Đồ án Sản xuất Biodiesel từ vi tảo: Kỹ thuật nuôi cấy vi tảo thu Lipid

a 10% CO2 hoặc khí thải từ ống khói với vận tốc 0.3v/v/m, nồng độ CO2 là 5.5%. - Đối với mức độ sinh trƣởng của tế bào khi nồng độ CO2 là 10% Trong ba loài đƣợc khảo sát thì Scenedesmus sp. là loài đạt năng suất sinh khối cao nhất. Sinh khối tối đa đạt đƣợc là 3.13g/L vào ngày thứ 14, năng suất sinh khối đạt 217.50 ± 11.24 mg sinh khối khô/L.ngày. Trong một nghiên 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 20 cứu khác của Morais và Costa [51], đối với hai loài Chlorella sp. và Scenedesmus sp. cô lập từ nhà máy nhiệt điện than đá, năng suất sinh khối của chúng cũng khá cao khi nồng độ CO2 từ 6-12%. Năng suất tối đa của hai loài này với 6% CO2 lần lƣợt là 87 và 85mg sinh khối khô/L.ngày. Hơn nữa, hai loài tảo này cũng có thể sống trong môi trƣờng chứa CO2 với nồng độ lên tới 18%, và năng suất sinh khối cao nhất của loài Scenedesmus obliquus là 140mg sinh khối khô/L trong một ngày với nồng độ CO2 là 12% [50]. Qua đó thấy rằng, khi nuôi ở 10% CO2, năng suất sinh khối của Scenedesmus sp. cao gấp 2-3 lần so với các nghiên cứu ở nồng độ khác, và cả ba loài tảo đƣợc khảo sát ở nồng độ CO2 này đều không gặp phải bất kỳ ảnh hƣởng xấu nào. Tuy nhiên, B. braunii lại có mức độ thích nghi chậm với nồng độ CO2 10%, do đó mức sinh trƣởng của loài này thấp hơn. Sục khí ở nồng độ cao hoặc sục khí liên tục CO2 2% sẽ làm giảm đáng kể pH của môi trƣờng [60]. Lee và các cộng sự [41] đã đề xuất rằng khi tăng mật độ tế bào ban đầu thì sẽ tăng đƣợc sức chịu dựng của vi tảo đối với nồng độ CO2 cao và giảm đƣợc thời gian thích nghi. Nhƣ vậy, nếu B. braunii đƣợc cho thích nghi với nồng độ CO2 thấp trƣớc đó, thì mức độ sinh trƣởng và sản lƣợng sinh khối sẽ có thể gia tăng mà không cần qua trải qua thời kỳ thích nghi [12]. - Đối với lipid và acid béo khi nồng độ CO2 là 10% Hàm lƣợng lipid tổng trong vi tảo theo nghiên cứu của Chan Yoo và các cộng sự đạt từ 6.25% tới 25.79% khối lƣợng khô. Từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14, các giá trị có xu hƣớng giảm. Hàm lƣợng lipid trong Scenedesmus sp. thì thấp hơn so với B. braunii, nhƣng do Scenedesmus sp. có năng suất sinh khối cao nên có năng suất lipid tổng cao nhất trong ba loài khảo sát. Bảng 2. 3: Năng suất sinh khối và năng suất lipid của Botryococcus braunii, Chlorella vulgaris và Scenedesmus sp. khi nuôi ở 10% CO2 trong 14 ngày [12]. Loài Năng suất sinh khối (mg sinh khối khô/L.ngày) Năng suất lipid tổng (mg/L.ngày) B. braunii 26.55 ± 7.66 5.51 ± 1.53 C. vulgaris 104.76 ± 10.73 6.91 ± 0.03 Scenedesmus sp. 217.50 ± 11.24 20.65 ± 0.13 Trong khi hàm lƣợng lipid của cả hai loài Scenedesmus sp. và C. vulgaris đều thấp hơn 11.92%, hàm lƣợng lipid tổng của B. braunii vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 lần lƣợt là 25.79% và 21.10%. Các kết quả khác lại cho thấy 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 21 rằng, hàm lƣợng lipid tổng có thể đạt đƣợc từ 20-50% là khá phổ biến, thậm chí một số loài vi tảo có thể tích lũy lipid tới 80% (w/w) sinh khối khô. Và nuôi cấy trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau cũng có thể gia tăng đƣợc hàm lƣợng lipid tích lũy trong tế bào vi tảo [44]. Hàm lƣợng lipid tổng của B. braunii trong phase cân bằng sớm thì cao hơn trong phase sinh trƣởng theo hàm số mũ (phase log). Mặc dù hàm lƣợng lipid của cả ba loài tảo đƣợc Chan Yoo khảo sát với nồng độ 10% CO2 có thấp hơn một chút so với kết quả nghiên cứu trong các bản báo cáo khác, nhƣng chỉ xét trên phase cân bằng thì hàm lƣợng này lại cao hơn [12]. Bảng 2. 