Đồ án Phân lập Bacillus subtilis TH2 từ Natto, tạo chế phẩm lên men Natto và thử nghiệm sản xuất Natto từ đậu tương

vi khuẩn Natto trong đường ruột có thể gây ức chế đối với các vi khuẩn Samonella [26]. 2.5. Cải thiện khả năng tiêu hóa và ngăn chặn sự rối loạn trong ruột Trong điều kiện thuận lợi vi khuẩn Natto có thể tăng sinh gấp đôi sau 30 phút và tạo nhiều enzym có tác dụng trợ giúp cho sự tiêu hóa của đường ruột. Điều này giúp các thành phần dinh dưỡng trong đậu tương vốn khó được tiêu thụ ở người có thể được hấp thụ dễ dàng khi ta ăn Natto. Những enzym này bao gồm: Proteaza chuyển hoá protein thành axit amin; amylaza chuyển hóa cacbonhydrate phức tạp thành các đường glucoza; lipaza cắt các chất béo bão hoà thành glyxerin và axit béo; xenlulaza phân cắt xenluloza thành cacbonhydrate đơn giản hơn; các enzym khác như ureaza, peroxidaza, catalaza và pectinaza. Hầu hêt các vi khuẩn có lợi cho tiêu hoá thì bi giết chết trong dạ dày do axit trước khi vào ruột, nhưng vi khuẩn Natto thì có thể sống sót, phát triển và trợ giúp cho quá trình tiêu hoá [26]. 2.6. Ngăn chặn sự lão hoá và béo phì Lecithin đóng vai như là chất hoạt động bề mặt. Nó được tìm thấy với số lượng lớn trong các sản phẩm làm đẹp. Nó làm cân bằng nước và chất béo trong tế bào da và trên bề mặt da. Người ta cho rằng phụ nữ Nhật có làn da nhẵn, mịn hơn phụ nữ Châu Âu và Châu Phi do họ sử dụng nhiều sản phẩm đậu tương mà các thực phẩm này lại chứa nhiều lecithin. Đậu tương chứa 18% chất béo, trong đó 85% là chất béo chưa bão hoà bao gồm axit linol và axit linolin. Hai axit này có tác dụng tương tự như lecithin, do đó người ta cho rằng đậu tương ngăn chặn sự già hoá của mạch máu và kéo dài tuổi thọ của chúng. Lecithin cũng ngăn chặn áp huyết cao gây ra do bệnh xơ cứng động mạch và sự trì trệ gây ra do giản chất béo trong cơ thể. Lecithin còn có tác dụng mạnh mẽ trong việc chuyển thành dạng sữa các cholesterol dư thừa trong máu và giúp cơ thể loại những cục máu đông khỏi cơ thể. Natto giàu vitamin đặc biệt là vitamin E, một chất chống oxy hóa và tăng cường tuần hoàn máu giúp ngăn chặn những tác hại từ bên ngoài và giữ cho làn da trẻ trung [26]. 2.7. Giúp phát triển trí não Kẽm là thành phần chủ chốt trong số các vitamin cần thiết cho sự sống. Nguyên tố này được gọi là khoáng chất thông minh do nó là thành phần cần thiết cho sự phát triển của não bộ và hệ thần kinh. Nó đóng vai trò quan trọng trong sự tổng hợp protein và tạo collagen. Nguyên tố này cũng cần thiết trong cơ chế điều hoà đường huyết và do đó có tác dụng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi căn bệnh đái tháo đường, một căn bệnh đang ngày càng xuất hiện nhiều trên thế giới khi mà điều kiện sống ngày càng cao, gây ra nhiều tác dụng nguy hiểm và khoa học hiện nay chưa có thuốc chữa. Hàm lượng kẽm tương đối cao được tìm thấy trong não, đặc biệt ở não cá ngựa. Các nghiên cứu đã cho thấy kẽm đóng vai trò quan trọng trong sự truyền các xung thần kinh giữa các tế bào não. Sự thiếu hụt kẽm trong quá trình mang thai và quá trình tiết sữa đã được nhận thấy là có liên quan tới nhiều khác biệt bẩm sinh trong hệ thần kinh của đứa trẻ. Sự thiếu hụt kẽm gây cho trẻ sự yếu kếm trong học tập, tính lãnh cảm, tính thờ ơ và sự chậm phát triển trí tuệ. Đậu tương là loại thực phẩm có hàm lượng kẽm cao nhưng lượng kẽm này lại khó được hấp thu vào cơ thể do tác dụng của các chất ức chế enzym tripsin cũng tồn tại trong đậu tương. Thật may mắn là trong quá trình hoạt động của mình các vi khuẩn Natto đã loại bỏ gần như hoàn toàn các chất ức chế này [13,14]. 