Đồ án Thao tác kỹ thuật trên Saccharomyces Cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

,7 x 39-8,9 m. Sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu từ mật rỉ. Có khả năng lên men rượu rất tốt, đồng thời có đặc tính lên men bánh mì cao. Chủng M (thu được vào 1905) do Ghenebec. Bền và ổn định, thích nghi được những điều kiện không bình thường trong thực tế sản xuất. Sinh sản nhanh và hiệu suất lên men tương đối tốt Lên men trong môi trường chứa các hỗn hợp đường khác nhau. 2.4.Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu. Quá trình lên men là quá trình phức tạp trong đó có sự biến đổi quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của nấm men. Quá trình chuyển hóa nguồn nguyên liệu thành sản phẩm chính trong lên men rượu là ethanol và CO2, ngoài ra trong quá trình lên men còn tạo ra nhiều sản phẩm hữu cơ khác có khả năng ảnh hưởng tới chất lượng của rượu vang. Do đó hiểu rõ những cơ sở khoa học trong quá trình lên men sẽ giúp cho việc điều khiển quá trình lên men xảy ra theo chiều hướng có lợi. Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [6]. Quá trình lên men rượu thực chất là một quá trình chuyển hóa đường thành rượu etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác.Quá trình chuyển hóa từ đường hexose đến rượu etylic và CO2 có thể biểu diễn theo phương trình tổng quát của Gay-Lussac [5]. Hình 2.4.2: Quá trình chuyển hóa glucose thành ethanol [31]. C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 + Q Theo phương trình thì khi lên men sẽ tạo ra 2 phân tử rượu etylic và 2 phân tử CO2. Theo lý thuyết thì hiệu suất thu hồi rượu là 51,1% so với hexose và 53,8% đối với maltose hoặc saccharose[5]. Năm 1857, Louis Pasteur đã công bố kết quả nghiên cứu của mình và kết luận: Sự phân giải đường thành rượu và CO2 trong điều kiện yếm khí, cứ 100% glucose sẽ tạo thành 51,1% C2H5OH và 49,4% CO2, 3,2 acid succinic và khoảng 1% các sản phẩm khác[39]. Quá trình lên men được thực hiện qua một chuỗi phản ứng rất phức tạp và liên quan đến quá trình phosphoryl hóa các hợp chất hữu cơ. Toàn bộ quá trình này được thông qua chu trình Embden-Meyerhof. Trong đó, đáng chú ý là sự tham gia của ATP trong quá trình chuyển hóa glucose thành rượu etylic: C6H12O6 + 2ATP + 2H3PO4 + 4ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ADP + 4ATP Năng lượng tích lũy trong liên kết ATP chính là nguồn năng lượng cung cấp cho hoạt động của nấm men. Và đây cũng là nguồn năng lượng làm tăng nhiệt độ của dịch lên men trong quá trình lên men.Xét về mặt hóa học, sự lên men rượu có thể chia thành 2 thời kì: thời kì cảm ứng và thời kì tĩnh. Thời kì cảm ứng: Ở giai đoạn này, chất nhận H của enzyme alcohol-dehydrgenase là acetaldehyde được tạo chưa đầy đủ. Do đó, enzyme sẽ chuyển H đến cho andehyde phophateglycerinic. Dưới tác dụng của enzyme phosphatase, phosphateglycerin bị thủy phân để tạo thành glycerin. Như vậy trong môi trường sẽ hình thành glycerin và CO2. Thời kì tĩnh: Đến lúc này, lượng acetaldehit là cơ chất bình thường của enzyme alcohol-dehydrogenase được tạo thành đã có nhiều, nên enzyme sẽ chuyển H đến cho cơ chât của nó, rượu etylic và CO2 được hình