Đồ án Tìm hiểu Prebiotic trong các sản phẩm sữa

dài [12]. 2.3.3.3. Tính an toàn khi sử dụng Theo nhiều nghiên cứu, việc sử dụng prebiotic trong thời gian dài không đem lại nguy cơ gây bệnh nào, đặc biệt là đối với trẻ sơ sinh và trẻ em [12,55,99]. Ngoài ra, có nhiều loại rau quả quen thuộc có sẵn prebiotic tự nhiên và đã được sử dụng từ rất lâu mà không gây nguy hại nào [12]. Ở châu Âu, prebiotic được sử dụng phổ biến là FOS, GOS và lactulose. Trong khi đó, thị trường Nhật Bản có các loại prebiotic đa dạng hơn [92,94]. Prebiotic được dùng trong các sản phẩm sữa dành cho trẻ trong hơn 2 thập kỉ qua ở Nhật Bản và trong hơn 5 năm qua ở châu Âu [18]. Các prebiotic có là dạng ‘được đánh giá là an toàn’ (GRAS) tại Mỹ, dạng ‘thực phẩm chức năng’ tại EU và được đánh giá là ‘thực phẩm có lợi cho sức khỏe’ (125, Foods for Specified Health Use) tại Nhật Bản [12,18,48,60,67,97,125]. 2.4. Phương pháp sản xuất prebiotic Hiện nay, có 3 phương pháp chính để sản xuất prebiotic [12,21,31,33,58]: (1) Phương pháp vật lý: Chiết tách trực tiếp oligosaccharide tự nhiên từ thực vật: • Oligosaccharide đậu nành từ whey đậu nành • Inulin từ chicory • Tinh bột bền từ ngô. (2) Phương pháp hóa học: Chuyển hóa có xúc tác từ carbohydrate: • Lactulose từ quá trình đồng phân hóa lactose trong môi trường kiềm. • Lactitol từ quá trình hydro hóa lactose. • Agaro-oligosaccharide từ thủy phân bằng acid hydrochloric, acid citric. (3) Phương pháp enzyme: Thủy phân có kiểm soát polysaccharide tự nhiên, có thể có thêm quá trình sắc kí để tinh sạch prebiotic: • FOS từ inulin (enzyme inulinase) • XOS từ arabinoxylan (xylan lõi ngô, enzyme xylanase) Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 25 • Pectic-oligosaccharide từ pectin (pectin đậu nành, enzyme endo- polygalacturonase) Glycosyl hóa - quá trình tổng hợp bằng cách sử dụng enzyme thủy phân và/hoặc glycosyl transferase có nguồn gốc từ thực vật hoặc vi sinh vật, có thể có thêm quá trình sắc kí để tinh sạch prebiotic: • GOS từ lactose (β-galactosidase) • ScFOS từ sucrose ( β-fructosyltransferase) hoặc fructose • Lactosucrose từ lactose và sucrose (β-fructo-furanosidase) • Gluco-oligosaccharides từ sucrose (enzyme dextran sucrase)[9,19,60,71,88]. Quá trình chiết xuất hóa học oligosaccharide từ thực phẩm có thể làm cho sản phẩm có màu hay hương vị không mong muốn. Ngoài ra, chế phẩm prebiotic thu được thường là hỗn hợp các polysaccharide với độ dài ngắn khác nhau. Đôi khi, sự hiện diện của các mono- và disaccharide có thể làm giảm tính chọn lọc của prebiotic. Phương pháp enzyme tạo sản phẩm ít lẫn sản phẩm phụ hơn [12]. Hình 2.6. Sơ đồ sản xuất một số prebiotic theo các phương pháp khác nhau ( Sako et al,1999).[31,113] Chiết tách Chiết tách Glycosyl hóa Glycosyl hóa Thủy phân và Glycosyl hóa Đồng phân hóa Whey đậu nành Raffinose FOS Lactosucrose Lactulose GOS IMO Oligosaccharide đậu nành Glycosyl hóa Sucrose Lactose Chiết tách Thủy phân Chiết tách Thủy phân Củ cải đường Sữa bò Đậu nành Tinh bột Xylan XOS Tinh bột hòa tan Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 26 Bảng 2.4. Các nhà sản xuất prebiotic trên thế giới [58] Tên công ty và địa chỉ Tên sản phẩm Đặc điểm sản