Đồ án Sản xuất Protein có hoạt tính sinh học

ptid b.Các giai đoạn của quá trình dịch mã: Quá trinh dịch mã gồm ba giai đoạn chính : khởi đầu, nối dàiì và kết thúc • Giai đoạn khởi đầu : Trên m-RNA từ đoạn đầu 5’ đến bộ ba khởi đầu có một trình tự không mã hóa cho axitamin mà làm nhiệm vụ điều hành cho quá trình tổng hợp protein. Từ bộ ba AUG mã hóa cho methionin đến vị trí p trên tiểu đơn vị nhỏ của riboxom hình thành phức hợp là roboxom -t- RNA-Methionin. Quá trình này có sự xúc tát của các nhân tố khởi động IF các nhân tố khởi động sẽ hoạt hóa các tiểu đơn vị nhỏ của riboxom làm nó dễ kết hợp với phân tử t- RNA. Phân tử axitamin được gắn vào t-RNA theo cơ chế sau : a.a + ATP + enzym à a.a ~ AMP ~ Enzym + 2P a.a ~ AMP ~ Enzym + t-RNA à a.a ~ t-RNA + Enzym + AMP (Axitamin đươc gắn vào đầu 3’ OH của t-RNA) • Giai đoạn kéo dài sợi Polipeptic: Là sự nối thêm các aminoaxit tiếp theo mạch polipeptic đã đựoc tạo thành có sự tham gia của nhân tố kéo dài Một t-RNA mới sẽ có anti-codon tương ứng với cụm mã tiếp theo của AUG sẽ mang axitamin mới định vị tại điểm A.Tiếp theo liên kết peptic được hình thành giữa methionin và axitamin thứ hai, đồng thời liên kết este giữa t-RNA và methionin bị đứt ra.sau đó xảy ra phản ứng chuyển dịch tức t-RNA tại vị trí P đựơc giải phóng va t-RNA ở vị trí A sẽ chuyển về điểm P.Điểm A sẽ đựơc t-RNA mang axitamin mới đến định vị và phản ứng cứ tiếp tục diễn ra cho đến khi kết thúc Chú ý:Ơ riboxom có hai vị trí để gắn ,một vị trí cho aminocyl - t-RNA gọi là vùng P(Peptidy),và một vị trí khác gọi là vùng A(Aminoacyl) • Giai đoạn kết thúc : Quá trình dịch mã kết thúc khi tổ hợp được dịch chuyển đến bộ ba mang mã kết thúc (UAA,UAG,UGA) Vì các bộ ba kết thúc này không có anti-codon nên không có axitamin tương ướng Do đó không tổng hợp được nên phản ứng kết thúc c.Ripoxom “nhà máy chuyên sản xuất Protein”: Trong tế bào chất của các sinh vật có một hạt cực kỳ nhỏ bé ,nhỏ nhất trong các thành phần cấu tạo nên tế bào chất ,lọai hạt này gọi là Riboxom ,cơ quan trung tâm tổng hợp nên mọi Protein.Hạt nhỏ nhất của Riboxom là loại hạt tiểu thể có hằng số lắng 30S đến 50S (1S =1 đơn vị Swedberg =10-13cm/giây).Ở nồng độ Mg2+ tương đối cao ,hai hạt tiểu thể này gắn với nhau và tạo nên hạt Riboxom có hằng số lắng 70S Nhiều Riboxom cùng thực hiện dịch mã trên một sợi m-RNA .Sau khi m-RNA được gắn vào Riboxom và thực hiện 1quá trình phiên mã được một đoạn khoảng 80 Nucleotid thì các Riboxom khác có thể gắn vào đầu phía sau và cùng hực hiện dịch mã .Nhờ vậy tốc độ tổng hợp Protein tăng lên đáng kể (trong sợi m-RNA có thể có tới 20 Riboxom ) d.Những sai sót trong quá trình tổng hợp Protein : Trong quá trình tổng hợp Protein có thể có sự sai sót nhất định .Các nhà khoa học cho thấy có thể xảy ra hai truờng hợp: -Trong tế bào có các Aminoaxit rất khác nhau về cấu trúc thì sự nhận biết chúng và lắp ráp chúng ít khi có sự sai sót . -Trong bào tương có một số aminoaxit có cấu trúc giống nhau có thể dẫn tới sự sai sót trong quá trình lắp ráp các Aminoaxit trong phần tử Protein.Tỉ lệ sai sót có thể là 1/3000 .Tỷ lệ sai sót này tăng theo tuổi thọ của cơ thể. 5. Nguồn thu protein: Protein