Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic

iều tra mới đây của Bộ NN-PTNT cho thấy, có rất nhiều mẫu thịt bị nhiễm khuẩn vượt quá mức cho phép: Các loại vi khuẩn tìm thấy trong các mẫu thịt được đưa đi xét nghiệm là Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), Clostridium perfringens (vi khuẩn yếm khí), và Salmonella (vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn).[15] 2.2.6.5 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được phân lập đầu tiên trên cá nheo(Hawke,1979). Loài vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh trên cá nheo và hiện nay là cá tra ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long của Việt Nam. Khi cá bị nhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao từ 10-90% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi, đồng thời trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục nên người dân thường gọi là bệnh trắng gan [1]. Ngoài ra probiotics con có tính đối kháng với một số loài khác như: Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Shigella paradysenteriae , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae , Vibrio comma. 2.3. Tổng Quan Về Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi khuẩn Lactic 2.3.1 Nhu cầu tìm kíếm các nguồn probiotics mới. Trong những năm gần đây, khả năng kháng cự lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá phổ biến trong sự điều trị bệnh của con người và động vật. Vì thế sự tiếp tục tìm ra những chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực thuốc. Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh. Trong số đó, sự sản xuất probiotics từ vi khuẩn lactic đã thu hút nhiều sự chú ý do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm. 2.3.2. Các tiêu chuẩn để chọn các chủng probiotics Các vi sinh vật dùng làm probiotics phải đảm bảo các đặc điểm sau: không gây bệnh, khi sử dụng nó sẽ có tác động tốt đối với vật chủ Có khả năng tồn tại khi đi xuyên qua dạ dày ( dịch tiêu hoá, dịch acid, dịch mât) Có khả năng bám đính tốt trên niêm mạc ruột của đường tiêu hoá vật chủ Sản xuất các chất chống lại các mầm bệnh: bacteriocin, H2O2…. Duy trì tốt khả năng sống trong quá trình sản xuất, bảo quản và sử dụng Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hoá vật chủ Dễ nuôi cấy Kích thích hoạt động của gen kháng và sinh ra chất chống ung thư. Tăng cường khả năng hấp thụ lactose Giảm huyết áp của những người bị chứng cao huyết áp. Ngăn ngừa và giảm mức độ gây bệnh tiêu chảy . 2.3.3 Các phương pháp tìm kiếm các nguồn probiotics mới. Hiện nay trên thị trường có nhiều sản phẩm probiotics dùng trong dược phẩm, chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm đều giống nhau về thành phần vi sinh, chỉ khác nhau về nhà sản xuất mà các chủng vi sinh mang đặc tính probiotic lại rất đa dạng, mỗi chủng lại có phổ tác dụng khác nhau vì vậy việc phân lập để tuyển chọn ra những chủng, giống mới sẽ góp phần làm phong phú thêm nguồn probiotics, làm tăng khả năng phòng và trị bệnh cho người và động vật. Viêc lựa chọn và phân lập các chủng vi khuẩn sản xuất probiotics là một quy trình lựa chon cẩn thận. Phân lập các chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên biệt đặc trưng, tìm kíếm và lựa chọn các khuẩn lạc mang đặc điểm hình thái như những giống mà mình đang tìm kiếm. Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủng vi khuẩn lactic thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên, đồng thời vì chúng có nguồn gốc từ thực phẩm nên đa số là đảm bảo về mặt an toàn cho con người và vật nuôi. Vì vậy vi khuẩn lactic thường được chọn để trở thành probiotics. Vi khuẩn lactic được phân lập trên môi trường chuyên biệt MRS (DeMan, Rogosa, Sharpe) [18] từ nhiều nguồn khác nhau: - Từ các sản phẩn thực phẩm lên men như: kefir, sữa chua, dưa chua, nem chua, kim chi…. - Từ phân của các gia cầm: thỏ, gà, heo… - Từ sữa mẹ Một chủng vi khuẩn sau khi đã được tuyển chọn, tạo dòng thuần thì viêc quan trọng kế tiếp là phải xác định chúng thuộc giống nào, loài nào. Vì vậy, các phương pháp định danh được áp dụng. Công việc tuyển chon ngoài việc tìm ra chủng đảm bảo những thuộc tính đặc biệt của probiotics, đảm bảo sự ổn định và độ thuần khiết cao và từ đó lự chon chủng có hoạt lực cao nhất theo từng mục đích sử dụng, từng đối tượng cho phù hợp. Khảo sát tính an toàn của chủng trước khi mang đi sử dụng. Sự an toàn cho con người, cho động vật và cho môi trường. 