phẩm Galactooligosaccharides Yakult Honsha Co. Ltd., Nhật Bản www.yakult.co.jp Oligomate 55 Oligomate 55P TOS-100 Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide >55% rắn Dạng bột, Oligosaccharide >55% Dạng bột, Oligosaccharide >99% Nissin Sugar Mfg. Co. Ltd., Nhật Bản www.nissin-sugar.co.jp Cup-Oligo H-70 Cup-Oligo P Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide ~70% rắn Dạng bột, Oligosaccharide ~70% Friesland Foods Domo, Hà Lan www.borculodomo.com Vivinal GOS Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide ~60% rắn Lactulose Morinaga Milk Industry Co., Nhật Bản www.morinagamilk.co.jp MLS-50 MLC-A Syrup chứa 70% rắn, Lactulose ~70% rắn Bột (anhydride), lactulose 98% Solvay, Đức www.solvay.com Duphalac Cephulac Syrup chứa >70% rắn, Lactulose >74% rắn Dạng bột, lactulose > 95% Lactosucrose Ensuiko Sugar Refining Co., Nhật Bản www.ensuiko.co.jp Nyuka-Ogiro LS-40L Nyuka-Ogiro LS-55L Nyuka-Ogiro LS-55 Syrup chứa 72%(w/v) rắn Lactosucrose ~ 42% rắn Syrup chứa 75%(w/v) rắn Lactosucrose ~ 55% rắn Bột, lactosucrose ~ 55% Hayashibara Shoji Inc., Nhật Bản www.hayashibara.co.jp Newka-Oligo LS-35 Newka-Oligo LS-55L Newka-Oligo LS-55P Syrup chứa 72%(w/v) rắn Lactosucrose ≥ 35% rắn Syrup chứa 75%(w/v) rắn Lactosucrose ≥ 55% rắn Bột, lactosucrose ≥ 55% Lactitol PURAC, Hà Lan www.purac.com LACTY Bột, lactitol 96% Danisco www.danisco.com Lactitol Finlac DC Bột Bột Fructooligosaccharides Meiji Seika Kaisha, Nhật Bản Meioligo P Bột, Oligosaccharide 95% Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 27 www.meiji.co.jp Meioligo G Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide ~55% rắn Beghin-Meiji Industries, Pháp www.beghin-say.fr Actilight P Actilight G Bột, Oligosaccharide 95% Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide ~55% rắn Golden Technologies Co., GTC Nutrition, Mỹ www.nutraflora.com NutraFlora scFOS Bột, Oligosaccharide 95% Oligofructose và Inulins Beneo-ORAFTI, Bỉ www.beneo.orafti.com Orafti L60 Orafti L85 Orafti L95 Orafti P95 Orafti Synergy1 Orafti ST Orafti HP Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 60% rắn Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 85% rắn Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 95% rắn Bột, oligosaccharide >95% Bột, hỗn hợp inulin và oligofructose. Bột, inulin > 90% Bột, inulin > 99.5% Cosucra SA, Bỉ www.cosucra.com Fibrulose F90 và F97 Fibruline Oligofructose Inulin Sensus C.V., Hà Lan www.sensus.nl Frutafit-inulin Bột Isomaltooligosaccharides Showa Sangyo Co., Nhật Bản www.showa-sangyo.co.jp Isomalto-500 Isomalto-900 Isomalto-900 Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 50% rắn Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 85% rắn Bột, oligosaccharide >85% Nihon Shokuhin Kako Co., Nhật Bản www.nisshoku.co.jp Biotose # 50 Panorich Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide > 50% rắn Syrup chứa 75% (w/v) rắn, Oligosaccharide ≥50% rắn, có panose ≥ 25% Hayashibara Shoji Inc., Nhật Bản www.hayashibara.co.jp Panorup Syrup chứa ≥74% (w/v) rắn, Oligosaccharide ≥50% rắn, Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 28 có panose ≥ 25% Soybean-oligosaccharides