thành từ đây. Trong môi trường acid, glycerin là sản phẩm phụ chỉ được tạo ra trong thời kì cảm ứng.Thực tế cho thấy rằng, sự lên men chỉ xảy ra một cách bình thường cho sản phẩm chủ yếu là rượu và một số sản phẩm phụ khác như glycerin, acid hữu cơ, chỉ trong điều kiện pH của môi trường từ 4-5 và môi trường yếm khí, sự lên men xảy ra mới mạnh mẽ nhưng khi đó sự phát triển của nấm men có thể bị kìm hãm, do điều kiện yếm khí nên lượng Oxy không cung cấp đủ cho quá trình gia tăng sinh khối. Khi có không khí thì sự lên men sẽ yếu dần đi và nấm men thu nhận năng lượng của cần thiết để phát triển theo con đường hô hấp hiếu khí bằng cách oxy hóa glucose để chuyển thành CO2 và H2O. hiện tượng kìm hãm sư lên men rượu dưới ảnh hưởng của oxy được gọi là hiệu ứng pasteur[5]. Con đường chuyển hóa từ đường glucose đến sản phẩm ethanol theo chuỗi phản ứng của chu trình EMP(Embden-Meyerhof pathway) và chi phối bởi các enzyme pyruvate decarboylase và enzyme alcohol dehydrogenase: 2.5.Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men rượu. 2.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ : Trong công nghiệp lên men yếu tố nhiệt độ được đánh giá là nhân tố quan trọng từ khi bắt đầu đến khi kết thúc quá trình lên men. Ngày nay đã có rất nhiều nghiên cứu xem xét tác động của nhiệt độ đối với quá trình lên men. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nhiệt độ tối ưu trong quá trình lên men của nấm men saccharomyces là khoảng 28 – 320C. Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Ở nhiệt độ 300C nấm men thuần phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 -380C chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần. Khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester, aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng. Hình 2.5.1: Tác động của nhiệt độ lên mật độ tế bào: (□) 15oC, (◊)20oC,(●) 25oC, (∆) 30oC, (▼) 35oC [28]. Nhiệt độ có tác động đến những quá trình trao đổi chất của tế bào và đặc tính của nấm men trong quá trình tạo ra lượng ethanol( Bảng: 2.4 ). Điều này yêu cầu sự hiểu biết trong việc tìm hiểu những chủng nấm men đáp ứng yêu cầu và sự kiểm soát nhiệt độ phụ thuộc những quá trình sinh lý học khác nhau, và chiều hướng thay đổi sự trao đổi chất của nấm men. Việc lên men ở nhiệt độ thấp trở thành một ứng dụng quan trọng trong công nghiệp sản xuất rượu vang, một mặt nào đó nó có tác dụng đến quá trình sinh trưởng của tế bào, bởi vì chúng làm tăng khả năng chịu stress của nấm men trong suốt quá trình lên men. Bảng 2.4: Tác động của điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình lên men [28]. Nồng độ(g/l) 15oC 20oC 25oC 30oC 35oC Ethanol 93.60±0.56 93.04±0.88 90.00±0.00 89.60±0.00 79.52±0.08 Glycerol 6.05±0.11 6.59±0.07 6.91±0.11 7.18±0.02 7.38±0.08 Acetaldehyde 0.05±0.00 0.09±0.01 0.04±0.00 0.04±0.00 0.02±0.00 Acid Succinic 0.74±0.06 0.89±0.04 0.77±0.06 0.92±0.08 0.70±0.03 Acid Acetic 0.08±0.01 0.13±0.01 0.14±0.00 0.13±0.01 0.22±0.04 Tổng sản phẩm 100.52 100.74 97.86 97.87 87.84 CO2 89.53 88.99 86.08 85.70 76.06 Tổng sản phẩm+ CO2 190.05 189.73 183.94 183.57 163.90 Ethanol nấm menα 47.51 47.23 45.68 45.48 40.36 α : ethanol