có thể thu từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật. Căn cứ vào chức năng của protein trong các cơ quan của cơ thể có thể phân thành ba nhóm sau: -Protein cấu trúc như keratin, colagen. -Protein có hoạt động sinh học như là enzim rồi đến hóc môn (như insulin, somatotrophin) protein cơ rut (như miozin, acitin) protein vận tải (như hemoglobin, mioglobin ), protein dự trữ (như ovalbumin, gliadin, zein ) hoặc đối với vi sinh vật (như một số khán sinh ) hoặc một số chất phản dinh dưỡng (như các chất kìm hãm tripxin ) -Protein thực phẩm không hình thành nhóm riêng biệt nhưng nói chung bao gồm các protein có mùi dễ chiûu đối với tiêu hóa và không độc đối với người Về mặt sinh lý, thiếu protein dẫn tới giảm thể trọng. Hằng ngày cơ thể người trưởng thành có tới hàng trăm tỷ tế bào chết và cần thay thế. Thiếu protein thì trước hết protein của gan , máu và chất nhầy như mật, ruột được huy động để bù đắp. Vì vậy thiếu protein lâu dài sẽ dẫn đến suy gan, số lượng khán thể trong máu giảm đi, sức đề kháng của cơ thể đối với bệnh bị yếu.Protein là một thành phần quý nhưng mà hay thiếu trong thức ăn. Xét cho đến cùng thì vấn đề thiếu protein trong thức ăn lại là do thiếu các “ viên gạch “ axitamin không thể thay thế. Khi tính hàm lượng protein ở một số sản phẩm như các loại đậu, nấm, men... ta có thể thấy lượng protein chung khá lớn. Nhưng lượng lớn này cũng chưa có thể là các loại thức ăn hoàng toàn có giá trị và thích hợp. Ví dụ: người ta đã thấy rằng sữa mẹ không chứa nhiều protein nhưng thành phần axitamin của nó lại là tốt nhất, vì vậy cho nên người ta thường lấy protein sữa mẹ làm mẫu tiêu chuẩn. Các sản phẩm có nguồn gốc động vật như sữa bò, thịt, trứng cũng có thành phần axitamin cân đối, tốt và có giá trị dinh dưỡng cao. Nói chung, lượng protein ở sản phẩm động vật khá cao, còn ở thực vật thì trừ đậu tương và các loại đậu đỗ khác, còn các sản phẩm khác đều có hàm lượng protein tương đối thấp so với các sản phẩm động vật Đối với protein có nguồn gốc thực vật thì thường thường hàm lượng các axitamin không thể thay thế có ít. Ví dụ: ở bột mì có ít lizin, ở nấm men có ít methionin và lơxin, ở một số loại đậu không đủ triptophan và methionin. Còn trong đậu tương thì lượng lơxin có ít. Vì thế muốn tạo được protein có giá trị cao thì người ta có thể thêm các” viên gạch” axitamin không thay thế (triptophan, lizin, methionin ) vào protein có nguồn gôc thực vật mặc dù thành phần axitamin không thay thế của thức ăn là vô cùng quan trọng, nhưng các axitamin thay thế cũng cần thiết ở mức độ nhất định đối với cơ thể và khi sử dụng nên đưa vào cơ thể cùng một lúc thì mới lợi dụng chúng được triệt để nhằm tổng hợp protein miễn phí. Như ta đã biết, trong thức ăn ngoài chất béo, gluxit, vitamin các muối khoáng chất gia vị thì protein là phần quý hiếm nhất. Đó là nguồn nitơ duy nhất cho người và động vật. Trong 20 axitamin thì có 8 axitamin không thay thế đối với người lớn (hoặc 9 đối với trẻ em, 10 đối với lợn, 11 đối với gia cầm ). Nếu thiếu các axitamin thì có thể bị bệnh mà chết. Về nhu cầu protein của người nhiều nhà nghiên cứu cho biết khoảng 100g/ngày, có số liệu cho là 80g/ngày. Còn