4: Thành phần các acid béo của Botryococcus braunii, Chlorella vulgaris và Scenedesmus sp. khi nuôi cấy ở 10% CO2 trong 14 ngày [12]. Loài C16:0 (% w/w acid béo) C16:1 (% w/w acid béo) C18:0 (% w/w acid béo) C18:1 (% w/w acid béo) C18:2 (% w/w acid béo) B. braunii 29.5 ± 0.8 3.4 ± 0.3 1.0 ± 0.2 44.9 ± 0.4 21.2 ±0.4 C. vulgaris 24.0 ± 0.1 2.1 ± 0.0 1.3 ± 0.2 24.8 ± 1.5 47.8 ± 1.6 Scenedesmus sp. 36.3 ± 7.1 4.0 ± 0.8 2.7 ± 0.7 25.9 ± 4.5 31.1 ± 11.5 Trong số các acid béo, thì acid palmitic, acid oleic, acid linoleic đƣợc xem là thành phần chính với tỷ lệ từ 21% tới 45% tên tổng hàm lƣợng lipid trong ba loài tảo, các acid palmitoleic và acid stearic chỉ là thứ yếu, tỷ lệ chiếm rất thấp. Đặc biệt, acid oleic, là acid béo đƣợc xem nhƣ là thành phần chính và rất lý tƣởng để sản xuất biodiesel, thì lại chiếm tới 44.9% hàm lƣợng lipid tổng trong B. braunii [12]. Tỷ lệ này là rất cao khi so sánh với tỷ lệ acid oleic đạt đƣợc là 28% trong bản báo cáo của Ranga Rao và các cộng sự [60]. Vì vậy, có thể kết luận rằng, nồng độ CO2 10% là một nồng độ khá tối ƣu để nuôi cấy vi tảo thu lipid nhằm mục đích sản xuất biodiesel. Để khắc phục nhƣợc điểm hàm lƣợng lipid tổng hơi thấp, ta có thể sử dụng nồng độ 10% CO2 kết hợp với một số yếu tố dinh dƣỡng tối ƣu khác, vấn đề chính là ở nồng độ này có thể thu đƣợc thành phần lipid phù hợp cho yêu cầu sản xuất biodiesel chất lƣợng cao, nhất là trên một số chủng cụ thể đƣợc lựa chọn. Vấn đề sinh trƣởng chậm của một số loài nhƣ B. braunii, ta có thể áp dụng một số biện pháp cải thiện nhƣ tiền thích nghi giống với nồng độ CO2 thấp để rút ngắn thời gian thích nghi khi nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao. 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 22 - Khi nuôi bằng khí thải từ ống khói, nồng độ CO2 5.5% Hai trong ba loài tảo nêu trên, B. braunii và Scenedesmus sp. đƣợc nuôi ở hai chế độ để so sánh, đó là sục không khí và dùng khí thải từ ống khói có nồng độ CO2 là 5.5%. Năng suất sinh khối của B. braunii và Scenedesmus sp. với khí thải từ nhà máy lần lƣợt là 77 và 203mg/L.ngày. Năng suất lipid của B. braunii và Scenedesmus sp. đạt 21 và 39mg/L.ngày, tƣơng đƣơng với hàm lƣợng lipid là 24 và 18% [12]. Qua đó chứng tỏ rằng B. braunii vẫn giữ đƣợc hàm lƣợng lipid cao khi nuôi bằng khí thải nhƣ khi nuôi bằng khí chứa 10% CO2. Sinh khối và hàm lƣợng lipid trong các chủng Scenedesmus sp. thì tƣơng đƣơng khi nuôi ở 5% CO2 [66]. Thành phần acid béo của B. braunii và Scenedesmus sp. khi nuôi sục không khí và khí thải ống khói thì gần nhƣ không thay đổi, đặc trƣng cho mỗi loài. Tỷ lệ acid oleic trong B. braunii lần lƣợt là 56 và 59% lƣợng acid béo tổng khi nuôi bằng không khí và khí thải. Vì vậy kết luận rằng có thể sử dụng khí thải từ ống khói để nuôi B.braunii nhằm sản xuất biodiesel vì có hàm lƣợng lipid nhiều và trong đó thành phần acid oleic chiếm tỷ lệ rất cao [12]. 