tạo thành(g/l) x 100/ nồng độ đường ban đầu(g/l). Sự ảnh hưởng trong quá trình lên men ở chế độ nhiệt độ thấp chính là sự kéo dài trong pha lag và điều này thúc đẩy nhiều nghiên cứu nhằm rút ngắn quá trình này đó là sử dụng những chủng nấm men khô qua quá trình làm ướt. Những phân tích ở cấp độ phân tử đã cho thấy những minh chứng về khả năng tế bào nấm men thích ứng với những điều kiện stress sau khi có sự biến đổi đột ngột về nhiệt độ[11]. Việc lên men tại những điều kiện nhiệt độ khác nhau dẫn đến sự sinh trưởng của nấm men cũng hoàn toàn khác nhau.Việc sử dụng chửng Saccharomyces cerevisiae EC1118 ở diều kiện nhiệt độ là 15oC và 30oC đã cho thấy những thay đổi đáng kể của nấm men với các điều kiện stress về nhiệt độ. Một trong những tác động có ảnh hưởng lớn nhất tới quá trình lên men ở nhiệt độ thấp là là sự ảnh hưởng của quá trình trao đổi Nitơ. Mặc dù trong suốt quá trình đã được cung cấp 1 hàm lương amoniac là như nhau nhưng kết quả cho thất lượng sinh khối tạo ra ở 15oC ít hơn lượng sinh khối tạo ra ở 30oC và các chủng nấm men công nghiệp biểu hiện tốt hơn so với chủng nấm men trong phòng thí nghiệm. Bảng 2.5 : Sự tác động của yếu tố nhiệt độ lên quá trình lên men rượu trên chủng Saccharomyces cerevisiae. Nhiệt độ Tác động có lợi trong lên men Tác động có hại trong lên men 28-32oC Khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men rượu[5,11]. Tổn thất do tạo men khá cao. Ở 29,5oC là 7,37%[2]. 32-35oC Thời gian lên men nhanh, hàm lượng sản phẩm phụ cao tăng giá trị tạo hương vị cho sản phẩm[5]. Lượng tế bào chết tăng, mất cân bằng. Hoạt tính nấm men giảm theo thời gian[5]. 20-22oC Hạn chế tạp khuẩn trong môi trường lên men. Tổn thất trong quá trình lên men vẫn còn ở mức cao. 10-18oC Ổn định chất lượng sản phẩm, tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm[3,11,7]. Tổn thất do tạo men giảm dần khi giảm nhiệt độ lên men ở 17,5oC là 5,32%, ở 10oC là 4,42%[2].Yếu tố nguy hại có thể tồn tại ở mức độ cao[11]. 4oC Ổn định chất lượng sản phẩm. Giữ được hương vị đặc trưng cho sản phẩm trong khi bảo quản[19]. Nấm men hầu như không phát triển trong điều kiện nhiệt độ lạnh. Nấm men chỉ được phát hiện sau 50 giờ lên men[19]. Hình 2.5.2: Sự sinh trưởng của nấm men S. cerevisiea S228C trong môi trường YPD ( độ hấp thụ) theo ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: (♦), 35oC; (○), 25oC; (■), 15oC; (▲), 4oC [19]. 2.5.2. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men và tác động của các acid lên sự thay đổi pH. 2.5.2.1 Ảnh hưởng của pH lên quá trình lên men. Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt ở một pH nhất định. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo rượu ethylic là 4,5 – 5,0. Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8 – 5,2; nhằm giữ cho amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột và dextrin thành đường lên men được. Tăng pH sẽ dễ bị nhiễm khuẩn; glycerin tạo nhiều hơn và giảm hiệu suất lên men. Vì vậy, khi tạo men giống trong điều kiện sản xuất, cần điều chỉnh pH tới 3,8 – 4,0 để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn lactic và nấm men có hại. Ở pH 4,2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH = 4,5 – 5,0 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển. Tới lúc nào đó nấm men phát triển nhiều và đủ mạnh tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh hơn. Lúc này điều kiện cũng tốt cho các tạp khuẩn nhưng vì nấm men đã nhiều và đủ mạnh để lấn át nên tạp khuẩn cũng khó gây tác hại cho lên men. Phương pháp này được áp dụng để gây men trong điều kiện sản xuất và gọi là nuôi cấy nấm men thuần khiết tự nhiên.Khi cho acid sulfuric vào đường dịch, chúng sẽ không ở dạng tự do mà liên kết hóa học với các muối và giải phóng acid hữu cơ, phosphoric tự do, chủ yếu ở dạng KH2SO4 và NaH2PO4. Giữa ion H + và lượng acid có tương quan nhất định đối với mỗi dung dịch nào đó, ví dụ cùng một pH nhưng độ chua của dịch đường hóa từ ngô bao giờ cũng lớn hơn từ sắn . Trong thực tế sản xuất không phải cơ sở nào cũng có điều kiện đo pH, mà thường chỉ xác định độ chua. Đối với mỗi dung dịch nào đó thì pH có thể xem như gần ổn định còn độ chua lại thay đổi nhiều phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn của nguyên liệu và dịch lên men. Khi nhiễm khuẩn sẽ tạo acid hữu cơ có độ phân ly thấp nên ít làm thay đổi pH. Vì vậy trong sản xuất rượu không chỉ xác định pH mà còn xác định độ chua. Độ chua có thể biểu diễn theo độ hay theo gam acid / lít. Một độ chua được biểu diễn bằng 1ml dung dịch NaOH 2M vừa đủ để trung hòa acid tự do chứa trong 20 ml dịch hoặc biểu diễn độ chua bằng gam H2SO4/lít dịch, 10 chua = 2,45 g /l. 2.5.2.2 Tác động của một số acid lên pH trong suốt quá trình lên men. Tác động của acid tartaric trong quá trình lên men và thay đổi pH.Tartaric ở nồng độ 5-10g/l là nồng độ thích hợp cho quá trình lên men xảy ra ở mức độ cao và rút ngắn thời gian lên men của quá trình. Hình 2.5.3: Những sự thay đổi trong mức độ lên men tối đa (♦), ngày lên men kết thúc(▲), pH cuối của quá trình lên men(●) do ảnh hưởng của acid tartaric[10]. Khi sử dụng nồng độ tartaric ở 0g/l thì thời gian lên men là dài nhất, đến 18 ngày. pH cũng có sự thay đổi trong quá trình, trong quá trình lên men không có sự bổ sung tartaric thì pH giữ khá ổn định trong quá trình lên men pH=2,4 Trong khi đó với sự bổ sung acid tartaric với nồng độ 20g/l pH sau quá trình lên men là 3,5. Sự tác động ở các khác nhau đã ảnh hưởng tới mức độ hoàn thành quá trình lên men.Ở pH 3.5, 4.5 và 5.5 thời gian lên men là tương đương nhau. Riêng ở pH 2.5 thời gian lên men diễn ra lâu hơn và mức độ lên men cũng diễn ra khá chậm. Bảng 2.6: Thông số động lực học và pH kết thúc quá trình lên men với những pH ban đầu khác nhau trong môi trường có sự thiếu hụt hoặc hiện diện của acid tartaric. Hình 2.5.4: Những minh chứng của cho sự thay đổi pH trong quá trình lên men: (A)pH bắt đầu lên men tại các giá trị khác nhau( đường nét đứt và kí hiệu mở) và không sử dụng acid tataric( nét liền và kí hiệu đậm)[ pH ban đầu:2,5 (◊), 3,5(∆), 4,5 (○) và 5,5()]; (B) pH trong quá trình lên men với sự hiện diện (●) và thiếu (▲) acid tataric trong những giờ đầu của quá trình lên men[10]. Bảng 2.7: Ảnh hưởng của một số acid lên sự sự sinh trưởng của nấm men. Acid Nồng độ Thời gian tiêu diệt nấm men ( giờ) Làm