các nhà dinh dường thì đề nghị cứ 1kg thể trọng của người lớn cần cung cấp 1g protein. Đều đáng nói ở đây là tốc độ tăng sản lượng lương thực thực phẩm như hiện nay không kịp với tốc độ tăng dân số. Hiện nay loài người đang gặp khó khăn lớn về lương thực thực phẩm và điều quan trọng nhất là đang đói protein. Theo nhiều số liệuđã công bố thì hai phần ba nhân loại đang bị tai họa thiếu protein ở các mức độ khác nhau. Các nước châu phi, châu Mỹ latinh và nhiều nước châu Á đang đói protein một cách có hệ thống cả về lượng lẫn về chất. Theo tính toán của FAO nhu cầu protein trên thế giới đã tăng lên 42 triệu tấn. Nguồn cung cấp protein chủ yếu hiện nay của loài người là sản phẩm của hai ngành trồng trọt và chăn nuôi.Về ngành trồng trọt thì mở rộng diện tích và thâm canh cây trồng, khả năng này cũng rất to lớn. Còn để thu protein trong động vật thì con người quan tâm đến hai hướng là khai thác hải sản và chăn nuôi công nghiệp. Các hải sản là nguồn protein phong phú có thể cung cấp cho người (trong tương lai, đại dưiơng sẽ bị ô nhiễm nặng do sự phát triển của công nghiệp và biển cũng như do tàu bè đi lại ), đáng chú ý là trong các hải sản chính, cá đực dành một phần lớn để chế biến bột các cung cấp cho ngành chăn nuôi(hàng năm số lượng bột cá sản xuất khoảng 5 triệu tấn ).Muốn đưa chăn nuôi thành một ngành sản xuất có tính chất công nghiệp thì một trong những nhiệm vụ hàng đầu là giải quyết thức ăn gia súc hỗn hợp , trong thức ăn này cần phải có tỷ lệ thích đáng về protein. Các nguồn protein ở đây có thể là bột ngũ cốc , tấm cám, các loại khô dầu(lạc, đậu, tương..), các loại bột cỏ, bột xương, bột cá và các loại sinh khối vi sinh vật. Có đảm bảo nhu cầu về protein trong khẩu phần thức ăn, gia súc gia cầm mới đủ sức tăng trọng và đưa năng suất chăn nuôi đến mức cao. Các gia súc gia cầm khác nhau chỉ có khả năng hoàn lại cho người một phần nhỏ lượng protein mà người cung cung cấp cho chúng, thường chỉ 15-25% ở dạng thịt và khoảng 30% ở dạng sữa. Còn phần lớn protein trong khẩu phần được sử dụng cho nhu cầu riêng của gia súc. Như vậy 70-85% protein mất đi không bù lại cho người. Trong việc giải quyết việc thiếu protein hiện nay, người ta chú ý nhiều đến con đường tổng hợp nhờ vi sinh vật. Cơ sở khoa học của biện pháp này là, lợi dụng khả năng sinh trưởng nhanh của vi sinh vật và sự phong phú về protein, cũng như các axitamin hợp phần của nó trong tế bào vi sinh vật là nguồn cung cấp protein cho gia súc và tương lai sẽ làm thức ăn cho người. Sản xuất protein từ vi sinh vật có các ưu điểm sau: -Thu hoạch đơn giản dễ dàng -Ít tốn diện tích nuôi cấy -Tốc độ sinh sản của vi sinh vật cao, đồng thời tốc độ sinh tổng hợp protein trong tế bào vi sinh vật cũng rất cao có thể từ 100-1000 so với bò. Qua thực tế người ta thấy rằng muốn có 1 tấn protein cần phải trồng 4 hecta đậu tương trong 3 tháng, hoặc nuôi 40 con bò trong 15-18 tháng, nhưng chỉ cần nuôi sinh vật trong nồi lên men dung tích là 300m 3trong 24giờ -Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, quá trình nuôi cấy được tiến hành trong nồi lên men lớn dễ dàng ổn định các điều kiện kỹ thuật bằng các hệ thống điều khiển tự động. -Có