2.2.2.2. Thành phần Nitrogen Nitrogen là một yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến sự chuyển hóa và tích lũy lipid trong nhiều loài vi tảo. Thêm vào đó, điều khiển nồng độ nitrogen khá dễ dàng và đây là một yếu tố có chi phí thấp khi so sánh với các yếu tố khác [14]. Vì vậy, thành phần và hàm lƣợng nitrogen bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy vi tảo để tăng năng suất lipid đã đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Nhƣ đối tƣợng Chlorella vulgaris, khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng cơ bản Bold, sử dụng CO2 có trong không khí (khoảng 300ppm) và NaNO3 là những nguồn cung cấp carbon và nitrogen duy nhất trong suốt quá trình thí nghiệm [5], nuôi cấy theo phƣơng thức quang tự dƣỡng trong 14 ngày dƣới ánh sáng liên tục có cƣờng độ 70µE/m2s, ở nhiệt độ 300C. Nồng độ nitrogen trung bình trong môi trƣờng nuôi cấy Chlorella vulgaris theo Guillard là 1.50g/L, do đó khi khảo sát sự giảm nồng độ nitrogen để kích thích sự tích lũy lipid, Attilio và các cộng sự đã nghiên cứu ở 2 nồng độ khác là 0.750 và 0.375g/L để so sánh với nồng độ trung bình [5]. Điều kiện hàm lƣợng nitrogen thấp trong môi trƣờng nuôi cấy thực sự làm gia tăng đáng kể sự tích lũy lipid trong vi tảo [34]. Vì vậy hàm lƣợng nitrate lần lƣợt đƣợc giảm đi còn ½ và ¼ 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 23 so với nồng độ tiêu chuẩn trong khi cƣờng độ chiếu sáng và tốc độ sục khí vẫn giữ nguyên trong suốt các thí nghiệm. Ảnh hƣởng của việc giảm thiểu nồng độ NaNO3 trên sự sinh trƣởng của C. vulgaris đƣợc tóm tắt trong bảng sau: Bảng 2. 5: Tham số sinh trƣởng và sự sản xuất lipid của C. vulgaris ở các nồng độ NaNO3 khác nhau [5] NaNO3(g/L) µ-Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (1/ngày) Sản lƣợng lipid (glipid/100gsinh khối khô) Năng suất lipid (mglipid/L.ngày) 1.500 0.14±0.00 5.90±0.42 8.16±0.65 0.750 0.14±0.01 14.37±0.64 20.44±0.75 0.375 0.14±0.00 15.31±0.51 20.30±0.40 Qua đó ta thấy, trong khi tốc độ sinh trƣởng riêng của C. vulgaris thay đổi không đáng kể thì hàm lƣợng lipid tăng gấp 3 lần khi giảm nồng độ nitrate từ 1.500g/L còn 0.375g/L. Khi thay đổi nồng độ NaNO3, hàm lƣợng acid palmitic không thay đổi đáng kể [5]. Tuy nhiên, hàm lƣợng acid linolenic acid (C18:3) trong C. vulgaris thì phù hợp với tiêu chuẩn biodiesel sử dụng cho các phƣơng tiện vận chuyển ở Châu Âu (12%, mol/mol) [38]. Hình 2. 2: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME) của C. vulgaris tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [A4] (FAME: fatty acid methyl ester) Tuy nhiên trong kỹ thuật nuôi cấy vi tảo, nguồn nitrogen có thể đƣợc sử dụng dƣới nhiều dạng khác nhau, nhƣ là ammonia, nitrate, nitrite và urea. Tùy 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 24 thuộc vào đặc tính loài, việc sử dụng các nguồn nitrogen khác nhau đem đến những hiệu quả khác nhau. Nhƣ đối với Ellipsoidion sp, sử dụng ammonium làm nguồn cung cấp nitrogen sẽ đem lại mức độ sinh trƣởng và hàm lƣợng lipid cao hơn khi sử dụng urea và nitrate [88]. Neochloris oleoabundans khi nuôi bằng nitrate sẽ sinh trƣởng nhanh hơn và tích lũy lipid nhiều hơn khi nuôi với urea [42], nhƣng tế bào lại sinh trƣởng yếu trong môi trƣờng sử dụng nguồn nitrogen là ammonium. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng cả ba loại nguồn nitrogen là nitrate, ammonium và urea đều có thể đáp ứng tốt đối với Spirulina platensis [16, 74]. Trong số các nguồn nitrogen hữu cơ, urea đóng một vai trò quan trọng và thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy vi tảo trên quy mô lớn bởi vì giá thành của urea thì thấp hơn nhiều khi so với các nguồn nitrogen khác [14]. Ngoài ra, chế độ nuôi cấy ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng và thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo. Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy fed-batch để điều chỉnh mức độ bổ sung môi trƣờng nhằm gia tăng năng suất [14]. Cải thiện năng suất lipid có thể thực hiện bằng biện pháp nuôi cấy fed-batch bổ sung gián đoạn nguồn nitrogen [79]. Thêm vào đó, trong phƣơng pháp nuôi cấy bán liên tục, nồng độ chất dinh dƣỡng ban đầu và mức độ khôi phục cũng đƣợc sử dụng để biến đổi các thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo [56, 22]. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 25 3. NUÔI VI TẢO NANNOCHLOROPSIS OCULATA THU LIPID NHẰM SẢN XUẤT BIODIESEL 3.1. Nannochloropsis oculata 3.1.1. Phân loại Nguồn gốc: thuật ngữ Nannochloris bắt nguồn từ chữ Nannochlorid, vì vậy thể chính xác là Nannochloridopsis. Và Nannochloropsis là một cụm từ viết tắt từ thuật ngữ trên [32]. Nannochloropsis oculata thuộc vào lớp tảo Eustigmatophyceae, bộ Eustigmatales, họ Monodopsidaceae, chi Nannochloropsis [32]. Sự phân loại Nannochloropsis đã từng mắc phải nhiều nhầm lẫn. Đây là loài tảo có kích thƣớc rất nhỏ (nhỏ hơn 5 µm), màu hơi xanh, không có giai đoạn giao tử chuyển động để sinh sản hữu tính. Khi phân loại hình thái cơ thể sinh vật của chi tảo này, các nhà khoa học đã xem xét dựa trên những nhóm chính đó là Chlorophyceae, Tribophyceae và Eustigmatophyceae. Sử dụng kính hiển vi quang học để phân biệt hình thái giữa các loài tảo trên gặp phải nhiều hạn chế, do đó dẫn đến các nhận định sai lầm [32]. Hầu hết các tảo có hình dạng chung chung nhƣ thuộc tảo đơn bào, có lớp lục lạp đơn tại vách tế bào, vách tế bào trong suốt vô cấu trúc thiếu chất nhầy bao quanh, và chỉ sinh sản theo kiểu chia đôi thành 2 phần bằng nhau đều đƣợc liệt vào những loài của chi Nannochloris Naumann thuộc Chlorophyceae [53]. Nannochloropsis đƣợc Droop phát hiện ra vào năm 1955 tại các vùng nƣớc lợ bề mặt trong các hồ giữa những rặng đá. Antia và các cộng sự [3] đã phát hiện ra những điểm không tƣơng thích trong sự phân loại của Droop [32] dựa trên cơ sở thành phần các hợp chất trong lục lạp và vi cấu trúc, qua đó N. coccoides đƣợc xếp vào lớp Chlorophyceae trong khi N. oculata đƣợc xếp vào Eustigmatophyceae. Nannochloropsis là một chi mới bao gồm các loài rất nhỏ thuộc lớp Eustigmatophyceae, trong đó phổ biến nhất là loài Nannochloropsis oculata. 