The Calpis Food Industry Co., Nhật Bản www.calpis.net Soya-oligo Syrup chứa 75% (w/v) rắn soybean-oligosaccharides 35% rắn Xylooligosaccharides Suntory Ltd., Nhật Bản www.suntory.com Xylo-oligo 70 Xylo-oligo 20P Xylo-oligo 35P Xylo-oligo 95P Syrup chứa 75% (w/v) rắn Oligosaccharide ~70% rắn Bột, oligosaccharide ~20% Bột, oligosaccharide ~35% Bột, oligosaccharide ~95% Tinh bột bền Penford Australia Ltd., Australia www.penford.com Hi-Maize Culture-Pro National Chemical & Starch Company, Mỹ www.nationalstarch.com Hylon VII Novelose 330 Novelose 240 2.5. Probiotic và synbiotic 2.5.1. Probiotic Năm 1905, tiến sĩ người Nga Elie Metchnikoff là người đầu tiên viết về lợi ích đối với sức khỏe của vi khuẩn lactic có trong sữa chua Bulgaria. Những người nông dân Bulgaria đã sử dụng sữa chua thường xuyên và liên tục đều sống lâu và khỏe mạnh [65, 76, 103]. Từ đó, có nhiều công bố về lợi ích sức khỏe do vi sinh vật trong thực phẩm lên men mang lại. Tuy nhiên, thuật ngữ ‘probiotic’, theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là ‘dành cho s ự sống’, xuất hiện đầu tiên bởi Lilly và Stillwell vào năm 1965 để mô tả những chất do một loại vi sinh vật tạo ra để kích thích sự phát triển của vi sinh vật khác cùng loại. Kể từ đó, có nhiều định nghĩa probiotic được đưa ra với những quan điểm đối lập nhau là phải duy trì khả năng sống của probiotic hay không cần duy trì. Năm 2001, một ủy ban giữa Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã định nghĩa probiotic như sau: ‘đó là những vi sinh vật sống, khi được cung cấp đủ số lượng, sẽ mang lại sức khỏe cho vật chủ’ [27, 58, 85, 90, 111]. Định nghĩa này nhấn mạnh lại tầm quan trọng của khả năng sống của probiotic trong sản phẩm và được chấp nhận trên toàn cầu [27]. Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 29 *Bact: bacteroides, Bif: bifidobacteria, Clost: clostridia, Coli: E.coli, Eub: eubacteria, Lab: lactobacilli (a) hệ vi sinh vật sau khi bổ sung prebiotic (b) hệ vi sinh vật trước khi bổ sung prebiotic và probiotic (c) hệ vi sinh vật sau khi bổ sung probiotic Hình 2.7.Tác động của prebiotic và probiotic đến hệ vi sinh vật ruột già. [32] Dựa vào những nghiên cứu lâm sàng về tác dụng có lợi của probiotic đối với sức khỏe con người, người ta đưa ra những đặc tính cần có của vi sinh vật probiotic như sau: [36, 40, 85, 118] 1. Có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật đường ruột của người. 2. Tồn tại được dưới những điều kiện vật chủ 3. Sinh sản nhanh và/hoặc chiếm ưu thế trong ruột già 4. Tồn tại được với hệ miễn dịch và chống lây nhiễm của vật chủ 5. Kích thích miễn dịch đối với hệ thống miễn dịch của chất nhầy 6. Sản sinh các hợp chất kháng sinh 7. Chống chất gây ung thư và vi khuẩn gây bệnh 8. Được đánh giá là an toàn, không gây bệnh, không độc, không dị ứng, không gây đột biến, hay không gây ung thư 9. Ổn định, không có plasmid sao chép 10. Có đặc tính công nghệ để dễ ứng dụng 11. Hoạt động trao đổi chất theo hướng có lợi cho sức khỏe 12. Tác dụng tốt đối với sức khỏe 13. Có khả năng để tái tổ hợp protein và peptide Mô ruột/chức năng Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 30 Cho đến nay, vi sinh vật