thể phân lập và lựa chọn được các chủng vi sinh vật có ích và thích hợp cho các quy trình công nghệ, cho từng loại nguyên liệu tương đối nhanh và dễ dàng -Hầu hết hợp chất chứa cacbon trong tự nhiên điều có thể sử dụng làm nguồn cơ chất ban đầu để sản xuất protein -Thành phần axitamin trong protein có thể điều khiển được bằng cách thay đổi thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy hoặc bằng cách tác động làm thay đổi cơ cấu di truyền của chủng giống Hiện nay nhiều nước trên thế giới đang ráo riết tập trung nghiên cứu sản xuất protein bằng con đường vi sinh vật, trước hết theo các hướng sau đây: -Nghiên cứu các phương pháp thu sinh khối rẻ nhưng có giá trị dinh dưỡng cao -Nghiên cứu phương pháp thu thức ăn gia súc từ axit cacbonnic với việc sử dụng các vi sinh vật trợ dưỡng -nghiên cứu khả năng sản xuất thức ăn rẻ từ xenlulose -Nghiên cứu phương pháp lên men trên hydrocacbua thuộc dãy parafin và khí thiên nhiên nhờ các vi sinh vật. Ở Anh hầu như toàn bộ các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực này điều tập trung vào lĩnh vực sản xuất protein từ vi sinh vật, để có thể thu được một loại protein mà về giá trị dinh dưỡng có thể cạnh tranh được với nguồn protein bột cá và đậu tương. Nhiều nước khác đang nghiên cứu chiết tách protein từ tế bào vi sinh vật để sử dụng trực tiếp làm thức ăn cho người thông qua con đường làm thức ăn tổng hợp và nhân tạo. Liên xô đẫ thành công trong việc chế trứng cá nhân tạo từ protein nấm men, ở Mỹ, Nhật.. người ta chế thịt giả, batê từ các nguồn nguyên liệu này. PHẦN II: PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC(INSULIN và SOMATOPHINE) Ở các bệnh di truyền thưòng có biểu hện thiếu hụt hay mất hẳn một Protein quan trọng do gen bị bất hoạt .Trong khi chờ đợi liệu pháp gen phát triển đủ để thay thế gen bệnh bằng gen lành ,biện pháp điều trị duy nhất hiện nay là cung cấp cho bệnh nhân Protein bị thiếu.Giải pháp tối ưu là sử dụng có nguồn gốc từ người thì hiện nay đang vất phải những khó khăn lớn về số lượng và chất lượng • INSULIN : trước đây được trích từ tuyến tụy bò ,lợn đôi khi gây ra dị ứng cho một số người. Trong cơ thể nguời được tổng hợp dưới dạng Proinsulin gồm ba chuỗi polipeptic A,B,C .Khi proinsulin chuyển thành insulin, chuỗi C được loại bỏ, hai chuỗi A và B nối với nhau bởi hai cầu disunfua(-S-S) .Bằng kỷ thuật DNA nguời ta đã tạo dòng riêng biệt gen mã hóa chuỗi A và B trong pBR322 .Các véctơ tải tổ hợp được đưa vào vi khuẩn và hai loại Polipeptit được thu nhận riêng .Sau đó người ta trộn chúng lại và xứ lý hóa học để tạo cầu nối disunfua giữa chúng . • SOMATOPHINE :là hoocmon tăng trưởng người (HGH-humangrow hormone) Dùng để chữa bệnh lùn do rối loạn tuyến yên ,chỉ có tác dụng khi có nguồn gốc từ người .Trước kia HGM được lấy từ tuyến yên của người chết nhưng do số lượng rất nhỏ nên không đáp ứng đủ nhu cầu .Người ta đã tạo dòng c.DNA HGH gắn với một promoter mạnh (giúp tăng cường biểu hiện của gen) rồi đưa vào pBR322.Véctơ tái tổ hợp sau đó được đưa vaò E.coli và HGM sẽ được thu nhận lại sau quá trình nuôi cái vi khuẩn Để hiểu rõ hơn về các protein có hoạt tính sinh học này ta cần phải biết