3.1.2. Đặc điểm hình thái Nannochloropsis oculata là loài tảo đơn bào, tự nổi trên môi trƣờng lỏng. Tế bào có dạng hình cầu với đƣờng kính khoảng 2-4µm, hoặc hình trụ với kích thƣớc là 3-4x1.5µm [32]. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 26 Nannochloropsis oculata có một lớp màng ngoài mỏng hiện diện ở các giai đoạn nhất định trong chu kỳ sinh trƣởng của tế bào, thành tế bào trong suốt và không tạo hình dạng xác định, mang một lớp đơn các sắc tố diệp lục màu vàng xanh, là sắc tố đặc trƣng của nhóm Eustigmatophyceae, không có lớp màng nhầy bên ngoài [32]. 3.1.3. Đặc điểm sinh lý Nannochloropsis sp. là một chi thuộc dạng phiêu sinh vật tự dƣỡng, trong tế bào có các hợp chất chlorophylls [32]. Nannochloropsis oculata là loài vi tảo sống tối ƣu trong môi trƣờng nƣớc mặn, tuy nhiên đôi khi cũng hiện diện trong môi trƣờng nƣớc ngọt hay nƣớc lợ và sự thay đổi về hình thái là không đáng kể mấy [36]. Nannochloropsis oculata có khả năng sống trong một dải nhiệt độ khá rộng. Thích nghi tốt trong điều kiện môi trƣờng có nhiệt độ thấp, thậm chí là ở gần 00C [36]. Điều kiện sinh trƣởng tốt nhất của Nannochloropsis oculata ở khoảng 210C, mức độ chiếu sáng 52µmol photon/m2s, pH 8.4, mức độ sục khí 14.7 vvh [57]. Nannochloropsis oculata thuộc vào thể đơn bội [36], sinh sản vô tính theo kiểu phân đôi theo chiều ngang [32]. 3.1.4. Đặc điểm sinh hóa Khi điều kiện dinh dƣỡng đầy đủ, Nannochloropsis sp. thƣờng có khuynh hƣớng đầu tiên sẽ chuyển hóa carbon thành protein [52]. Tuy nhiên, dƣới các điều kiện thay đổi khác nhau, tế bào vi tảo bị kích ứng, sẽ có nhiều carbon đƣợc chuyển hóa thành lipid và carbohydrate. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng sẽ tác động lên thành phần lipid và các acid béo có trong tế bào vi tảo [77]. Các acid béo chủ yếu có trong Nannochloropsis sp. là C14:0, C16:0, C16:1, C20:4 và C20:5. Ngoài ra cũng có sự hiện diện của một số acid béo phụ khác nhƣ C18:0, C18:1, C18:2 và C18:4. Các acid béo này tồn tại ở ba dạng lipid trong tế bào vi tảo, đó là: galactolipid, phospholipid và lipid trung tính. Galactolipid của Nannochloropsis sp. giàu các acid béo C20:5 và C20:4, kết hợp với C16:0 và C16:1, một lƣợng nhỏ C14:0. Lipid trung tính của Nannochloropsis sp. thì chủ yếu là các triacylglycerol, gồm các acid béo C16:0 và C16:1, một ít acid béo C14:0 và C18:0. Phospholipid của Nannochloropsis sp. giàu C16:1, một lƣợng đáng kể C18:1 và C18:4, hàm lƣợng C16:0 thấp [77]. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 27 Hình 3. 1: Thành phần acid béo của các nhóm lipid chính trong Nannochloropsis sp. [77] Đồ thị trên chứng tỏ rằng Nannochloropsis sp. là loài vi tảo quang tự dƣỡng phù hợp cho việc sản xuất acid eicosapentaenoic (C20:5; EPA). Vì vậy, Nannochloropsis sp. đƣợc xem là nguồn acid béo chƣa bão hòa ω3 quan trọng cho con ngƣời [13]. Ngoài ra, tỷ lệ acid palmitoleic (C16:1) cũng khá cao. Dƣới các điều kiện môi trƣờng khác nhau, tỷ lệ các thành phần lipid và acid béo trong tế bào vi tảo có thể thay đổi [77]. Nghĩa là ta hoàn toàn có khả năng điều khiển đƣợc quá trình sản xuất lipid trong tế bào Nannochloropsis sp. khi tìm đƣợc môi trƣờng tối ƣu tƣơng ứng. Vì vậy, có thể xem Nannochloropsis oculata là một loài tiềm năng dùng để sản xuất lipid phục vụ cho biodiesel. 