ngừng sinh trưởng Tiêu diệt men % mol/l % mol/l HCl 0,14 0,038 0,72 0,195 0,46 H2SO4 0,39 0,039 1,30 0,123 2,04 H3PO4 0,30 0,031 2,00 0,204 1,28 CH3COOH 0,75 0,125 3,00 0,500 1,25 Acid lactic 0,90 0,100 3,00 0,333 1,27 Hình 2.5.5: Một số acid có mặt trong nội bào trong suốt quá trình lên men của hèm nho ở 25oC: (gạch sọc) nấm men khô; (màu đen) giữa quá trình lên men; ( trắng) kết thúc quá trình lên men[10]. Hình 2.5.6: Sự thay đổi pH tại các nồng độ acid hữu cơ khác nhau, (A) tại nồng độ 0g/l acid, (B) tại nồng độ 5g/l acid: (♦)nồng độ kiểm soát; (■) acid tartaric;(▲) acid malic; (×) acid citric; (●) acid succinic[10]. Việc sủ dụng những acid hữu cơ ở những nồng độ khác nhau đã cho thấy sự khác biệt rõ rệt trước và sau khi sử dụng các acid hữu cơ vào quá trình lên men. Bên cạnh đó, hoàn toàn nhận thấy sự biểu hiện của các acid trong những thay đổi này ở các mức độ khác nhau( hình B) làm ảnh hưởng tới quá trình lên men. 2.5.3. Ảnh hưởng của SO2: So với các loại vi sinh vật khác nấm men rất bền với các điều kiện tác động của SO2. Việc sử dụng SO2 trong sản xuất rượu vang được dùng để ức chế và tiêu diệt một phần các vi sinh vật có hại đến quá trình lên men.Sự có mặt của SO2 sẽ kéo dài quá trình lên men.[39]. SO2 được xem như là chất chống oxy hóa quan trọng trong lĩnh vực sản xuất rượu. Các nghiên cứu gần đây cho thấy nồng độ giới hạn của SO2 trong rượu được giới hạn ở mức tối đa là 200ppm. Được những tổ chức quốc tế khuyến cáo là tốt cho sức khỏe của người dùng. SO2 tác động đến quá trình lên men đặc biệt là trong quá trình lên men malolactic và tác động lên sự giảm hàm hàm lượng acid malic có trong rượu vang. SO2 được biết đến như một tác nhân chống lại các vi sinh vật gây hại trong rượu . nguồn SO2 được lấy từ 3 nguồn chính: trong các hợp chất của trái cây( glucose và arabinose), trong quá trình trao đỏi chất tạo sản phẩm của vi sinh vật (Gluconobacter và Acetobacter), và trong quá trình lên men có thể tạo ra aetaldehyde, pyruvic và acid 2-oxoglutamic. SO2 hạn chế nguồn dinh dưỡng đối với ví sinh vật ,ức chế sự cạnh tranh quá trình oxy hóa polyphenol, trong môi trường hèm nho nó cạnh tranh trực tiếp với sự làm giảm hàm lượng oxy , làm oxy trở nên có tính cấp thiết đối với Saccharomyces [9]. Hình 2.5.7: Ảnh hưởng của SO2 lên ethanol và acetaldehyde .(♦) môi trường có bổ sung SO2, (◊) môi trường không bổ sung SO2[9]. Việc sử dụng SO2 trong quá trình sản xuất rượu vang là điều kiện cần thiết cho sự ổn định về chất lượng vang và giảm lượng vi sinh có hại đến mức tối thiểu, cũng như là phòng tránh, ngăn chặn sự hình thành các loại độc tố từ các chủng nấm men thuần gây ra. SO2 ảnh hưởng trên sự hình thành acetandehyde. Việc hình thành Acetandehyde nói chung phụ thuộc trên loài hoặc chủng nấm men sử dụng nhưng các nhân tố như là nhiệt độ,oxy , và SO2 tác động lên quá trình hình thành acetandeyde một cách tốt nhất. Tác động lên sự lên men malolactic: Sự ức chế của những chủng thuần lên quá trình lên men và các chủng lên men axit lactic.Trong trường họp này sự thêm vào SO2 không còn có sự tác dụng tương tự, nhưng cũng đã có sự thay đổi chiều hướng phần nào. Nồng độ của acetandehyde phần nào tác động đến sự lên men malolactic,khi nồng độ vượt quá 100mg/l thì trở thành nhân tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic,trong khi ở mức độ thấp hơn (<100mg/l). Hình 2.5.8: Ảnh hưởng của SO2 lên acid malic và acid lactic .