2.3.4. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập 2.3.4.1 Các phương pháp định danh cổ điển đối với vi sinh vật [2]. Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v.. và dựa theo khoá phân loại của Bergey để xác định chủng vi khuẩn vừa phân lập có phải thuộc họ mình cần tìm hay không. * Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái: - Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến). - Kiểm tra khả năng di động: Nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi trường thạch mềm. - Nhuộm bào tử: Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) Nhuộm Carbolic Fuchsin. - Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo, Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet) - Nhuộm thành tế bào - Nhuộm hạt dị nhiễm - Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid) - Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis) - Nhuộm vi khuẩn kháng acid * Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý: - Hình thái khuẩn lạc - Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt - Nhu cầu oxygen. * Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa: Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh cho phù hợp như: Khả năng đồng hóa các nguồn carbon, Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red), phản ứng  V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza. ... Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như: - API20E KIT Nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả. - Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ. - Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. - Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin. 2.3.4.2. Các phương pháp định danh vi sinh vật dựa theo kỹ thuật sinh học phân tử [3].          Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật.          Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu là:          + Phân tích acid nucleic.          + Phân tích protein.          + Phân tích polysaccharid.          + Hóa phân loại học. 2.4. Ứng Dụng Của probiotics 2.4.1. Các dạng chế phẩm probiotics trong thương mại. Ngoài dạng probiotics thường gặp trong yogurt, kefir, v.v… Probiotics còn có thể được thấy bán ra dưới nhiều hình thức khác như: • Probiotics đông khô (lyophilised): Khi hạ nhiệt độ xuống thật thấp vi khuẩn sẽ trở nên khô như bột nhưng không bị hủy diệt. Chúng sẽ sống trở lại lúc được uống vào. • Viên nang (capsule): Tại Canada, mỗi viên chứa từ 2 đến 6 tỉ vi khuẩn. Thường có hai hoặc bốn loại vi khuẩn phối hợp lại với nhau. Các vi khuẩn thường được sử dụng có thể là: L.casei, L.acidophilus, L.bulgaricus, L.rhamnosus, Streptococcus thermophi- lus, B.lactis, B. longum. Một số viên probiotics được bán dưới dạng đông lạnh hay dạng trữ lạnh, một số khác thì được giữ ở nhiệt độ bình thường. Dạng lạnh chứa nhiều vi khuẩn sống hơn dạng bình thường. • Bột (powder): Dạng bột để pha trong nước. Nhờ lưu lại bao tử trong thời gian ngắn nên khi đến ruột một số lượng lớn vi khuẩn vẫn còn sống. • Yogurt trị liệu (therapeutic yogurt): Nên uống trước bữa ăn. Có thể chứa một tỉ lệ Pro-biotic rất cao (50.109 cho một liều). • Nấm men Saccharomyces boulardii, còn gọi là men sống hay men có hoạt tính, được sấy khô ở nhiệt độ không quá 40oC, có tính năng trị liệu rất tốt. 2.4.2. Những chủng vi khuẩn probiotics đã được thương mại hóa [54], [9]. Bảng 2.6: Những chủng vi khuẩn probiotic đã được thương mại hóa Chủng Tên sản phẩm Nhà sản xuất Tác động đến con người Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 Chr. Hansen Bifidobacterium breve