một số kiến thức cơ bản sau 1.Thế nào là tuyến nội tiết, ngoại tiếtvà hoomon ? Các tuyến nước bọt ,tuyến tụy ,tuyến nhờn ,tuyến mồ hôi đều có ống dẫn đưa chất tiết ra từ tuyến ra ngoài gọi là tuyến ngoại tiết .Ngoài các tuyến đó ,trong cơ thể còn có những tuyến mà các chất tiết ra được ngấm thắng vào máu,đua đến các tế bào hoặc các cơ quan trong cơ thể ,được gọi lá tuyến nội tiết ;đó là tuyến yên tuyến giáp,tuyến phó giáp,tuyến trên thận .Ngoài ra còn có những tuyến ngọai tiết,vưà là tuyến nội tiết như là tuyến tụy ,tuyến sinhh dục . Ơ đây ta chỉ cần nghiên cứu tuyến tụy và tuyến yên .Vì đây là tuyến mà các hoomon insulin và somatotrophine được tríh ra từ đó . • Tuyến yên : Tuyến yên nằm trong hoc xương ở nền hộp sọ ,là một tuyến nhỏ bằng hạt đậu màu trắng,nặng 0.5± 0.7;gắn với não bởi một cuống nhỏ Tuyến yên gồm 3 thùy :Thùy trước,thùy giữa va thùy sau .Mỗi thùy có thể coi là một tuyến nội tiết riêng .Tuyến yên là một tuyến quan trọng nhất trong các tuyến nội tiết nhiều hoomon khác nhau. -Thùy trước tiết các hoomon có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng ,sự tăng đuờng huyết và kích thích sự hoạt động của các tuyến nội tiết khác(tuyến giáp ,tuyến trên thận,tuyến sinh dục...).Đáng chú ý là hoomon tăng trưởng ,hoomon này tiết quá nhiều sẽ làm cho người quá khổ ,ngược lại nếu thiếu hoomon này trẻ em sẽ chậm lớn hoặc ngừng lớn trở nên lùn. -Thùy sau tiết ra các hoomon có ảnh hưởng đến sự trao đổi nước trong cơ thể ,sự co thắt các cơ trơn đặc biệt là các cơ quan ở thành dạ con ,có loại hoomon lại gây cơ mạnh làm tăng huyết áp -Thùy giữa thường phát triển ở trẻ nhỏ ,đến khi người trưởng thành hầu như giảm.Hoomon của thùy này có ảnh hưởng lên sự phân bố sắc tổ da • Tuyến tụy: Ngoài các tế bào tiết dịch tiêu hóa(dịch tụy) theo ống dẫn đổ vào tá tràng ,tuyến tụy còn có những tế bào tập trung thành những tế bào gọi là đảo Langhêram tếit ra các hoomon Insulin và glucagôn ,có tác dụng đối lập nhau giữ cho nồng độ glucose trong máu luôn luôn ổn định. Khi lượng glucose tăng quá 0.12% thì insulin được tiết ra để biến đổi glucose thành glicôgen dữ trữ ở gan và cơ .Nếu luơng glucô trong máu giảm xuống quá mức bình thường thì glucogôn do tuyến tụy tiết ra có tác dụng biến đổi glucogen thành glucose để nâng nông độ glucose trong máu lên như cũ Ngày nay ngươì ta đã điều chế đuợc insulin nhân tạo để chữa bệnh đái đường do rối loạn hoạt động của tuyến tụy .Ơí những người bị bệnh này lượng insulin tiết ra ít do đó lượng đường trong máu luôn vượt mức giưới hạn .Thận không giữ được glucose nên khi đãi sẽ đựoc thái ra ngoài .Bệnh nặng thì người bệnh có thể chết • Hoocmon: Hoocmon là những hợp chất hữu cơ được tạo thành trong cơ thể,có tác dụng như những tín hiệu giữa các tế bào trong toàn bộ cơ thể. Hoocmon là sản phẩm tiết ra của tuyến nội tiết,có một số tác dụng chính sau đây: -Aính hưởng đến tốc dộ sinh tổng hợp enzym và proten - Aính hưởng đến tốc dộ xúc tác của enzym -Thay đỏi tính thấm của màng tế bào -Điều khiển nhiều chức năng khác nhau như:tăng trưởng mô và té bào,nhịp đập tim,áp suất máu,chức năng thận,sự tiết các enym tiêu hóa và các hoocmon khác,sự tiết sữa và sự hoạt động