3.2. Đề xuất mô hình thí nghiệm nghiên cứu sự tích lũy lipid theo điều kiện môi trƣờng ở Nannochloropsis oculata 3.2.1. Yếu tố nhiệt độ 3.2.1.1. Nghiên cứu của Attilio Converti, 2009 Attilio Converti và các cộng sự đã làm một nghiên cứu về sự ảnh hƣởng của nhiệt độ lên mức độ sinh trƣởng và hàm lƣợng lipid đối với Nannochloropsis oculata nhằm ứng dụng cho việc nuôi cấy loài vi tảo này phục vụ cho sản xuất biodiesel. Trong nghiên cứu này, Attilio Converti và các cộng sự đã thiết lập các thí nghiệm nuôi cấy N. oculata tại các nhiệt độ 15, 20 và 25 0 C trong môi trƣờng f/2 của Guillard, sử dụng nguồn cung cấp - 5 10 15 20 25 30 35 40 45 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:4 C20:4 C20:5 % w /w li p id t ổ n g Lipid tổng Lipid trung tính Galactolipid Phospholipid 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 28 carbon là CO2 có sẵn trong không khí với tốc độ sục khí khoảng 300ppm, và nguồn cung cấp nitrogen là NaNO3. Các mẻ nuôi cấy tự dƣỡng thực hiện trong 14 ngày dƣới ánh sáng liên tục có mật độ dòng photon là 70µE/m2s. Mỗi thí nghiệm lập lại hai lần [5]. - Mức độ sinh trƣởng và sự sản xuất lipid Thay đổi điều kiện sinh trƣởng tối ƣu của N. oculata (200C) dẫn đến kết quả làm biến đổi đáng kể mức độ sinh trƣởng của loài vi tảo này. Bảng 3. 1: Sự sinh trƣởng và sản xuất lipid của N. oculata tại các nhiệt độ khác nhau [5] Nhiệt độ ( 0 C) µ - Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (1/ngày) Sản lƣợng lipid (glipid/100gsinh khối khô) Năng suất lipid (mglipid/L.ngày) 15 0.06 ± 0.00 14.92 ± 0.82 9.11 ± 0.30 20 0.13 ± 0.00 7.90 ± 0.21 10.01 ± 0.22 25 0.07 ± 0.01 13.89 ± 0.61 10.10 ± 2.09 Khi nhiệt độ dƣới mức tối ƣu, mức độ tăng trƣởng giảm hơn một nửa, từ 0.13 giảm còn 0.06/ngày. Sự giảm rõ nét này cũng đƣợc ghi nhận khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao, 250C [5]. Sự giảm thiểu đáng kể này chứng tỏ rằng N. oculata mặc dù có thể thích nghi trong một phổ rộng nhiệt độ nhƣ nêu trong phần trên, nhƣng là một loài khá nhạy cảm khi sinh trƣởng tại các nhiệt độ khác nhau. Vì vậy, nếu nhiệt độ càng hạ thấp hoặc càng tăng cao thì mức độ sinh trƣởng của loài vi tảo này càng bị hạn chế. Sự thay đổi nhiệt độ lại có ảnh hƣởng tích cực lên sự tích lũy lipid đối với N. oculata. Nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng của loài vi tảo này là 200C, nhƣng khi tăng hoặc giảm nhiệt độ nuôi cấy, sản lƣợng lipid tích lũy trong vi tảo tăng lên đáng kể, gần nhƣ gấp đôi so với ở 200C [5]. Nhiệt độ thay đổi ảnh hƣởng không tốt đến mức độ sinh trƣởng đặc trƣng nhƣng lại có tác động tích cực lên sự tổng hợp và tích lũy lipid trong tế bào vi tảo. Chính vì thế năng suất lipid của N. oculata khi nuôi cấy tại các nhiệt độ khác nhau lại gần nhƣ tƣơng đƣơng nhau, không hơn kém nhau nhiều lắm. Kết quả cho thấy, tại 250C, năng suất lipid của N. oculata đạt giá trị cao nhất, có thể lên đến 12.19mg/L.ngày [5]. - Sự thay đổi hàm lƣợng các acid béo trong thành phần lipid 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 29 Hình 3. 