Yakult Bifiene Yakult Bifidobacterium infantis 35624 Align Procter & Gamble Bifidobacterium lactis HN019 (DR10) Howaru Bifido Danisco Bifidobacterium longum BB536 Morinaga Milk Industry Escherichia coli M-17 ProBactrix BioBalance Escherichia coli Nissle 1917 Mutaflor Ardeypharm Lactobacillus acidophilus LA-5 Chr. Hansen Lactobacillus acidophilus NCFM Danisco Lactobacillus casei DN114-001 (Lactobacillus casei Immunitas(s)/Defensis) Actimel/DanActive Danone Lactobacillus casei CRL431 Chr. Hansen Lactobacillus casei F19 Cultura Arla Foods Cải thiện sức khỏe tiêu hóa, kích thích miễn dịch, làm giảm kháng sinh-liên quan đến tiêu chảy, điều chỉnh sự cân bằng men vi sinh trong ruột già, làm giảm sự tăng cân [13]. Lactobacillus casei Shirota Yakult Yakult Lactobacillus paracasei St11 (or NCC2461)[55] Lactobacillus fortis Nestlé Dành cho trẻ em Lactobacillus johnsonii La1 (Lactobacillus LC1) Nestlé Lactococcus lactis L1A Norrmejerier Kích thích miễn dịch, cải thiện tiêu hóa, làm giảm kháng sinh - tiêu chảy [41] Lactobacillus plantarum 299V GoodBelly / ProViva/ TuZen NextFoods Probi Ferring Lactobacillus reuteri ATTC 55730 (Lactobacillus reuteri SD2112) BioGaia Biologics Phòng, chống và giảm thiểu tiêu chảy ở trẻ em [52], [58], cải thiện hệ tiêu hóa. Phòng bệnh ở tẻ em và người lớn [53], [33], [63], [61] Lactobacillus rhamnosus ATCC 53013 (discoveredby Gorbach & Goldin (LGG) Vifit và một số mặt hàng khác Valio Lactobacillus rhamnosus LB21 Verum Norrmejerier Kích thích miễn dịch, cải thiện tiêu hóa, làm giảm kháng sinh-tiêu chảy[21] Lactobacillus salivarius UCC118 Saccharomyces cerevisiae (boulardii) lyo DiarSafe và một số mặt hàng khác Wren Laboratories và một số hảng khác chống lại kháng sinh-được liên kết và tiêu chảy [Clostridium difficile] bệnh nhiễm trùng, để điều trị tiêu chảy cấp tính ở người lớn & trẻ em. [28], [14], [34] Hỗn hợp:Lactobacillus rhamnosus GR-1 & Lactobacillus reuteri RC-14 Bion Flore Intime Jarrow Fem-Dophilus Chr. Hansen Ngăn ngừa viêm âm đạo [5]. Hỗn hợp :mixture of 8 strains of Streptococcus thermophilus & four Lactobacillus spp & three Bifidobacterium spp strains VSL#3 Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc. Hỗn hợp:Lactobacillus acidophilus CUL60 & Bifidobacterium bifidum CUL 20 Hỗn hợp:Lactobacillus acidophilus CL1285 & Lactobacillus casei BioK Plus Bio-K+ International Cải thiện sức khỏe tiêu hóa. Ngăn ngừa Tiêu chảy Có liên hệ Antiobic (AAD) và Clostridium (C Difficile) [7]. Kiềm hãm In vitro ở những chủng Listeria monocytogenes và L. innocua, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis và Enterococcus faecium.[50]tiêu hóa đường lactose và kích thích miễn dịch.[39] Lactobacillus helveticus R0052 & Lactobacillus rhamnosus R0011 A'Biotica và một số mặc hàng khác Institut Rosell Hỗn hợp pha trộn từ 16 chủng: Bifidobacterium bifidumBifidobacterium breveBifidobacterium infantisBifidobacterium lactisBifidobacterium longumLactobacillus acidophilusLactobacillus brevisLactobacillus bulgaricusLactobacillus caseiLactobacillus gasseriLactobacillus paracaseiLactobacillus plantarumLactobacillus rhamnosusLactobacillus salivariusLactococcus lactisStreptococcusthermophilus Flora Source® Multi-Probiotic® Nutri-Health® 2.4.3. Các thành tựu nghiên cứu probiotics trong và ngoài nước. 2.3.3.1 Trong nước * Từ bã khoai mì mà ngay cả động vật cũng chê, các chuyên gia thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tạo ra thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi kể cả thủy sản.ProBio-S lại là chế phẩm dạng lỏng, được sản xuất bằng cách cho bã tươi vào những bao tải lớn rồi cấy chế phẩm EM-S chứa nhiều chủng vi sinh vật hữu ích như Bacillus spp., Lactobacillus spp., Saccharomyces spp. với tỷ lệ 1lít EM-S/25kg bã (1ml chứa 1010 tế bào vi sinh vật hữu ích). Ba ngày ủ làm cho lượng vi sinh vật tăng mạnh. Với những chủng vi sinh vật hữu dụng nói trên, chế phẩm ProBio-S giúp cân bằng hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột của vật nuôi cũng như giảm lượng vi sinh vật có hại. Nhờ thế mà vật nuôi tiêu hoá tốt hơn, giảm tỷ lệ bệnh đường ruột, tăng trọng nhanh hơn. Giá thành của ProBio-S là 5.000-6.000 đồng/kg. Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên 15-20 con lợn 1 tháng tuổi cho thấy sau ba tháng được ăn hai chế phẩm trên, lợn tăng trọng nhanh hơn 1,1-1,3kg so với những con đối chứng (chỉ ăn thức ăn bình thường). * Võ Thị Hạnh với chế phẩm Probiotic Bio I và Bio II gồm hỗn hợp các vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đã nhận được giải thưởng WIPO dành cho nhà khoa học nữ xuất sắc nhất * Trong thủy sản, công ty công nghệ hóa sinh Việt Nam đã sản xuất những sản phẩm phục vụ công tác môi trường nuôi tôm, cá đạt hiệu quả: - BIO - DW - làm sạch nước, nền đáy ao nuôi; ngăn chặn dịch bệnh; tăng sản lượng tôm, cá. - BIO - PROBIOTIC - Thức ăn bổ sung cho tôm, cá. - EMC - Phức hợp vi sinh vật có lợi, VITAMIN và các ENZYME hữu hiệu dùng nuôi tôm Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan. 1. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của loài Lactobacillus plantarum L24. Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy. Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội 2. Một số đặc tính của Bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn lactobacill. Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh.Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3. Năm 2004, các tác giả Tăng Thị Chính, Đặng Đình Kim thuộc Viện công nghệ môi trường -Viện KH&CN Việt Nam đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm chế phẩm trong nuôi tôm cao sản. Một trong những loại vi sinh vật được dùng là Lactobacillus. Chế phẩm có tác dụng làm tăng tính ngon miệng, giúp tiêu hoá các chất dinh dưỡng có trong thức ăn, tăng cường sức đề kháng, phòng ngừa các bệnh đường ruột như nhiễm E. coli, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại. Do đó nâng cao năng suất nuôi tôm. Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nơi đã sử dụng Bacteriocin trong quá trình làm nem chua. Kết quả đã kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp phần tạo hương vị cho nem chua.  2.4.3.2 Nước ngoài Y học hiện phải đối mặt với thực tế nhiều loại thuốc đang mất dần hiệu quả trong điều trị do bị sử dụng quá thường xuyên. Thêm vào đó, các chất có tính kháng khuẩn được đưa vào cả chất tẩy rửa đến xà phòng, mỹ phẩm, kích thích sự lờn thuốc ở các vi khuẩn cần tiêu diệt. Bởi vậy, phát hiện ra loại thuốc kháng sinh chống lại được sự lờn thuốc được xem như một hy vọng của ngành dược phẩm tương lai. Các nhà nghiên cứu chuẩn bị đưa ra thị trường một loại thuốc kháng vi khuẩn có chứa loại protein này với tên gọi Jensenin P. Hiên nay việc nghiên cứu , ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm. Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công , góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại. Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú hơn. Năm 1970, nhóm tác giả D.A. Kekessy và J.D.Piguet thuộc viện Vệ sinh và An toàn thực phẩm - Thuỵ Sĩ đã nghiên cứu một phương pháp mới trong việc phát hiện bacteriocin. Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trên đĩa môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0.5mm bằng cách khoét bỏ agar trên đĩa. Cho một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin vào giếng, sau thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ xuất hiện, thể hiển bởi một vòng sáng rõ quanh giếng. Năm 1976, nhóm tác giả John R. Tagg, Adnan S. Dajani và Lewis W. Wannamaker thuộc khoa vi sinh- trường đại học Otago, New Zealand, trường đại học Dược Minnesota, Minnesota đã nghiên cứu về những loại bacteriocin của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị. Nghiên cứu đã cho biết được tính đối kháng của bacteriocin, cách đặt tên và phân loại bacteriocin, chiết tách và tinh sạch bacteriocin, phân tích hoạt tính bacteriocin, các loại hoạt động của bacteriocin và ứng dụng của bacteriocin. Năm 1999, các tác giả Raf