của các hệ thống sinh sản. 2. Sơ lược công nghệ DNA tái tổ hợp và kĩ thuậtû tạo dòng: Khi các nhà khoa học đã biết rõ gen là gì,cấu trúc phân tử cảu DNA cùng chức năng của chúng,cũng như biết rõ các gen có thể được tái tạo lại do sự tổ hợp của các đoạn DNA khác nhau và có thể được chuyển tử hệ gen này sang hệ gen khác,từ té bào này sang tế bào khác mà chúng vẫn hoạt độüng với tư cách là đơn vị mã hóa,thì các nhà khoa học đã sáng tạo ra kĩ thuật DNA tái tổ hợp(Ricombinant DNA ).Kĩ thuật DNA tái tổ hợp được bắt dầu từ chọn dòng gen(gen cloning).Chọn dòng một gen nào đó bao gồm kĩ thuật tách chiết gen đó(hoặc tạo ra gen đó bằng nhiều thủ thuật) và gắn gen đó vào một vectơ và thông qua vectơ đó để chuyển gen đó vào nơi cần thiết.Vectơ thường chọn dòng là plasmid (là DNA có trong tế bào chất vi khuẩn) hoặc DNA của virut. Kĩ thuật DNA tái tổ hợp và chon dòng gen được thực hiện từ 1972 trong phòng thí nghiệm của Paul Berg tại đại học Stanford, năm 1980 ông được giải thưởng Nobel. a. Công nghệ NDA tái tổ hợp: DNA tấi tổ hợp là một DNA lai tìm được Invitro bằng cách tổ hợp 2 DNA từ hai loại khác nhau.Mục đích là để tạo dòng (là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của 1 gen hay 1 đoạn DNA ) và để tổng hợp Protêin,vacxin,hoôcmn,enzym. • Các công đoạn chính tao DNA tái tổ hợp:gồm 3 công đoan chính -Công đoạn chọn nguyên liệu: chọn véc tơ chuyển gen (thường là plasmit);chọn đoạn cài( là DNA cần tạo dòng);chọn các enzym cho quá trình(như enzym RE để cắt,enzym ligase để nối,enzym để khử và enzym để chuyển nhóm phosphat vào đầu 5`) -Công đoạn cắt vói sự tham gia của enzym cắt giới hạn RE: gồm có cắt đầu bằng hoặc đầu lệch -Công đoạn nối với sự tham gia của enzym DNA ligase: gồm có nối đầu bằng và nối đầu lệch • Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp: -phương pháp sử dùng đầu lệch -Phương pháp sử dụng đoạn nối linker -Phương pháp sử dụng enzym Termino tranferase • Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp: gồm có phưong pháp biến nạp và phương pháp tải nạp. Phương pháp biến nạp gồm có 5 phương pháp: -Phương pháp hóa biến nạp -Phương pháp điện biến nạp -Phương pháp biến nạp tế bào trần -Phương pháp bắn gen -Phương pháp vi tiêm b.Kỹ thuật tạo dòng gen: Tạo dòng là sự tách lập và thu nhận dòng vi sinh vật có cùng nguồn gốc và tổ tiên..Kĩ thuật tạo dòng về thực chất là bao gồm phải đính 1 DNA cần tạo dòng vào 1 vectơ tạo dòng bằng phương pháp hóa sinh.Sau đó đưa phân tử lai vào tế bào chủ đã chọn lựa thông qua biến nạp hoặc tải nạp nhằm thu được lượng lớn gen hoặc DNA cần thiết.Nếu tổng hợp Protein thì gen cần tạo dòng phải mã hóa sinh tổng hợp protein đó.Các bước cơ bản của kĩ thuật tạo dòng: gồm 6 bước -Chọn và xử lí DNA -Chọn và xử lí véctơ -Tạo DNA tái tổ hợp(vectơ tái tổ hợp) -Đưa vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ -Phát hiện dòng cần tìm -Phân tích, thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp(nếu sản phẩm là protein thì làm sạch bằng phương pháp lắng,lọc ,li tâm,kết tủa hoặc trao đổi ion) 3. INSULIN và SOMATOPHINE ‘’sảnphẩm của sự tạo dòng”: a. Insulin: Insulin là chất protein đầu tiên mà cấu tạo của nó đã được nghiên