân loại bioreactor: Cấu trúc bioreactor: Có nhiều kiểu bioreactor khác nhau, chúng được phân biệt theo: phương pháp khuấy, kiểu bầu chứa, kiểu sục khí, chế độ chiếu sáng (Takayama, 1991). Xét về cấu tạo chung, bioreator nuôi cấy mô thực vật cũng giống bioreactor nuôi cấy tế bào động vật hay vi sinh vật. Vào khoảng cuối năm 1950, các nhà khoa học đã thiết kế nhiều kiểu bồn lên men (fermenter). Các kiểu đơn giản được thiết kế vào năm 1059, bao gồm bình 20 lít. Bình này có một nút cao su lớn và 4 ống nhỏ (ống cho khí vào, ống khí ra, ống môi trường vào, ống lấy mẫu ra). Hiện nay, tuy kích thước bioreactor nuôi cấy tế bào thực vật không ngừng tăng lên nhưng cấu trúc của chúng vẫn tương tự các bồn lên men vi sinh vật. Bioreactor là một mô hình nuôi cấy phù hợp nhất cho nuôi cấy mô thực vật trong việc sản xuất nhanh một số lượng lớn cây con trong một mẻ nuôi cấy. Các loại bioreactor được sử dụng phổ biến là loại có thể tích 2 – 20 lít vì chúng có một số thuận lợi sau: dễ dàng vận hành, có thể vô ,trùng dễ dàng, giá thành thấp, kích thước nhỏ, tạo ra từ 100 – 10000 cây con trong một mẻ. Phân loại bioreactor: Có nhiều loại bioreactor được thiết kế nhằm nhiều mục đích khác nhau đối với từng loại cây trồng, kiểu nuôi cấy hay giai đoạn nuôi cấy. Phân loại bioreactor theo ứng dụng: Gồm 3 loại: Bioreactor sử dụng để sản xuất sinh khối; Bireactor sử dụng để sản xuất enzyme, hoạt chất thứ cấp; Bioreactor sử dụng để chuyển hóa các hợp chất ngoại sinh theo các con đường chuyển hóa sinh học. Phân loại theo chức năng hoạt động: Gồm 2 loại: Loại nuôi cấy ngập chìm cục bộ hay tạm thời. Loại nuôi cấy ngập chìm toàn bộ hay liên tục: được dùng trong vi nhân giống có mật độ mẫu cấy cao khi mà sự ngập chìm không ảnh hưởng lớn đến sự phát triển bình thường của mẫu cấy. Chẳng hạn khi nuôi cấy protocorm – like body, mô sẹo tạo phôi, phôi soma, cụm mô phân sinh và các chồi mắt. Nuôi cấy ngập chìm hoàn toàn cũng thích hợp cho nuôi cấy các thân hành và thân củ (Takayama, 1991). Phân loại theo sự di chuyển của mẫu nuôi cấy: Gồm 3 loại: Mẫu nổi ngay sát bề mặt môi trường. Mẫu lơ lửng trong môi trường. Mẫu chìm ở đáy bioreactor. Trong 3 loại trên, kiểu có mẫu nổi và chìm cho thấy sự phát triển rất tốt. Còn trong trường hợp mẫu lơ lửng, di chuyển trong môi trường dễ bị tổn thương hư hại nghiêm trọng. Nguyên nhân là do khi di chuyển chúng đã va chạm vào nhau, cái này đè lên cái kia dẫn đến stress (tổn thương) tế bào, kết quả là tăng trưởng bị suy giảm. Phân loại theo hình thức khuấy: Gồm 3 loại: Bioreator khuấy máy. Bioreator khuấy hơi nước. Bioreator không khuấy. Ngoài ra, có một loại bioreator cung cấp oxy mà không tạo bọt khí bằng cách dùng các ống silicone. Chúng được xem là rất phù hợp với nuôi cấy huyền phù tế bào phát sinh phôi. Và gần đây, có một loại bioreator acoustoc mist rất hiệu quả trong việc tăng sinh khối của rễ bất định (hairy root) (Ziv, 1999). Quy trình nhân sinh khối thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy lắc và bioreactor: Qui trình nhân sinh khối thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy lắc và bằng bioreator gồm các bước sau: Bước I: Thiết lập môi trường nuôi cấy vô trùng. Bước II: Gồm 3 bước nhỏ (a) cảm ứng việc tạo nhiều chồi trên một diện tích bề mặt mẫu mô cấy (nuôi cấy trên môi trường agar); (b) tăng cường sự phát triển của các chồi bằng nuôi cấy lắc; (c) tăng cường sự phát triển của các chồi bằng kỹ thuật sử dụng tăng cường sự phát triển các chồi bằng kỹ thuật sử dụng bioreator. Bước III: Giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con trước khi đem ra vườn ươm. Trong đó, bước I là bước cơ bản cho mọi quá trình nuôi cấy nhằm hạn chế việc nhiễm khuẩn cho mẫu. Bước II là bước cảm ứng tạo nhiều chồi bên và chồi bất định trên mẫu mô nuôi cấy bằng cách cho thêm cytokinin vào môi trường. Kích thước của các chồi tạo ra quá nhỏ nên không thể chuyển sang bước II b (nuôi cấy lắc) hoặc bước II c (nuôi cấy bằng bioreactor). Mục đích của bước II b và II c là giúp cho các chồi phát triển, tăng trưởng nhanh hơn để tạo thành cây con (plantlets). Bước III là bước giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con, đây