3. Đặc điểm của Natto và cách khắc phục Natto có cấu trúc ở dạng các hạt đậu tương nguyên vẹ dính với nhau bởi chất nhớt có bản chất oligosaccharit sinh ra trong quá trình thuỷ phân cơ chất của vi sinh vật. Nó có mùi amoniac, ăn có vị ngọt, bùi. Thường được ăn với cơm nóng. Hình III.3: Sản phẩm Natto thương mại Theo một cuộc điều tra, những lí do mà những người nước ngoài sống ở Nhật không thích Natto là mùi của nó. Do đó để Natto được chấp nhận bởi những người tiêu dùng đặc biệt là người mới ăn cần phải tìm cách giảm hoặc che dấu được mùi của nó. Khi nấu chín, mùi này sẽ bay đi do sự bốc hơi ở nhiệt độ cao. Một cách khác để giải quyết mùi Natto là thêm vào một lượng nhỏ dấm. Thêm dấm trước khi Natto được trộn với các gia vị khác như nước tương và hành. Dấm là một axit nên nó sẽ trung hoà amoniac, với một lượng nhỏ dấm natto sẽ không có vị chua. Những cách ăn natto để giảm bớt mùi Natto lạnh không có nhiều mùi. Ở Châu Âu người ta yêu thích món trộn sữa chua với các loại hoa quả tươi hoặc khô và đậu phộng. Khi trộn một lượng Natto nhỏ với khoảng 250 g sữa chua người ta thấy rằng độ nhầy của nó gần như biến mất hoàn toàn. Có thể chất nhầy của Natto đã bị biến tính do môi trường axit trong sữa. Khi được trộn với món ăn điểm tâm mùi của nó gần như biến mất. Người ta nhận thấy nó ăn ngon hơn lại đầy đủ dinh dưỡng hơn. Theo một công thức khác, Natto được trộn thật kỹ và sau đó thêm nước tương của Nhật và một ít hành băm nhỏ. Trộn lại và ăn với cơm nóng. Người ta còn thêm các loại pho mát để ăn ngon hơn. Nếu trộn natto với Mayonaise và một chút nước tương, cho vào trong bánh mỳ và ăn thì sẽ rất ngon. Đặc biệt khi làm một chiếc bánh sandwich, mùi và độ nhớt của nó gần như không thể nhận ra. Natto táo: Táo cắt mỏng được trộn với Natto. Nếu không phải là người Nhật thì nên trộn Mayonaise thay vì nước tương. Táo chua thì thích hợp nhất theo phương pháp này. Natto Califonia: Trộn lê tàu với Natto sau đó cho thêm nước tương. Đây là lời khuyên cho những người mà thích giữ lại độ nhớt của Natto. Chỉ có điều là sau một thời gian lê tàu sẽ bị đen nên phải ăn ngay sau khi trộn. Những cách khác như: Dùng tỏi và mù tạt như một gia vị. Tỏi đập dập và mù tạt làm giảm đáng kể mùi của Natto và nên trộn Natto trước khi ăn [26]. IV. VI KHUẨN LÊN MEN NATTO 1. Phân loại vi khuẩn Sau khi tiến hành phân lập và định tên người ta đã xác định rằng Natto là loại thực phẩm lên men tương đối thuần khiết. Vi khuẩn đóng vai trò chủ yếu trong Natto là loài Bacillus subtilis chủng natto. Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Nhóm: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: subtilis Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dương thường được tìm thấy trong đất thuộc loài Bacillus. Cũng như nhiều loài khác nó có khả năng tạo vỏ cứng để bảo vệ nội bào tử, cái mà cho phép vi khuẩn chịu được điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Khác với nhiều loài vi khuẩn đã biết, Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Nó không phải là một tác nhân gây bệnh, nhưng có thể xâm nhiễm vào thực phẩm và đôi khi gây nên sự nhiễm độc thực phẩm. Bào tử của nó có thể sống sót với nhiệt độ cao như nhiệt độ thường dùng để nấu ăn [32]. 2. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là vi khuẩn hình que đơn lẻ, ít khi xếp chuỗi. Kích thước: chiều rộng 0,7 – 0,8 mm; chiều dài 2 -3 mm. 3. Đặc điểm sinh lý Trong giống Bacillus, subtilis là loài có tính đa dạng rất lớn về mặt sinh lý. Những đặc tính của chúng bao gồm: Khả năng phát triển trong khoảng pH rộng 5,4 – 8,0; khoảng nhiệt độ lớn 9 – 550C. Các Bacillus subtilis có khả năng thuỷ phân nhanh chóng hầu hết các cơ chất có nguồn gốc động thực vật gồm xenluloza, tinh bột, pectin, protein, agar, hydrocacbon, gelatincó khả năng lên men các loại đường như glucoza, arabinoza, xyloza, manitol và có khả năng sử dụng xitrat. Ngoài ra các chủng này còn có hoạt tính bacteriocin, tạo ra các chất subtilisin; tạo axit từ các đường; nitrat hoá; phản nitrat hoá; cố định nitơ; tự dưỡng; hô hấp tuỳ tiện; là vi khuẩn ưa axit; ưa kiềm; ưa nhiệt; ưa tối; sống ký sinh; hầu hết tạo bào tử nên có khả năng sống sót cao trong môi trường, ở bất kỳ nơi nào chúng chiếm ưu thế. Môi trường thuận lợi để Bacillus subtilis phát triển tốt là môi trường LB hoặc môi trường thạch dinh dưỡng NA. 4. Ứng dụng Bacillus đã được sử dụng từ rất lâu trong lịch sử. Sự lên men đậu tương thực hiện bởi các chủng Bacillus subtilis natto tạo ra Natto đã được sử dụng nhiều ở Nhật trong hàng nghìn năm nay và nhiều chủng Bacillus được sử dụng trong lên men đậu cocoa từ nhiều thế kỉ. Các chủng Bacillus subtilis khác cũng có nhiều ứng dụng trong đời sống. Có loại có hoạt tính diệt nấm tự nhiên, và được sử dụng như là tác nhân kiểm soát sinh học. Bacillus subtilis cũng được chứng minh là có thể dễ dàng sử dụng các thao tác di truyền, do đó nó được sử dụng rộng rãi như là một vi khuẩn điển hình trong các nghiên cứu. Bacillus subtilis còn có khả năng tiết protein với hàm lượng lớn vào môi trường, lên tới 20-25g/l. Các chủng Bacillus có thể tạo ra lượng lớn enzym thuỷ phân sử dụng trong công nghiệp như amylaza và proteaza cho công nghiệp thực phẩm và công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, công nghiệp phim ảnh. Lượng enzym từ Bacillus chiếm khoảng 50% tổng số các enzym thương mại. Bên cạnh enzym, Bacillus còn được dùng để tạo ra các chất kháng sinh, các hoá chất có khả năng tăng hương vị cho thực phẩm. Bacillus subtilis còn được sử dụng trong phân bón dạng lỏng để chuyển hóa NH4+ thành axit polyglutamic để làm kho dự trữ N cho đất. Bacillus subtilis có thể phát triển trong môi trường phân bón dạng lỏng bằng cách sử dụng gluconat natri, tạo axit polyglutamic. V. CÁC SẢN PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG 1. Sản phẩm bột Natto để hoạt hóa đường ruột Bột Natto giúp cung cấp cho hệ tiêu hoá hệ vi sinh vật còn sống có nguồn gốc từ Natto. Sản phẩm này có thể dễ dàng được hấp thụ mà không gây ra mùi đặc biệt khó chịu trong suốt quá trình bảo quản. Sản phẩm này là dạng pha trộn đồng nhất được thu nhận bởi trộn 15% (trọng lượng) bột Natto trong đó có chứa vi khuẩn Natto, 50% đường lactoza để làm cơ chất cho vi khuẩn phát triển, 30% hạt cà phê nghiền mịn có kích thước 300 Mesh để làm chất tạo độ xốp và 5% vi khuẩn tạo bào tử. Sản phẩm này được đóng gói 0,5 g trong vỏ capsule cứng. Dạng sản phẩm này của Natto có tác dụng như probiotic [35]. 