(♦) môi trường có bổ sung SO2, (◊) môi trường không bổ sung SO2[9]. 2.5.4. Ảnh hưởng nguồn Carbon Nguồn sinh khối thu được chiếm tới 50% carbon trên tổng khối lượng khô điều này biểu thị tầm quan trọng như thế nào. Nguồn Carobn trở thành một nguồn nguyên liệu chính cho quá trình trao đổi chất quan trọng để tỏng hợp năng lượng cho tế bào. Nhiều loại vi sinh vật có khả năng sử dụng một hợp chất hữu cơ có cấu trúc đơn cung cấp cả Carbon và nguồn năng lượng cho tế bào. Có nhiều sự khác biệt trong việc bổ sung các hợp chất hữu cơ so với các chất dinh dưỡng cần thiết. Việc bổ sung các chất dinh dưỡng hữu cơ được gọi là cơ chất cho sự phát triển và có một chức năng rõ ràng trong sự sinh tổng hợp, được cho biết trước bởi những hoạt động sinh tổng hợp của tế bào bị ngưng lại. Hầu hết các loại vi sinh vật đều sử dụng nguồn Carbon chủ yếu từ các nguồn carbon hữu cơ cũng như CO2 được biết đến là một chất dinh dưỡng với hàm lượng nhỏ[7]. Carbonhydrate là nguồn cung cấp tốt nhất nguồn carbon, Oxy, Hydro, và quá trình trao đổi năng lượng. thường xuất hiện với một ham lượng lớn trong môi trường cao hơn hản các chất dinh dưỡng khác thông thường được sử dụng từ 0.2-25%. Khả năng sử dụng nguồn carbonhydrate phụ thuộc vào sự phức tạp trong cấu trức của phân tử.Thông thường theo chiều hướng ưu tiên sau: Hexose > disaccharides > Pentoses > polysaccharides Carbonhydrate có cấu trúc hóa học gần giống với polyhydroxyaldehyde cũng như là polyhydroxyketone. Thông thường chúng có thể được chia thành 3 nhóm : các monosaccharide, các disaccharide và các polysaccharide. Carbonhydrate có một quy luật trọng tâm trong quá sinh tổng hợp năng lượng, sản xuất ra ATP. Tiến trình bẽ gãy các polysaccharide và các disaccharide thành các loại đường đơn giản hơn là nguồn nguyên liệu chính của hợp chất giàu năng lượng. Trong suốt quá trình trao đổi chất, glucose, sẽ chuyển hóa thành CO2, nước và năng lượng.Ba con đường chuyển hóa có quan hệ mật thiết kiểm soát quá trình trao đổi carbonhydrate[7]. Glucose qua quá trình biến đổi kỵ khí sẽ chuyển thành pyruvic và từ đó hình thành ethanol hoặc acid lactic. Từ pyruvic acid nó có vào quá trình oxy hóa theo con đường TCA(TriCarboxylic Acid cycle). Cứ mỗi phân tử glucose sẽ tạo thành 2 phân tử ATP được diễn ra trong EMP. Trong quá trình lên men sự hình thành acid pyruvic có thể tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau, như ethanol, acid lactic, acid butyric, acetone và isopropanol. Chu trình TCA: chức năng của chu trình TCA là chuyển hóa pyruvic và acid lactic,tạo thành những sản phẩm cuối cùng CO2 và H2O. Nó cũng là kênh chuyển hóa cuối cùng sự oxy hóa các acid béo và bộ khung Carbon của nhiều acid amin.Phản ứng : EMP và chu trình TCA là những chu trình cung cấp nguồn năng lượng ATP chính, trong khi chúng cũng cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp các acid amin và lipit. Chu trình pentose phosphate điều khiển hàm lượng pentose quan trọng cho nucleotide (ribose-5-phosphate) và sinh tổng hợp acid béo (NADPH2). Nấm men Saccharomyces cerevisiae sử dụng nguồn glucose, fructose và sucrose mà không có bất cứ khó khăn nào. Đôi khi nấm men còn sử dụng được galactose và maltose nhưng hiếm khi xảy tra.Quá trình trao đổi chất của Saccharomyces cerevisiae tuân theo EMP và tạo ra sản phẩm là ethanol, 2 phân tử ATP từ một phân tủ đường glucose. 