là bước cần thiết, tuy nhiên không phải áp dụng cho tất cả các loài; ở một số loài có thể bỏ qua bước này. Quá trình nhân giống cho hệ thống nuôi cấy bioreator như sau: thiết lập điều kiện nuôi cấy vô trùng cho mẫu mô hay đỉnh sinh trưởng, sau đó chuyển vào môi trường có nồng độ cytokinin cao để kích thích hình thành cụm chồi. Mẫu mô mang cụm chồi sau đó được nhân nhanh bằng cách cấy chuyền vào môi trường tương tự. Các cụm chồi này được sử dụng như những hạt nuôi cấy trong bioreactor nhỏ để tạo ra cây con. Điều kiện nuôi cấy tối ưu được khảo sát trong những bước này. Một khi môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đã được thiết lập thì các cụm chồi này sẽ được tăng sinh để tiến hành nuôi cấy trong các bioreator lớn. Cây con tạo ra sau đó được chuyển ra đất. Sự phát triển thực vật trong bioreator: Quá trình phát sinh phôi soma: Việc sử dụng môi trường lỏng nuôi cấy tế bào soma để tạo phôi đã được đề cập từ những năm 1958 trên cây Cà Rốt do Steward cộng sự tiến hành. Tính toàn thế của tế bào thực vật, khả năng tạo phôi mới và sự biểu hiện kiểu hình là cơ sở để đưa ra giả thiết về sự phân lập và nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng, đặc biệt giúp kích thích tạo phôi đơn bội. Quá trình phát sinh phôi soma được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin (thường sử dụng 2,4 – D) và nước dừa ban đầu. Sau đó dùng nhiều cytokinin, myo – inositol và giảm lượng nitrogen. Khi các cụm tiền phôi được tạo thành thì phải hạ thấp hoặc lấy bớt nồng độ auxin trong môi trường. Sau đó, trình tự giống như quá trình tạo phôi giao tử (đơn bội) sẽ diễn ra (Ammirato, 1985). Phôi soma thường nhỏ và thích hợp cho các quy trình nhân sinh khối, chúng có thể được phân tách, đưa vào và khuấy trộn bằng một hệ thống tự động, sau đó có thể được cất trữ hay tạo ra cây con trực tiếp với sự hỗ trợ của hệ thống máy móc (Sakamoto và cộng sự, 1995). Quá trình phát sinh cơ quan: Hiện nay, hầu hết các thực vật được nhân giống thương mại trên môi trường bán rắn đều thông qua con đường phát sinh cơ quan. Đây là một quy trình tốn nhiều thời gian và tiền bạc. Vì vậy nếu chuyển sang tự động hóa bằng máy sẽ giảm bớt được các thao tác bằng tay và giảm được giá thành lao động. Một giải pháp đã được sử dụng để tự động hóa là dùng môi trường nuôi cấy lỏng trong bioreactor. Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cấy lỏng: Quá trình nhân nhanh trong bioreactor đều sử dụng môi trường lỏng thay cho môi trường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối. Môi trường nuôi cấy lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủy tinh thể (hyperhydricity hay vitrification) (Debergh và cộng sự, 1992). Cho đến nay, định nghĩa về hiện tượng thủy tinh thể vẫn chưa được rõ ràng. Nói chung, đây là một hiện tượng liên quan đến sự rối loạn trong hình thái và sinh lý của thực vật trong quá trình tăng trưởng in – vitro, kết quả làm mất đi khả năng phát triển bình thường, và sau đó kéo theo hàng loạt các vấn đề trong suốt quá trình thích nghi của thực vật khi ra vườn ươm. Biểu hiện của thực vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng là thường yếu ớt, xuất hiện các tinh thể nước giống như thủy tinh, mọng nước ớ lá và ở chồi, hệ rễ phát triển kém. Lá là cơ quan chịu ảnh hưởng nhiều nhất trong môi trường lỏng. Chúng phát triển một loại nhu mô vô tổ chức, loại này được tạo ra từ các lớp nhu mô xốp có không gian liên bào rộng, một loại mô mạch không định hình, một lớp biểu bì bất thường. Lớp mô biểu bì của các lá thừa nước thường phát triển không tốt và quá trình đóng mở khí khẩu không còn ổn định như trước. Hậu quả của hiện tượng thủy tinh thể là lá ít phát triển trong điều kiện in – vitro cũng như ex – vitro và có thể cả cây cũng vậy, thường yếu và chết. Do vậy, khi hiện tượng thủy tinh thể xảy ra thì chức năng quang hợp cũng như hô hấp của lá có thể không còn thực hiện được tốt như trước, nên cây sau khi chuyển ra đất thường ít khả năng sống sót và kém phát triển. Sau khi nhân giống in – vitro, các cây xuất hiện hiện tượng bất thường về kiểu hình và cấu trúc giải phẫu, ở giai đoạn ex – vitro thường có hiện