cứu rất chi tiết,và cấu trúc bậc nhất của nó đã được phát hiện hoàn toàn.Công trình khoa học có giá trị rất to lớn này đã được nhà hóa sinh học người Anh F.Sanger cùng với trường phái của ông ta tiến hành từ năm 1945 đến 1955.Do công trình nghiên cứu khoa học rất vĩ đại này mà Sanger đã được giải thưởng Nobel. • Cấu tạo và vai trò của Insulin: Insulin là một chất kích thích tố hay còn gọi là hoocmon có bản chất protein.Nó được hình thành trong tế bào bêta của đảo Largerrhan của tuyến tụy của người và động vật..Danh từ insulin được hình thành từ chữ la tinh insula,có nghĩa là đảo,nhằm nhấn mạnh rằng chất protein này được hình thành ở đảo Largerhan. Insulin có trọng lượng phân tử 6000 ,nó là một trong số các protêin đơn giản nhất mà người ta đã phất hiện được.Tòa nhà insulin được xây dựng nên từ 51’’ viên gạch’’ axitamin chia làm 2 tầng(2 chuổi): tầng A (chuổi A) có 30 ‘’viên gạch’’ , chuổi B (tâng B ) cos 21 “viên gạch” axitamin. Hai chuổi Avà B được nối với nhau nhờ 2 liên kết disunffua(-S-S-) mà người ta có thể hình dung là một cách cụ thể là 2 cầu thang disunfua.Ở chuổi A còn có một cầu nối disunfua nữa. Vai trò chính của insulin là điều tiết lượng đường trong máu. Ở người insulin hoàn thành máy chức năng sau: -Làm tăng việc sử dụng glucose từ máu bởi các mô cơ và các tổ chứu của gan,do đó làm tăng trữ lượng glicogen trong gan cũng như trong các bắp thịt. -Tăng cường sự oxi hóa glucose trong các tế bào -Thúc đảy sự tạo thành mỡ từ đường glucose Theo các nhà khoa học thì Insulin có chức năng như một người lính gác của thành tế bào.Khi thiếu Insulin thì glucose không thể đi qua thành tế bào được.Nó sẽ dễ dàng đi qua khi có mặt của insulin.Vận tốc tiết Insulin sẽ điều chỉnh mức đường trong máu. khi ta ăn nhiều đường ,mức đường trong máu tạm thời tăng cao.Điều này sẽ kích thích sự tiết Insulin của tuyến tụy và do đó làm giảm lượng đường trong máu.ĐóÏ là quy luật. Nếu vì một lí do nào đó mà Insulin không có mặt,ví dụ trong bệûnh đái đường,thì việc sử dụng glucose sẽ bị rối loạn nghiêm trọng và lượng thừa glucose trong máu sẽ dẫn đến hiện tượng tăng đương huyết.Trong trường hợp này htường mức đương trong máu tăng đến mức mà người ta gọi là ngưỡng thận và khi đó glucose sẽ xuất hiện ở nước tiểu,tức đi đái ra đường.Khi thiếu insulin ở thời gian đầu,điều đó cũng chưa phải là nguy hiểm lắm cho các tế bào bắp thịt và gan vì các tế bào này trong trường hợp cần thiết có thể thu năng lượng do một nguồn khác cung cấp.Tuy nhiên nếu thiếu insulin mãi mãi thì bẹnh đái đường sẽ dẫn đén nghiêm trọng,gây rối loạn sâu xa về sự trao đổi protein,trao đổi mỡ,trao đổi chất đường,trao đổi chất điện li và cân bằng axit-base trong cơ thể bị phá hủy.Cuối cùng người bệnh sẽ chết nếu không tiêm insulin vào. • Tổng hợp Insulin trong cơ thể: Trong cơ thể,insulin được hình thành ở tuyến tụy.Phân tử insulin gồm 2 sợi polipeptit (sợi A có 30 aminoaxit,sợi B có 21 aminoaxit) nối với nhau bằng cầu nối disunfua. Insulin hoạt tính này là kết quả của sự cải biên dần dần 2 phân tử tiền thân :preproinsulin và proinsulin .Gen mã hóa insulin gồm 2 exon mã hóa cách nhau bởi một intron không mã hóa.Sau khi cắt nối thì bản sao