2.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Nguồn Nito bổ sung trong quá trình lên men được đánh giá là nhân tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng và hiệu suất của quá trình lên men. Trong nhiều tình huống nghiên cứu khác nhau, nito được khảo sát theo 3 hướng: Cung cấp lượng nito vừa đủ cho quá trình lên men, giới hạn lượng nito của quá trình lên men và thiếu hụt lượng nito theo bảng 2.7 [20]. Trong công nghiệp lên men rượu sử dụng amoniac là nguồn nito chính. Nhưng các amino acid cũng được xem là nguồn cung cấp nguồn nito vô cùng giá trị trong công nghiêp sản xuất rượu vang. Amoniac và các amino acid được đề cập đến như là những nguồn Nito chính đối với nấm men. Khi acid tataric không hiện diện trong môi trừơng, sự thay đổi trong nồng độ của amoni đã không đủ để tránh khỏi những tác động làm chậm quá trình lên men[10]. Ngoài ra việc bổ sung nguồn nito còn được cung cấp từ nhiều nguồn khác nhau: các muốn amoni sunphate, Urea…Bổ sung nitơ với số lượng 30 mg/100ml sẽ rút ngắn thời gian từ 84 giờ xuống 60 giờ, đồng thời lên men cũng tốt và đạt hiệu quả cao hơn mẫu đối chứng. Trong đó nguồn nitơ từ ure cho kết quả tốt hơn. Bảng 2.8: Các thông số đánh giá trong quá trình lên men với thành phần môi trường lên men chứa 20% glucose và các nguồn Nito ban đầu khác nhau[20]. CF: Kiểm soát quá trình lên men(267mg N/l); LN : lượng Nito thấp trong quá trình lên men(66mg N/l); RF: ưu tiên cho quá trình lên men(66 + 200mg N/l cung cấp trong vòng 72 giờ và muối Diamoni sunfate). 2.5.6. Ảnh hưởng của nồng độ đường ( ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu). Dưới điều kiện nồng độ glucose cao S. cerevisiae vẫn biểu hiện khả năng lên men[12].Nồng độ dịch đường cao làm tăng áp suất, mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là cồn nhiều sẽ ức chế không những tạp khuẩn mà cả nấm men, dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men.Nồng độ dịch đường thấp làm giảm năng suất thiết bị lên men. Những tác động của nồng độ glucose cao ảnh hưởng trực tiếp lên sự trao đổi chất và sự biểu hiện của toàn bộ hệ gen. Áp suất thẩm thấu lớn (300mg/l glucose) đã tác động lên sự thay đổi lên hệ gen của nấm men. Kết quả đã tạo ra nguồn năng lượng lớn trong tế bào, sự hình thành các sản phẩm bậc 1 và bậc 2. Ở các nồng độ dịch đường khác nhau tương ứng với thời gian tiến vào pha log cũng khác nhau. Điều này cho thấy rằng nồng độ glucose có tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men từ khi bắt đầu quá trình lên men cho đến khi kết thúc quá trình[12]. Bảng 2.9: Tác động của glucose lên một số yếu tố trong quá trình lên men[12]. Nồng độ glucose Thời gian tiến vào pha log(giờ) Thời gian hoàn thành pha log(giờ) Ethanol