Callewaert và Luc De Vuyst thuộc Khoa công nghệ sinh học ứng dụng -Đại học Brussel, Bỉ đã nghiên cứu việc sinh tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men. Việc sinh tổng hợp thu nhận bacteriocin bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen [74]. Cũng trong năm 1999, nhóm tác giả Farida Khalid, Roquya Siddiqi và Naheed Mojgani thuộc khoa vi sinh -Trường đại học Karachi-Pakistan đã nghiên cứu tìm ra một loại bacteriocin mới có tên lactocin LC-09. Lactocin LC-09 được phân lập từ chủng vi khuẩn Lactobacillus có trong một mẫu bệnh. Loại này ức chế được một số loài thuộc giống Lactobacillus và vi khuẩn Gram dương khác như Listeria ivanovii, Streptococcus agalactii và S. peyogenes. Đặc tính của Lactocin LC-09 là chịu nhiệt (4 giờ ở 1000C) và thích hợp với môi trường có pH acid. Loại bacteriocin này bị khử hoạt tính bằng cách sử dụng enzim protease. Có thể dùng acridine orange, ethidium bromide để gây đột biến trong việc sản sinh ra loại bacteriocin này. Năm 2002 Soore cùng cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng khuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin. Bacteriocin được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản khác. Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con người. Năm 2004, nhóm tác giả Todorov SD, Van Reenen CA và Dicks KM thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia đại mạch. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum được phân lập từ bia đại mạch (kích thước phân tử 10kDa) ức chế sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli. Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất. Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai của Đài Loan. Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Năm 2006, Stefan Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi Lactobacillus do công ty hoá chất BASF của Đức phát triển. Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng. Chủng Lactobacillus mới có tên là L. anti-caries có khả năng sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối không thẻ dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng. Tháng 3/2007 nhóm tác giả S.D. Todorov và Leon M.T. Dicks KM thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza. Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiella pneumoniae and Lactobacillus curvatus. Sự phát triển của chủng ST712BZ trên môi trường BHI, M17, sữa đậu nành và mật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800AU/ml) được ghi nhận trên môi trường MRS sau 24h. Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất. Các nhà nghiên cứu CSIRO để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng để tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn. Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc virus mà có thể sinh sản và tiết ra bacteriocin. Lợi ích chính của việc sử dụng bacteriocin là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự lại thuốc kháng sinh. Bacteriocins còn bị phân hủy nhanh bởi những động vật để mà không còn cặn bã trong thịt. Các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tổng hợp Klemson vừa phát hiện ra một loại thuốc chống vi khuẩn mới không gây tính lờn thuốc từ chính những vi khuẩn tạo ra loại pho mát Thụy Sĩ. Những vi khuẩn này tiết ra một loại protein có tên bacteriocin, tạo nên tính chất của pho mát. Các thử nghiệm sơ bộ cho thấy chúng có tác dụng chống lại hơn 150 loại vi khuẩn thường gặp. 2.4.4. Các lĩnh vực ứng dụng của probiotics 2.4.4.1. Trong dược phẩm [69]. Thực hiện về tầm quan trọng của con người viêm ruột trong bảo vệ sức khỏe đã khơi dạy mối quan tâm về probiotics, trong đó ích lợi ảnh hưởng đến cơ thể vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Probiotics là những thực phẩm chức năng y tế, nâng cao chất therapeutically sử dụng để ngăn ngừa tiêu chảy, cải thiện khả năng sử dụng lactose và kháng khuẩn.Chúng cũng có tiềm năng để ngăn ngừa bệnh ung thư và giảm cholesterol. Lactobacillus, Bifidobacterium và một số lo