m-RNA dịch mã thành sợi polipeptit dài 108 aminoaxit gọi là sợi preproinsulin.Sợi này khi đi qua mạng lưới nội chất thì đoạn peptit tín hiệu (là đoạn đầu của preproinsulin, dài 24 aminoaxit) bi giữ lại Kết là hình thành nên sợi proinsulin (gồm 84 gốc aminoaxit).Sợi này đi vào bộ máy Gogi ,tại đây enzym cải biên loại đi 33 aminoaxit ở phần giữa của đoạn nối(tức sợi C ) và giữ lại 2 sợi A và B, được nối với nhau nhờ cầu nối disunfua.Kết quả là sợi insulin hoạt tính được hình thành ( dài 51 aminoaxit.) và đựoc giữ lại trong các hạt tiết để tiết vào dòng máu. • Sản xuất Insulin : Trước đây sự tổng hợp hóa học các chất protein được coi như một điều không tưởng,không thực tế và được coi như một mơ ước không thể nào thực hiện được.Nhưng dần dần do tiến bộ của khoa học kĩ thuật,việc tổng hợp thành công insulin và một số protein khác trong phòng thí nghiệm đã chứng minh rằng không phải bằng con đường sinh học mà bằng con đường hóa học hoàn toàn người ta có thể tổng hợp nên protêin-cơ sở của sự sống.Ngay sau khi cấu tạo của insulin được phát hiện năm 1955 thì năm 1957 thì người ta đã đặt vấn đề tổng hợp insulin bằng con đường hóa học.Đến năm 1965 thì hầu như đồng thời các nước Trung Quốc,cộng hòa liên bang Đức,Hoa Kì đã công bố hoàn thành tổng hợp nên insulin trong phòng thí nghiệm.Công việc này phải mất từ 3 đến 5 năm và phải trải qua nhiều phản ứng mới hoàn thành.Tuy nhiên các chất insulin tổng hợp bằng con đường hóa học này dều có hoạt tính thấp so với insulin tự nhiên.Ngưòi ta vẫn không hiểu nguyên nhân là tại sao.Mãi đến 1970-1971,nhà hóa sinh học người Anh ,bà Hogdkin (người đã đuợc tặng giải thưởng Nobel) mới phát hiện ra nguyên nhân này.Bằng phương pháp đồ thị rơngen,bà phát hiện thấy trong insulin tổng hợp người ta đã nói sai mất một cầu thang disunfua .Và sau khi sửa lại đúng vị trí của cầu thang này như ở tòa nhà insulin tự nhiên thì tòa nhà insulin nhân tạo cũng tăng vọt lên gần bằng hoạt tính của insulin tự nhiên.Điều này vô cùng lí thú. Đặc biệt hơn,trong lỉnh vực tổng hợp protein,người ta đã đạt đực những thành tựu vô cung rực rỡ do việc thiết kếï nên một máy tổng hợp tự động làm việc theo một chương trình định sẵn.Để xây dựng nên tòa nhà insulin thì chỉ cần 3 tuần lễ,trong khi đó với sức người và với phương pháp cổ điển phải mất từ 3 đến 5 năm..Cũng cần nói thêm rằng việc tổng hợp nhân tạo các chất protein là một bước tiến rất dài rất quan trọng trong chặng đường tiềm hiểu bí ẩn của sự sống. Ngày nay người ta đã sản xuất insulin bằng phương pháp tạo dòng, dần đáp ứng nhu cầu của con người cả về số lượng lẩn chất lượng.Công ti Eli Lilly đã sản xuất thành công insulin bằng phương pháp tạo dòng năm 1979.Kĩ thuật tạo dòng insulin gồm các bước cơ bản sau: -Tổng hợp gen tái tổ hợp ra sợi A -Tổng hợp gen tái tổ hợp ra sợi B -Gắn DNA của sợi A và B vào plasmid đặc biệt -Đưa plasmid vào E.coli -Tiến hành nuôi cấy (nhân dòng gen) -Tách và làm sạch sợi A và B -Ủ hai sợi A và B theo đúng tỉ lệ trong điều kiện nhất định để tạo cầu nối disunfua. b. Somatotrophine: Người ta hay gọi những người có tầm vóc rất nhỏ là những người lùn,nhưng giưã người lùn và người tí hon có sự khác nhau.Ngườ