tạo sau khi hoàn thành pha log(g/l) pH của môi trường Glycogen thu được sau 68h lên men(g/l) 120g/l 4 68 54,3 3,1 3,8 210g/l 6 88 72,4 2,8 5,2 300g/l 8 96 89,3 2,3 8,6 Thông thường khống chế nồng độ chất khô của dịch đường từ 16 – 18 % ( tùy theo mức độ thuần khiết), tương đương 13 – 15% đường, để sau khi lên men sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8,5 – 9,5 % V. Hình2.5.9 thể hiện sự giảm nồng độ glucose trong quá trình lên men đồng thòi cho thấy sư tác động của glucose lên sự phát triển của nấm men. 2.5.7 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên quá trình lên men của Saccharomyces cerevisiae. Những tác động của ethanol đã ảnh hưởng tới 6138 gen,và trên các gen này ethanol có những tác động thuận lợi cũng như có như có những tác động không thuận lợi cho sự biểu hiện của gen. Những biểu hiện của các gen này đã cho thấy một bức tranh toàn cảnh trong cơ chế các phản ứng trong quá trình sản xuất rượu dưới điều kiện tác động của ethanol ở nồng độ cao[18]. Điều đáng quan tâm trong cơ chế ảnh hưởng của ethanol cho thấy hầu hết tất cả các gen đều có liên quan đến cơ chế tổng hợp trahalose được biểu hiện mạnh. Tương tự đó các biểu hiện của các gen sHSPs cũng cho thấy sự thay đổi trong biểu hiện, hầu hết các gen đều bị cảm ứng trước tác động của ethanol, ngoài ra một minh chứng cụ thể cũng đã cho thấy những sự tác động lên cơ chế chống oxy-hóa. Trong quá trình lên men ở nồng độ ethanol 7% đã cho thấy: có 3,2% gen có biểu hiện ở mức độ giảm.63,6% gen có biểu hiện tăng so với trước trong đó có 49,4% phụ thuộc vào điều kiện stress của môi trường. 14,2% phụ thuộc vào chủng nấm men kháng stress[18]. Hình 2.5.9: Sự giảm glucose, ethanol, và nồng độ glycerol cũng như là sự phát triển của nấm men dưới những điều kiện khác nhau về nồng độ glucose: 120g/l(∆), 210g/l(), và 300g/l (○). Kí hiệu các ô được tô đen biểu diễn cho (A) OD650, hoặc (B) glycerol; kí hiệu không tô đen biểu diễn cho (A) glucose, hoặc (B) ethanol. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần[12]. Sự cảm ứng dưới các điều kiện khác nhau liên quan đến nhiều yếu tố như khả năng bảo vệ tế bào dưới tác động nhiệt ,sự sinh tổng hợp trahalose,cơ chế chống oxyhoa cũng như là khả năng đáp ứng stress[18]. Khả năng ức chế hoạt động của ethanol bắt đầu tại nồng độ 5% và phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và chủng nấm men sử dụng. Khi tăng nồng độ của ethanol thì tác động hưởng và phụ thuộc hoàn toàn vào khả năng lên men và khả năng của chủng nấm men. Cơ chế dưới tác động của ảnh hưởng của ethanol là rất phức tạp[22,2]. 2.5.8 Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng. Trong điều kiện sản xuất, dù có vệ sinh sạch đến mấy cũng khó đảm bảo vô trùng tuyệt đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn. Có thể dùng hóa chất khác nhau như clorua vôi, formalin, fluosilicat natri. Tùy theo chất lượng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt sao hạn chế được phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động của nấm men.Khi dùng formalin hay fluosilicat natri, nồng độ không vượt quá 0,02% so với dịch lên men. Tùy theo tính chất và mức độ phân