2. Sản phẩm Nattokinaza Enzym này là sản phẩm trao đổi chất quan trọng của Bacillus subtilis natto. Chúng đã được tách tinh chế từ Natto để thu được enzym tinh khiết và phối trộn với một số các chất khác và đóng gói dưới dạng viên nang vỏ capsule để dùng trong điều trị các bệnh về tim mạch, huyết áp. Lợi ích của loại enzym này đã được chứng minh qua một số nghiên cứu [35]. 2.1. Hiệu quả của natto trong điều trị tắc nghẽn mạch máu Bác sĩ Martin Milner thuộc trung tâm y học tự nhiên tại Portland, Oregon đã thực hiện đề tài nghiên cứu về Nattokinaza và sẽ mở rộng nghiên cứu của mình. Trong những năm nghiên cứu về bệnh liên quan tới tim mạch và phổi ông thấy rằng, “Natto và Nattokinaza là đại diện tiêu biểu nhất để ứng dụng trong phát triển các loại thuốc ngăn chặn và chữa trị các bệnh liên quan tới tim mạch”. Ông còn nói ” chúng tôi cuối cùng đã tìm ra một tác nhân tự nhiên có hiểu quả làm tan các cục máu đông với sự an toàn cao và không có hiệu ứng phụ” [36]. Nattokinaza là đối tượng cho 17 nghiên cứu cả trên người và động vật, bao gồm 2 thử nghiệm nhỏ trên người [36]. Bác sĩ Sumi và các đồng nghiệp tạo ra các cục máu đông ở chó cái và rồi đưa 4 viên nang Nattokinaza vào theo đường uống và kiểm chứng bằng 4 viên thuốc trấn an cho chó. Chiếu tia X vào mạch máu cho thấy những con chó hấp thu Nattokinaza lại có chu trình tuần hoàn máu bình thường trở lại chỉ sau 5 giờ điều trị. Trong khi đó các cục máu đông trong các con chó chỉ sử dụng thuốc trấn an cho thấy không có dấu hiệu làm tan các cục máu đông sau 18 giờ điều trị [36]. Các nhà nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm nghiên cứu Công nghệ sinh học, Công ty Dược phẩm Kobe, Nhật đã kiểm tra khả năng hoà tan cục máu nghẽn trong động mạch chính ở chuột của Nattokinaza. Các động vật được điều trị với Nattokinaza hồi phục được 60% sự tuần hoàn trở lại của dòng máu, trong khi điều trị với plasmin chỉ hồi phục được 15,8% sự tuần hoàn của dòng máu. Các nhà nghiên cứu của công ty dược phẩm JCR, Đại học bang Oklahoma kết hợp với trường Cao đẳng Y khoa Miyazaki đã kiểm tra Nattokinaza trên 12 tình nguyện viên người Nhật trong đó có 6 nam và 6 nữ ở độ tuổi 21 đến 55. Theo thử nghiệm mỗi tình nguyện viên sử dụng 200g Natto (dạng thực phẩm) trước bữa ăn sáng, và theo dõi tính tan sợi tơ huyết thông qua kiểm tra huyết tương. Kiểm tra chỉ ra rằng Natto làm tăng khả năng hoà tan cục máu: Trung bình, đo thời gian phát huy tác dụng, Nattokinaza được sử dụng vơi các tình nguyện viên vẫn duy trì được tác dụng trong vòng 2 đến 8 giờ [36]. 