2: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME) của N. oculata tại các nhiệt độ khác nhau [A4] (FAME: fatty acid methyl ester) Qua đồ thị trên ta thấy, tại 150C, hàm lƣợng C16:0 và C18:3 khá cao. Còn hàm lƣợng C18:1 lại rất thấp. Khi nhiệt độ tăng lên 250C, hàm lƣợng C18:1 tăng lên nhiều (khoảng 20%), trong khi đó C16:0 và C18:3 lại có xu hƣớng giảm [5]. 3.2.1.2. Nghiên cứu của Hanhua Hu và Kunshan Gao, 2006 Hanhua Hu và Kunshan Gao cũng đã khảo sát sự sinh trƣởng và thành phần lipid của Nannochloropsis sp. tại ba mức nhiệt độ khác nhau: 14 0 C, 22 0 C và 30 0 C. Trong nghiên cứu của mình, Hanhua Hu và Kunshan Gao đã thiết lập thí nghiệm nuôi cấy Nannochloropsis sp. tại các điều kiện nhƣ sau: môi trƣờng nuôi cấy f/2 nƣớc biển nhân tạo (f/2AW: f/2 artificial seawater), mức độ sục khí 200mL/phút với hàm lƣợng CO2 cao (2800µL/L), mức độ chiếu sáng 50µmol/m2s, thu mẫu vào ngày thứ 10 sau khi cấy giống vào môi trƣờng. Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần [31]. - Mức độ sinh trƣởng và thành phần hợp chất hóa học trong tế bào Nannochloropsis sp. có khả năng sinh trƣởng tốt trong khoảng nhiệt độ 14-30 0 C [31]. Sản lƣợng sinh khối khô (mg/L) của cả ba chế độ nhiệt không có sự thay đổi đáng kể, ngoại trừ ở 300C mức sinh trƣởng có sự giảm nhẹ so với nhiệt độ tối ƣu là 220C [31]. Khi nhiệt độ môi trƣờng thay đổi ra khỏi khoảng nhiệt độ tối ƣu, dù cao hơn hay thấp hơn đều cho kết quả hàm lƣợng lipid tổng tăng đáng kể. Cụ thể là ở 220C, hàm lƣợng lipid trong tế bào vi tảo chỉ đạt 9%, trong khi ở 140C 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 30 và 30 0C hàm lƣợng lipid lần lƣợt đạt 19% và 15%. Hàm lƣợng carbohydrate và protein cũng có sự thay đổi nhẹ [31]. - Thành phần các acid béo trong tế bào vi tảo Khi nhiệt độ tăng, tỷ lệ acid palmitic tăng đáng kể, tuy nhiên hàm lƣợng EPA giảm. Dƣới các điều kiện stress nhiệt độ (nhiệt độ cao hoặc thấp), vi tảo đều đáp ứng gia tăng hàm lƣợng TFA. Nhƣng hàm lƣợng của các PUFA giảm dần khi nhiệt độ môi trƣờng tăng, cụ thể là hàm lƣợng các PUFA lần lƣợt đạt 40%, 35% và 27% tƣơng ứng với các nhiệt độ 14%, 22% và 30% [31]. Trong khi đó, tại cả 3 chế độ nhiệt khác nhau, hàm lƣợng các acid palmitoleic (C16:1) và acid oleic (C18:1) thay đổi không đáng kể. Đây là hai loại acid béo lý tƣởng sản xuất biodiesel. Vấn đề chính là lựa chọn chế độ nhiệt độ nuôi cấy sao cho các loại acid béo khác chiếm tỷ lệ phù hợp với tiêu chuẩn biodiesel. Hàm lƣợng acid palmitic quá cao sẽ làm tăng điểm đông đặc của biodiesel, còn hàm lƣợng EPA quá cao sẽ làm cho biodiesel dễ bị oxy hóa. Bảng 3. 2: Thành phần acid béo (%w/w acid béo tổng) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nhiệt độ khác nhau [31] Nhiệt độ (0C) 14 22 30 TFA (mg/g DW) 88 ± 1.3 64 ± 1.7 143 ± 3.7 Acid béo C14:0 4.7 ± 0.7 4.1 ± 0.2 5.5 ± 0.5 C16:0 23.3 ± 0.9 25.4 ± 0.6 40.1 ±1.4 C16:1 21.3 ± 1.1 25.6 ± 0.6 20.5 ± 1.3 C18:0 Tr Tr 1.0 ± 0.2 C18:1 8.4 ± 0.4 7.1 ± 0.3 4.2 ± 0.2 C18:2 4.3 ± 0.1 4.8 ± 0.1 6.8 ± 0.4 C20:1 1.3 ± 0.1 1.2 ± 0.1 Tr C20:4 3.2 ± 0.6 3.4 ± 0.7 2.7 ± 0.4 C20:5 31.7 ± 1.8 25.3 ± 1.0 16.4 ± 0.4 C22:6 Tr 1.4 ± 0.2 Tr Các loại khác Tr 1.4 ± 0.2 1.7 ± 0.3 Tr: trace, giá trị vết, dƣới 1%. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 31 Bảng 3. 3: Sản lƣợng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nhiệt độ khác nhau [31] Nhiệt độ ( 0 C) Sinh khối khô (mg/L) Lipid (%w/w) Carbohydrate (%w/w) Protein (%w/w) 14 388 ± 17.8 19 ± 0.8 12 ± 0.9 55 ± 4.1 22 403 ± 15.2 9 ± 0.5 11 ± 1.0 41 ± 2.9 30 318 ± 10.8 15 ± 0.7 11 ± 0.5 44 ± 2.7 3.2.1.3. Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Nguyên liệu trong sản xuất biodiesel chính là lipid từ vi tảo. Do đó năng suất lipid là mục tiêu chính khi nuôi cấy N. oculata cho mục đích sản xuất biodiesel. Ngoài ra, thành phần các acid béo trong nguồn lipid sản xuất biodiesel là rất quan trọng. Tỷ lệ acid béo bão hòa nhiều sẽ làm cho biodiesel dễ bị lắng cặn do acid béo bão hòa có khả năng xoắn cuộn và tạo thành kết tủa, do đó nhiệt độ đông đặc của biodiesel giàu acid béo bão hòa sẽ cao. Còn khi tỷ lệ acid béo chƣa bão hòa mang nhiều nối đôi cao, biodiesel lại dễ bị oxy hóa làm thay đổi tính chất của biodiesel. Hai loại acid béo lý tƣởng nhất để sản xuất biodiesel chính là C16:1 và C18:1. Chính vì vậy trong thí nghiệm của Attilio, khi nuôi cấy N. oculata ở 250C, ta thấy hàm lƣợng acid béo bão hòa và acid béo chƣa bão hòa mang nhiều nối đôi có xu hƣớng giảm, trong khi C18:1 là một nguyên liệu rất phù hợp để sản xuất biodiesel thì lại tăng lên nhiều. Thêm vào đó, tại 250C, năng suất lipid của N. oculata tuy không khác biệt đáng kể so với mức 150C và 200C, nhƣng vẫn là đạt giá trị năng suất cao nhất. Còn trong thí nghiệm của Hanhua Hu và Kunshan Gao, ta thấy sản lƣợng sinh khối ở cả 3 nhiệt độ nuôi cấy không có sự khác biệt đáng kể, nhƣng hàm lƣợng lipid tổng khi nhiệt độ cao hay thấp thì tăng gần nhƣ gấp đôi so với ở 220C. Hàm lƣợng acid béo bão hòa tăng nhẹ khi nhiệt độ từ 140C tới 220C, nhƣng tăng mạnh khi nhiệt độ tăng từ 220C tới 300C và hàm lƣợng acid béo mang nhiều nối đôi giảm đáng kể. Vì vậy khi kết hợp kết quả của 2 thí nghiệm, ta thấy cần tăng nhiệt độ để giảm hàm lƣợng EPA trong tế bào Nannochloropsis oculata, tuy nhiên không nên tăng nhiệt độ quá cao so với nhiệt độ tối ƣu để hàm lƣợng C16:0 chỉ tăng một lƣợng nhỏ. Do đó, điều kiện nhiệt độ thích hợp nuôi cấy N. oculata nhằm sản xuất biodiesel chính là ở 250C – 270C. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 32 3.2.2. Yếu tố ánh sáng Tốc độ sinh trƣởng của tảo tự dƣỡng là một hàm không tuyến tính theo mức độ chiếu sáng. Tại mật độ dòng photon thấp, tốc độ sinh trƣởng gần nhƣ tuyến tính theo mức độ chiếu sáng; tuy nhiên, tại cƣờng độ sáng cao, tốc độ sinh trƣởng trở nên bão hòa (cân bằng) so với mức độ chiếu sáng. Các tế bào sinh trƣởng tại các mức độ chiếu sáng khác nhau có các đặc điểm sinh trƣởng khác nhau và cho thấy có sự thay đổi đáng kể trong thành phần hóa học tổng quát, hàm lƣợng sắc tố và hoạt động quang hợp [23, 65, 59, 76]. Theo kết quả khảo sát của Assaf Sukenik và Yael Carmeli về sự điều hòa hoạt động tổng hợp cá