Đồ án Tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme bromelain từ dứa

MỤC LỤC

TRANG

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2

1.2.1. Mục tiêu cụ thể 2

1.3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 2

1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

1.4.1. Nghiên cứu lý thuyết 3

1.4.2. Nghiên cứu thực nghiệm 3

1.5. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

2.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA 4

2.1.1. Lịch sử và sự phát triển của cây dứa 4

2.1.2. Thành phần dinh dưỡng trong dứa 5

2.1.3. Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain 6

2.1.3.1. Quả 6

2.1.3.2. Thân 6

2.1.3.3. Lá 6

2.1.3.4. Rễ 6

2.2. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME 7

2.3. ENZYME PROTEASE 8

2.3.1. Giới thiệu sơ lược các enzyme protease 8

2.3.1.1. Protease vi sinh vật 8

2.3.1.2. Protease động vật 9

2.3.1.3. Protease thực vật 10

2.3.2. Ứng dụng của enzyme protease 10

2.4. ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA 11

2.4.1. Giới thiệu enzyme bromelain 11

2.4.2. Tính chất vật lý của enzyme bromelain 11

2.4.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain 12

2.4.3.1. Cấu tạo hoá học 12

2.4.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain 13

2.4.4. Hoạt tính của enzyme bromelain 13

2.4.4.1. Cơ chế tác động 14

2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain 14

2.4.5. Ứng dụng của enzyme bromelain 16

2.4.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm 16

2.4.5.2. Trong y dược học 17

2.4.5.3. Một số enzyme bromelain thương mại 17

2.4.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 18

2.4.6.1. Nghiên cứu trong nước 18

2.4.6.2. Nghiên cứu ngoài nước 18

2.5. KĨ THUẬT CƠ BẢN CHUẨN BỊ DỊCH PROTEIN THÔ 19

2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN 19

2.6.1. Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác nhau 19

2.6.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ 20

2.6.3. Tủa bằng điểm đẳng nhiệt 20

2.6.4. Tủa bằng các loại polymer 20

2.6.5. Tủa bằng các chất đa điện phân 21

2.7. SỰ CỐ ĐỊNH ENZYME 21

2.7.1. Định nghĩa enzyme cố định 21

2.7.2. Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định 21

2.7.2.1. Ưu điểm 21

2.7.2.2. Nhược điểm 22

2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định 22

2.7.4. Các phương pháp cố định enzyme 23

2.7.4.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định 23

2.7.4.2. Phương pháp hấp thụ vật lí 24

2.7.4.3. Phương pháp nhốt 24

2.7.4.4. Phương pháp khâu mạch 25

2.7.5. Đặc điểm, tính chất của Natrialginate 25

2.7.6. Ứng dụng của enzyme cố định 26

2.7.6.1. Trong công nghiệp 26

2.7.6.2. Trong y học 26

2.7.6.3. Trong nghiên cứu khoa học 27

2.7.6.4. Trong bảo vệ môi trường 27

2.7.7. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 27

2.7.7.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 27

2.7.7.2. Tình hình nghiên cứu nước ngoài 28

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

3.1. VẬT LIỆU 29

3.1.1. Chế phẩm enzyme thô 29

3.1.2. Hóa chất 30

3.1.3. Thiết bị 30

3.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 31

3.2.1. Chiết thô enzyme từ chế phẩm dứa 31

3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme thô 32

3.2.2.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 33

3.2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano 35

3.2.3. Tách enzyme bằng các phương pháp tủa bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton(CH3COCH3) 39

3.2.3.1. Nguyên tắc 39

3.2.3.2. Phương pháp thí nghiệm tủa enzyme bằng cồn 960 39

3.2.3.3. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng muối Ammonium sulfate 40

3.2.3.4. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng aceton 41

3.2.4. Phương pháp xác định tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4¬)2SO4 và tỉ lệ aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain 42

3.2.5. Phương pháp xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme bromelain. 42

3.2.5.1. Xác định pH tối ưu cho hoạt động của bromelain 42

3.2.5.2. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của bromelain 42

3.2.5.3. Khảo sát độ bền nhiệt 43

3.2.6. Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt 43

3.2.6.1. Tạo dung dịch Natrialginate 3% 43

3.2.6.2. Tiến hành cố định 43

3.2.6.3. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định 43

3.2.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate. 44

3.2.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH 44

3.2.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 45

3.2.7.3. Khảo sát độ bền nhiệt 45

3.2.8. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate 45

3.2.9. Bước đầu tinh sạch enzyme bromelain chồi dứa bằng sắc ký lọc gel 46

3.2.9.1. Nguyên tắc 46

3.2.9.2. Thiết bị và hóa chất 46

3.2.9.3. Các bước tiến hành 47

3.2.9.4. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 49

3.2.10. Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di SDS - PAGE 49

3.2.10.1. Nguyên tắc 50

3.2.10.2. Thiết bị và hóa chất 50

3.2.10.3. Phương pháp 52

3.2.10.4. Xác định trọng lượng phân tử của protein 54

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 55

4.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN DỊCH CHIẾT THÔ CÁC BỘ PHẬN TRÊN QUẢ DỨA. 55

4.2. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ CỒN 960 56

4.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là cồn 960 56

4.2.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa cồn với tỉ lệ 1 dứa : 4 cồn 58

4.2.2.1. pH tối ưu 58

4.2.2.2. Nhiệt độ tối ưu 59

4.2.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt 60

4.3. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ MUỐI AMMONIUM SULFATE 61

4.3.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là muối Ammonium sulfate ((NH4¬)2SO4) 61

4.3.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa muối với nồng độ 60% 62

4.3.2.1. pH tối ưu 62

4.3.2.2. Nhiệt độ tối ưu 63

4.3.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt 64

4.4. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ ACETON (CH3COCH3) 66

4.4.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là aceton (CH3COCH3) 66

4.4.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa aceton với tỉ lệ 1 dứa : 5 aceton 67

4.4.2.1. pH tối ưu 67

4.4.2.2. Nhiệt độ tối ưu 68

4.4.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt 69

4.5. SO SÁNH VIỆC TỦA ENZYME BROMELAIN TRONG CỒN 960, MUỐI AMMONIUM SULFATE VÀ ACETON 70

4.6. CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TRÊN NATRIALGINATE 71

4.6.1. Kết quả quá trình cố định enzyme bromelain trên chất mang Natrialginate 71

4.6.2. Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme bromelain trên gel Natrialginate 71

4.6.3. So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định 72

4.6.4. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH, nhiệt độ và độ bền nhiệt 72

4.6.4.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo pH 72

4.6.4.2. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo nhiệt độ 74

4.6.4.3. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo độ bền nhiệt 75

4.6.5. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate 76

4.6.6. So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu trước khi cố định và enzyme cố định trên Natrialginate 78

4.7. TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100 79

4.7.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước khi tinh sạch 79

4.7.2. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel với các thông số 79

4.7.3. Tinh sạch enzyme đã tủa với cồn 960 79

4.7.4. Tinh sạch enzyme đã tủa với muối Ammonium sulfate 80

4.7.5. Tinh sạch enzyme đã tủa với aceton 82

4.7.6. So sánh kết quả giữa chế phẩm enzyme thô và dịch enzyme sau khi đã qua quá trình sắc ký lọc gel 83

4.8. KẾT QUẢ PHÂN TÁCH HỆ ENZYME BROMELAIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS - PAGE 84

4.8.1. Thành phần mẫu điện di 84

4.8.2. Kết quả điện di 84

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 87

5.1. KẾT LUẬN 87

5.2. KIẾN NGHỊ 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO I

PHỤ LỤC III