2.2. Lợi ích của Nattokinaza lên huyết áp Ăn Natto không chỉ hỗ trợ cho hệ tim mạch mà còn làm giảm huyết áp. Trong những năm gần đây hiệu quả này đã được tiến hành trên nhiều thử nghiệm lâm sàng. Năm 1995 các nhà nghiên cứu tại Cao đẳng Y khoa Miyazaki, và Đại học Khoa học và Nghệ thuật Kurashiki của Nhật Bản đã nghiên cứu ảnh hưởng của nattokinase tới huyết áp cả trên người và động vật [36]. Nghiên cứu trên động vật Nghiên cứu trên chuột đực cho thấy khi cung cấp 25 mg Natto, huyết áp giảm đáng kể từ 166 mmHg xuống còn 145+24 mmHg chỉ trong vòng 2 giờ, và giảm tới 144+27mmHg trong 3 giờ. Trung bình giảm 12,7 % trong 1 giờ [36]. Nghiên cứu trên người Cùng một lượng Natto như vậy được kiểm tra trên những tình nguyện viên cao huyết áp, mức độ huyết áp được đo sau khi dùng 30 g dịch chiết lạnh khô (tương ứng với 200g natto thực phẩm) theo đường uống liên tục sau 4 ngày. Kết quả cho thấy 4 trong 5 tình nguyện viên giảm huyết áp từ 173+20,5mmHg xuống 154,8 + 12,6 mmHg. Trung bình giảm được 10.9% trong 1 giờ [36]. Kết luận Natto đã đựơc sử dụng an toàn trong hơn 1000 năm qua. Nattokinaza được cho là an toàn (do có đã có thời gian dài sử dụng), nhiều lợi ích: Thuận tiện sử dụng theo đường uống, có hiệu quả lâu dài, có hiệu lực, có thể dùng trong điều trị dự phòng, đã được chứng minh là ổn định trong đường ruột và chịu được sự thay đổi của pH, nhiệt độ [36]. 3. Sản phẩm Natto Natto là sản phẩm truyền thống đã được sử dụng rộng rãi từ hàng nghìn năm nay tại Nhật và các sản phẩm truyền thống tương tự như Natto cũng được sử dụng ở các nước khác. Ngoài việc cung cấp dinh dưỡng cho người ăn nó còn cung cấp các chất có các tác dụng như một thực phẩm chức năng với những lợi ích kể trên. nhờ những tác dụng đặc biệt đó mà mặc dù Natto có mùi vị hơi khó chịu nhưng nó vẫn được ưa chuộng và ngày càng được sử dụng nhiều hơn. Tại Việt Nam, sản phẩm Nattto cũng được nhập khẩu và bày bán ở các siêu thị lớn. Lượng tiêu thụ Natto khá lớn, chủ yếu cho những người Nhật sống tại Việt Nam và một số người nước ngoài. PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Sản phẩm Natto thương mại nhập khẩu từ Nhật Bản được bán tại siêu thị Uni-mart, Hà Nội. II. HÓA CHẤT. Các hoá chất sử dụng trong đồ án gồm: Cao thịt (Merk - Đức); cao nấm men (Difco - Mỹ); agar- agar, cồn 750, 960 glucoza, đỏ fucsin, dung dịch I2, lugol, tím tinh thể (Việt Nam); peptone, NH4NO3, NH4H2SO4, KCl, KH2PO4, Na3C6H5O7.2H2O, bromtimol blue, gelatin, CaCl2.2H2O, CH3COONa, MgSO4, MnSO4, Tween 80, NaCl, K2HPO4, cồn tuyệt đối, Glyxerol (Trung Quốc). Một số hóa chất khác. NH4NO3 0,4 g MgSO4 0,2 g MnSO4 0,4 g Tween 80 1 ml Agar 14 g * Thành phần môi trường MRS (1000ml H2O) Peptone 10 g Cao thịt 8 g Cao nấm men 4 g CH3COONa 5 g K2HPO4 2 g Glucoza 20 g Thạch agar-agar 15,54 g Peptone 10,36 g Cao thịt 5,18 g * Thành phần môi trường NA (1000 ml H2O) Môi trường và các dụng cụ thí nghiệm được hấp thanh trùng ở 1100C trong thời gian 30 phút, pH môi trường 6,5-6,7. III. THIẾT BỊ Thiết bị vô trùng: tủ sấy; nồi thanh trùng HIRAYAMA HV-25/50/85/110- Nhật Bản, Thiết bị nuôi cấy và giữ giống: Tủ cấy, tủ nuôi (Nhật Bản); tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản); tủ lạnh sâu (Sanyo ultra low, Nhật Bản). Thiết bị nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào: Kính hiển vi quang học OLYMPUS, modelCHS, Nhật Bản. Các thiết bị khác: Cân điện tử SARORIUS (Nhật); máy đo pH (320 pH meter), METTLER TOLEDO, Thuỵ Sĩ; pipetman; máy đo quang Model 80 – 2088 – Anh; máy khuấy từ; lò vi sóng; máy ly tâm, máy sấy chân không, IV. CÁC KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 1. Phân lập giống vi sinh vật thuần khiết [1] Cơ sơ của phương pháp: Trên môi trường dinh dưỡng đặc, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc riêng biệt. mỗi khuẩn lạc này sẽ tiếp tục được tách ra và nuôi cấy riêng. Kết quả là thu được vi sinh vật thuần khiết từ một hỗn hợp các vi sinh vật. Vật liệu: Trong đề tài nghiên cứu của mình Bacillus subtilis TH2 được phân lập từ chế phẩm Natto thương mại nhập khẩu từ Nhật. Từ chế phẩm này áp dụng các phương pháp vi sinh vật để phân lập được vi sinh vật mong muốn Phương pháp phân lập vi khuẩn: Cho 1 g mẫu, hoặc 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất thanh trùng. Ta có độ pha loãng 10-1. Tiếp đó lấy từ trong dịch pha loãng nảy 1 ml dịch cho tiếp vào 9 ml nước cất thanh trùng ta có độ pha loãng 10-2. Cứ như thế ta có độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 Với những nồng độ đó lấy 0,1 ml canh trường cho vào đĩa pectri chứa môi trường thạch dinh dưỡng, dùng que trang dàn đều canh trường ra khắp bề mặt thạch, mỗi nồng độ trang 3 đĩa, mang nuôi ở điều kiện thích hợp 400C trong thời gian 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, các khuẩn lạc phát triển riêng rẽ, lấy que cấy móc từng khuẩn lạc cấy vào ống thạch nghiêng. Kiểm tra hình thái vi khuẩn để xác định sự đồng nhất của vi sinh vật phân lập được. Dựa vào đặc điểm hình thái học, sinh lý học để định tên vi khuẩn. 2. Phương pháp định tên vi sinh vật Khi muốn nghiên cứu bất kì một quá trình nào liên quan đến hoạt động sống của vi sinh vật ta cần phải biết vị trí phân loại của các vi sinh vật gây ra quá trình này. Để định tên vi sinh vật người ta sử dụng nhiều đặc điểm khác nhau: Đặc điểm hình thái học, về nuôi cấy, về sinh lý-sinh hoá học, các thử nghiệm huyết thanh học và thử nghiệm về tính mẫn cảm đối với thực khuẩn thể nữa. Hiện nay dựa vào cấu trúc DNA người ta cũng có thể sử dụng kít định tên vi sinh vật. Trong nghiên cứu này em sử dụng phương pháp định tên vi sinh vật dựa vào đặc điểm hình thái, khả năng trao đổi chất và lên men một số loại đường. 2.1. Nguyên tắc của phương pháp Mỗi vi sinh vật được đặc trưng bởi các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá học khác nhau. Để định tên cho vi sinh vật cần xác định xem vi sinh vật có đặc điểm hình thái như thế nào, sử dụng được các loại thức ăn ra sao và những biến đổi gì sẽ xảy ra trong môi trường khi chúng phát triển. Sự phát triển của vi sinh vật có thể tạo ra việc tích luỹ các axit hữu cơ, các sản phẩm trung hoà, các loại khí, Căn cứ vào đó có thể xác định được loại vi sinh vật mà ta đang sử dụng. 2.2. Phương pháp Các thí nghiệm được dùng để định tên vi khuẩn bao gồm: Xác định hình dạng của vi khuẩn, khả năng tạo catalaza, khả năng sử dụng tinh bột tan, khả năng phân huỷ gelatin, khả năng đồng hoá citrate, khả năng lên men các loại đường: Galatoza, glucoza, arabinoza, rafinoza, manitol, maltoza, saccaroza, lactoza, xyloza. 