tượng bất thường về kiểu hình. Các biểu hiện sai hỏng, chẳng hạn như thừa nước, lá và chồi kém phát triển, phôi bất thường, rối loạn quá trình phát sinh phôi đều là kết quả của sự gián đoạn hay mất tín hiệu trong trình tự của quá trình tái tạo cơ quan ở thực vật. Các vấn đề nêu trên biểu hiện nghiêm trọng hơn đối với nuôi cấy lỏng và cần phải có những nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ cũng như có thể kiểm soát được sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy bioreactor – một mô hình lớn của nuôi cấy lỏng. Có nhiều nghiên cứu đã được báo cáo trong việc khắc phục hiện tượng thủy tinh thể và cũng thu được nhiều kết quả. Chẳng hạn như giảm độ ẩm tương đối bằng cách tạo sự trao đổi khí bên trong và bên ngoài của bình nuôi cấy (Buddendorf và Woltering, 1995), tăng nồng độ agar trong môi trường nuôi cấy (Debergh và Harbaoui, 1981), sử dụng các chất hấp thụ ethylen như bột than hoạt tính (Mensuali và cộng sự, 1993), KMnO4 (Dimasi và cộng sự, 1993), hoặc alginate STS (Sarkar và cộng sự, 2002), sử dụng các loại bình nuôi cấy lớn hơn (Zobayed và cộng sự, 2001) hay bổ sung các chất chống thủy tinh thể (antihyperhydricity) có bán trên thị trường, tên thương mại là EM2 (A0807, Siagma – Aldrich, Pool, Dorset, UK), M – gel (Migros, Immensee, Switzerland), iota – type carrageenan (C1006, batch no 29225, Duchefa Biochemie BV, Haarlem, the Netherlands) (Adam và cộng sự, 2002). Thuận lợi và khó khăn trong nuôi cấy bằng bioreactor: Thuận lợi Nuôi cấy được các mẫu ngập chìm và phân bố theo không gian ba chiều nên tiết kiệm được không gian; tăng cường được sự thoáng khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh; khi nuôi cấy ngập chìm và được di chuyển tự do trong môi trường, hiệu ứng ưu thế ngọn bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau. Theo Takayama và Akira (1994), một số thuận lợi chính của bioreactor trong vi nhân giống thực vật đó là: sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối thực vật với môi trường; không có sự hạn chế về trao đổi khí, có thể điều khiển sinh khối thực vật tùy theo thể tích môi trường, tiết kiệm được thời gian và nhân công trong việc nuôi cấy chuyền; dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối; dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy; tốc độ sinh trưởng và phát triển tăng hơn nếu được tăng cường không khí; mẫu cấy tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng nhanh; nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả tạo được nhiều chồi hơn. Khó khăn: Mặc dù phương pháp nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã tỏ ra vượt trội hơn so với các phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn nhưng bên cạnh đó nó vẫn còn có những hạn chế nhất định. Chẳng hạn như theo Ziv (1999); tùy vào từng đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều giống khác nhau; thường gặp hiện tượng bất thường của phôi, hiện tượng stress tế bào. Những hiện tượng trên làm giảm hiệu suất nhân giống và sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Một vấn đề lớn nữa thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là việc nhiễm vi sinh vật. Nấm, vi khuẩn, nấm mốc và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên nhân chủ yếu gây mất nguồn mẫu thực vật trong các phòng thí nghiệm thương mại. Vì là môi trường lỏng nên sự lây nhiễm vi sinh vật sẽ xảy ra rất nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng hơn so với các loại môi trường khác (rắn, bán rắn). Sự lây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí nghiệm để hạn chế nguy cơ bị nhiễm thì người ta thường tạo một không gian vô trùng trong phòng cấy bằng dòng không khí tạo áp lực dương (Ziv, 1999). Hình 1.6: Hai dạng bioreactor phổ biến Bioreactor sục khí b) Bioreactor có cánh khuấy. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 04 đến tháng 06 năm 2010 tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Vật liệu: Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu này là PLB Mãn Thiên Hồng Doritaenopsis sp. Được cung cấp từ Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật trực thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Nguồn mẫu được sử dụng cho các thí nghiệm trong nghiên cứu là những PLB độc lập, nguyên vẹn. Loại bỏ các PLB đã phát triển thành chồi. Trang thiết bị và dụng cụ: Thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng Autoclave, máy đo pH, cân phân tích, máy lạnh, kệ đặt bình, đèn huỳnh quang, máy phun khí,... Dụng cụ: dao cấy, đèn cồn, đĩa petri, bình erlen, bình thủy tinh 500ml, pipet,... Hệ thống bireactor tự tạo. Môi trường nuôi cấy: Môi trường sử dụng là môi trường muối khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) dạng dung dịch, với khoáng đa lượng (NH4NO3, KNO3, Mg2SO4, CaCl2, KH2PO4) được giảm một nữa. Các muối trung, vi lượng (MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KI, CoCl2.6H2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, Na2EDTA, FeSO4.7H2O) và các vitamin ( Myo – inositol, Nicotinic acid, Pyridoxine HCl, Thiamine HCl, Glycine) vẫn giữ nguyên hàm lượng ban đầu. Các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường gồm có BA và NAA. Ngoài ra còn bổ sung nước dừa non với hàm lượng 20% (v/v). Môi trường được hấp khử trùng trong nồi Autoclave ở điều kiện : nhiệt đô 121oC, áp suất 1 atm và trong thời gian 15 phút. Điều kiện nuôi cấy trong phòng nuôi cấy in – vitro: Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ ngày. Cường độ chiếu sáng: 2500 lux. Nhiệt độ : 25 ± 2oC. Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB Lan Hồ Điệp Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.). Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm nhằm xác định được môi trường tối ưu nhất nhằm nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng. Nhằm đạt được hệ số nhân giống cao nhất. Tiến hành thí nghiệm: Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm: MS ½ được bổ sung hai chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA theo bảng sau: Bảng 2.1: Môi trường MS ½ bổ sung BA và NAA ảnh hưởng lên sự nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng. Môi trường BA (mg/l) NAA (mg/l) MS 1 MS 1.1 4 0.3 MS 1.2 4 0.5 MS 2 MS 2.1 6 0.3 MS 2.2 6 0.5 MS 3 MS 3.1 8 0.3 MS 3.2 8 0.5 MS 4 MS 4.1 10 0.3 MS 4.2 10 0.5 Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 10 lần. 10 PLB riêng rẽ được cấy vào bình thủy tinh chứa 50 ml môi trường vô trùng được bổ sung BA và NAA theo bảng 2.1. Sau 6 tuần nuôi cấy, xem xét quá trình nhân PLB và thu số liệu. Sau đó đánh giá, xử lý số liệu để xác định môi trường nhân PLB tối ưu nhất. Môi trường được xác định là tối ưu nhất sẽ được sử dụng cho thí nghiệm tiếp sau. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng PLB hình thành và tổng trọng lượng của PLB sau 6 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm 2: So sánh khả năng nhân PLB Mãn Thiên Hồng trong 3 hệ thống khác nhau: rắn, lỏng tĩnh, lỏng lắc. Mục đích nghiên cứu: Thí nghiệm này nhằm xác định được hệ thống nuôi cấy tốt nhất cho sự nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng. Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 5 lần. Cấy 10 PLB vào trong 50 ml môi trường vô trùng. Đối với hệ thống rắn, môi trường được chứa trong bình thủy tinh. Đối với hệ thống lỏng tĩnh và lỏng lắc, môi trường được chứa trong bình erlen 250 ml. Sau 6 tuần nuôi cấy, xem xét quá trình nhân PLB và thu số liệu. Sau đó đánh giá, xử lý số liệu để xác định hệ thống nhân nhanh PLB tối ưu nhất. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng PLB hình thành và tổng trọng lượng của PLB sau 6 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm 3: Bước đầu thử nghiệm khả năng nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng bằng hệ thống Bioreactor tự tạo. Mục đích nghiên cứu: Thí nghiệm nhằm ứng dụng hệ thống nhân giống mới trong điều kiện nuôi cấy lỏng có sục khí. Tiến hành thí nghiệm: Bioreactor tự tạo được hấp vô trùng bằng nồi hấp autoclave. Sau đó cho vào bình 500 ml môi trường vô trùng. Môi trường được dùng là tối ưu nhất trong thí nghiệm một. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng PLB hình thành và tổng trọng lượng của PLB sau 6 tuần nuôi cấy. Phân tích thống kê: Số liệu thu nhân được từ các nghiệm thức đư