2.2.1. Hình dạng vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng có thành phần thích hợp ở điều kiện 370C, sau 18 – 24 giờ có thể lấy canh trường vi khuẩn để nhuộm Gram. 2.2.2. Hình thái khuẩn lạc Để quan sát hình thái khuẩn lạc, nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường NA đặc trong các đĩa pectri ở 370C. Sau 24 giờ lấy đĩa ra quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc. 2.2.3. Khả năng tạo catalaza Một vài loại vi khuẩn và đại thực khuẩn có khả năng làm biến đổi hai nguyên tử O thành peroxit và superoxit. Cả hai loại phân tử này đều độc đối với vi khuẩn. Tuy nhiên nhiều loại vi khuẩn có cơ chế bảo vệ để có thể giảm thiểu tác hại của hai chất này. Các vi khuẩn có sức đề kháng như thế nàt sử dụng hai enzym để xúc tác sự chuyển ngược lại từ peroxit và superoxit thành hai nguyên tử O và nước. Một trong các enzym là catalaza và sự có mặt của nó có thể được nhận ra bằng kĩ thuật kiểm tra đơn giản. Kĩ thuật catalaza bao gồm thêm H2O2 vào canh trường hoặc trên thạch nghiêng. Nếu vi khuẩn có phản ứng catalaza chúng sẽ chuyển hoá H2O2 và tạo ra khí O2. Sự tạo khí gây ra các bong bóng biểu thị phản ứng dương tính nghĩa là vi khuẩn đó có khả năng gây phản ứng catalaza. Phương pháp: Nhỏ một giọt huyền phù vi khuẩn lên đĩa, dùng que gạt dàn đều và nuôi trong tủ ấm. Khi thấy khuẩn lạc mọc thì nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3 % lên khuẩn lạc. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có catalaza trong tế bào [3]. 2.2.4. Khả năng lên men đường trong môi trường lỏng Môi trường lên men có thành phần như sau (trong 1000 ml nước máy): NH4H2SO4 1 g KCl 0,2 g MgSO4.H2O 0,2 g Peptone 1-2 g Đường 0,5 – 1 % Dùng NaOH điều chỉnh pH = 7; thanh trùng 1100C; 30 phút [3]. 2.2.5. Khả năng phân giải gelatin Thành phần môi trường để thử khả năng phân giải gelatin bao gồm các chất như sau (trong 1000 ml nước cất): K2HPO4 7 g KH2PO4 2 g MgSO4. 7H2O 0,1 g Citrate .2H2O 0,5 g Cao nấm men 1 g Gelatin 50 g CaCl2.2H2O 1 g Glucoza 10 g Pepton 10 g Dùng NaOH điều chỉnh pH = 7, thanh trùng1100C, 30 phút Đổ vào đĩa pectri nuôi ở điều kiện thích hợp. Sau khi vi khuẩn phát triển thử khả năng phân giải gelatin bằng (NH4)2SO4 trong 5-10 phút sau đó đổ đi, đo đường kính vòng phân giải. Nếu vi khuẩn có khả năng phân huỷ gelatin sẽ tạo vòng phân huỷ xung quanh chỗ khuẩn lạc phát triển [3]. 2.2.6. Khả năng sử dụng tinh bột tan Cấy vi khuẩn trên các môi trường đặc đã bổ sung 1-3 % tinh bột tan. Sau vài ngày nuôi cấy ở điều kiện thích hợp lấy ra và thử bằng dung dịch lugol. Nếu vi khuẩn có khả năng phân huỷ tinh bột thì chúng sẽ tạo thành một vòng vô màu xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển (các phần khác có màu xanh tím). Thành phần môi trường (trong 1000ml nước máy): NaCl 10,32 g Peptone 5,18 g Cao thịt 5,18 g Agar 15,5 g Tinh bột tan 10-30 g pH = 6,5 – 6,7; thanh trùng 1100C; 30 phút [3]. 2.2.7. Khả năng đồng hoá xitrate Khả năng sử dụng xitrate là đặc trưng của các loài Bacillus không gây bệnh. Vì thế việc kỉêm tra khả năng đồng hoá xitrate là cần thiết để xác định chủng phân lập được là không gây bệnh. Thành phần môi trường (1000ml nước cất): NaCl 5 g Agar 20 g Bromtimol blue (5% trong cồn) 20 ml NH4H2PO4 1 g MgSO4.7H2O 0,2 g K2HPO4 1 g Na3C6H5O7.2H2O 23 g pH= 6,7; thanh trùng 1100C; 30 phút. Vi khuẩn có khả năng sử dụng xitrate khi phát triển sẽ tạo các muối cacbonat làm tăng pH của môi trường làm cho màu của chỉ thị chuyển từ màu xanh lục sang xanh lam [3]. 3. Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Một trong các đặc điểm của vi sinh vật là sự phụ thuộc một cách đặc biệt vào các điều kiện của môi trường xung quanh. Sự phản ứng của vi sinh vật với các điều kiện môi trường mạnh hơn với các vi sinh vật khác là do chúng có kích thước rất nhỏ bé làm cho vi sinh vật tiếp xúc chặt chẽ với môi trường. Các nhân tố môi trường ngoài rất đa dạng. Trong đó quan trọng nhất phải kể đến thành phần môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển. Chỉ một sự biến đổỉ nhỏ trong thành phần dinh dưỡng cũng có thể làm vi khuẩn phát triển mạnh mẽ hoặc bị diệt vong. Các yếu tố hoá lý cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi sinh vật như pH, nhiệt độ, áp suất, nồng độ oxy, Những vi sinh vật chỉ phát triển trong môi trường và điều kiện ngoại cảnh giới hạn xác định. Bất kỳ biến đổi của một nhân tố nào đó trong phạm vi nhất định cũng lảm ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và hoạt động trao đổi chất của chúng. trong phạm vi nghiên cứu của mình em chỉ xác định một số yếu tố ảnh hưởng sau: 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy sự phát triển của vi sinh vật Hoạt động sống của vi khuẩn có thể coi là kết quả của các phản ứng hoá học. vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào. Và mỗi loài vi khuẩn có nhiệt độ phát triển tối thích khác nhau. xác định nhiệt độ tại đó vi khuẩn tăng trưởng nhanh nhất và nhiều nhất là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu trong việc nuôi vi khuẩn thu sinh khối. Trong nghiên cứu này nhiệt độ thích hợp của vi khuẩn được xác định bằng cách nuôi vi khuẩn trong môi trường NA lỏng và đo OD sau khoảng thời gian 6h/lần. Nhiệt độ phát triển thích hợp là nhiệt độ tại cho OD max và sau thời gian ngắn nhất. 3.2 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng đến hoạt động sống của vi sinh vật Sự thay đổi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật. Sự thay đổi này được xác định bằng cách đo OD ở 600 nm. Trong nghiên cứu này tôi tiến hành thay đổi 2 yếu tố trong môi trường dinh dưỡng là NaCl và glucoza để xác định điều kiện phát triển thích hợp của Bacillus subtilis Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang của canh trường vi khuẩn. 3.2.1. Ảnh hưởng của NaCl đến sự phát triển của vi sinh vật Nuôi cấy vi khuẩn TH2 trong môi trường NA lỏng có bổ sung NaCl với các nồng độ lần lượt là 0; 0,5; 1; 3; 6; 10% ở điều kiện 400C và đo OD (600 nm) 6h/lần. Lượng canh trường bổ sung vào môi trường là 10%. 3.2.2. Ảnh hưởng của glucoza đến sự phát triển của vi sinh vật Sau khi tìm được nồng độ NaCl thích hợp cho sự phát triển của TH2, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của glucoza tới sự phát triển của TH2 bằng cách bổ sung 10% canh trường vi khuẩn vào môi trường NA lỏng có bổ sung lần lượt glucoza với nồng độ là 0, 2, 4,6, 8, 10%. ở mỗi nồng độ tiến hành nuôi cấy ở 400C và đo OD (6