probiotic hay được gọi là probiotic được phát hiện bao gồm: Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Bacillus, Escherichia, Enterococcus, và Saccharomyces (bảng 2.5). Trong đó, Lactobacillus và Bifidobacterium là 2 loài lý tư ởng để kết hợp với thực phẩm. Chúng tồn tại trong ống tiêu hóa, chịu được acid và mật, có khả năng bám vào các tế bào đường ruột, và là loại GRAS [27,78]. Lactobacilli được sử dụng trong thực phẩm nhiều hơn bifidobacteria vì bifidobacteria có nguồn gốc trong đường ruột, nhạy cảm với oxy, yêu cầu điều kiện phát triển khắt khe hơn nên ít có tính công nghệ hơn. Ngoài propionibacteria và enterococci, các loài khác thường không được sử dụng trong thực phẩm lên men nhưng được sử dụng để làm thành phần bổ sung chế độ dinh dưỡng ở dạng viên nang, bột,…[27]. Bảng 2.5. Các vi sinh vật probiotic [95] Nguồn: Holzhapfel và cộng sự (2001). Probiotic khó vượt qua được các acid hay enzyme như prebiotic [98], do đó, liều lượng số lượng vi sinh vật probiotic trong sản phẩm thực phẩm phải đạt tối thiểu là 107 tế bào/ml để đảm bảo hiệu quả tác dụng của probiotic [27, 97]. Lactobacillus Bifidobacterium Các vi khuẩn lactic khác Các vi sinh vật khác Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 31 Probiotic được sử dụng nhiều trong các sản phẩm sữa lên men, đặc biệt là yogurt [37], thường được gọi là bio-yogurt [95]. 2.5.2. Synbiotic Năm 1995, Gibson và Roberfroid đã đưa ra định nghĩa synbiotic, là ‘một hỗn hợp của probiotic và prebiotic có tác dụng tốt đối với sức khỏe vật chủ, bằng cách cải thiện khả năng sống sót và bám trụ trong đường ruột của chất bổ sung chứa vi sinh vật sống, bằng cách kích thích chọn lọc sự phát triển và/hoặc hoạt động trao đổi chất của một hay một vài loại vi khuẩn có lợi và do đó cải thiện sức khỏe vật chủ’ [31]. Sử dụng synbiotic nhằm kích thích sự phát triển hoặc hoạt động của vi khuẩn bifidobacteria và lactobacilli ban đầu có trong đường ruột bằng cách sử dụng kết hợp carbohydrate thích hợp với một hay một vài chủng probiotic. Khi đó, prebiotic có thể bảo vệ probiotic trong quá trình tiêu hóa đ ể đảm bảo tính ổn định của nó khi đến ruột già. Ngoài ra, prebiotic có thể tăng cường sự phát triển của chủng preobiotic và của hệ vi sinh vật đường ruột [12, 90]. Qua các nghiên cứu, người ta thấy synbiotic có thể tác dụng ở cả ruột non và ruột già [12, 31, 45]. Bổ sung synbiotic (gồm probiotic và prebiotic) vào sản phẩm sẽ tăng chi phí sản xuất và tăng giá cả của sản phẩm. Vì vậy, thị trường các sản phẩm synbiotic phát triển chậm hơn so với các sản phẩm chứa probiotic và sản phẩm chứa prebiotic. Mặt khác, các vi khuẩn trong sản phẩm chứa probiotic có thể tổng hợp oligosaccharide ngay trong sản phẩm nhưng với số lượng rất hạn chế [80, 93]. Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 32 CHƯƠNG 3: CÁC PREBIOTIC ĐƯỢC BỔ SUNG TRONG CÁC SẢN PHẨM SỮA 3.1. Galactooligosaccharide (GOS) 3.1.1. Giới thiệu về GOS Galactooligosaccharide là prebiotic có trong sữa, được sinh tổng hợp từ lactose [32, 88]. GOS có trong sữa mẹ với lượng rất thấp khoảng 1 g/l, tồn tại với lượng vết trong sữa bò và yogurt [32]. Trước kia, GOS được xem là sản phẩm phụ trong công nghiệp chế biến sữa GOS [28,32,38]. Đó là kết quả hoạt động của enzyme β-galactosidase của canh trường nuôi cấy trong sữa lên men. Tuy nhiên, người ta thấy rằng, một lượng GOS rất nhỏ trong sữa mẹ góp phần thiết lập hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ. Trong đó, bifidobacteria là loại vi khuẩn chiếm ưu thế [21,32]. GOS là hỗn hợp gồm các oligosaccharide được cấu tạo bởi các đơn vị β-(1-4) galactopyranosyl thường được nối với nhau bởi liên kết β-(1-6) hay β-(1-4) và có thể có gốc glucopyranosyl ở đầu khử thông qua liên kết β-(1-4). Trisaccharide có thể được gọi là 4’- hoặc 6’-galactosyllactose nếu liên kết giữa các gốc galactose là β -(1- 4) hay β-(1-6). Mức độ polymer hóa (DP) của GOS là 2 – 10 [18,21,52,93,94]. Hình 3.1. Cấu trúc phân tử của GOS [36] GOS được sản xuất theo phương pháp enzyme có thể được gọi với nhiều tên gọi khác nhau: transgalacto-oligosaccharides, transgalactosylated oligosaccharide, trans- GOS, TOS, hay oligogalactosyl-lactose [21]. Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 33 3.1.2.Kỹ thuật sản xuất GOS GOS được sản xuất thương mại bằng phương pháp enzyme, bởi hoạt tính transgalactosyl của β-galactosidase sử dụng cơ chất lactose [40]. 3.1.2.1.Enzyme tổng hợp GOS Tên gọi: Enzyme β-galactosidase hay β-D-galactoside galactohydrolase (EC 3.2.1.23) là enzyme được gọi với tên thường là lactase [38,49,64]. Nguồn gốc: β-galactosidase tồn tại trong thực vật ( đào, mơ, hạnh nhân), động vật (mô ruột, não, da) và vi sinh vật (nấm men, vi khuẩn, nấm mốc) [31,35,49,73]. Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật cho hiệu suất cao nên được sử dụng để sản xuất thương mại [18, 31, 38, 64]. Trong sản xuất GOS thương mại, các enzyme được chiết tách chủ yếu từ các giống: Kluyveromyces, Aspergillus, Streptococcus, Bacillus, Cryptococcus (bảng 3.1) [18, 49, 77]. Ngoài ra, enzyme β-galactosidase cũng đư ợc tìm thấy trong các loài vi khuẩn probiotic [18, 49]. Những loài vi khuẩn probiotic có thể tổng hợp GOS như: Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium bifidum BB, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, and Bifidobacterium infantis[31], Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus reuteri [57]. Sản phẩm oligosaccharide của những loài này sẽ được chuyển hóa dễ dàng hơn bởi vi khuẩn probiotic trong đường ruột. Sản phẩm tạo thành là hỗn hợp gồm những oligosaccharide mạch thẳng hoặc nhánh [18, 31]. Đặc điểm: Enzyme β-galactosidase có kích thước phân tử là 36 – 362 kDa, chứa 4 subunit [35, 91]. Enzyme từ nấm men và vi khuẩn là enzyme nội bào và enzyme từ nấm mốc là enzyme ngoại bào [49, 64]. Vì vậy, trong sản xuất GOS, enzyme từ nấm men và vi khuẩn phải được chiết tách ra khỏi tế bào. Enzyme từ nấm mốc được thu nhận trong canh trường nuôi cấy [18]. Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 34 Bảng 3.1. Một số loài vi sinh vật được sử dụng trong sản xuất GOS thương mại [62, 64] Loài vi sinh vật pH tối thích Nhiệt độ tối thích Sản phẩm ban đầu và kiểu liên kết Kluyveromyces marxianus ssp.lactis 6.0 – 7.0 37 – 45 6’-galactosyllactose Kluyveromyces fragilis 6.9 – 7.3 40 – 44 6’-galactosyllactose Aspergillus oryzae 3.5 – 6.5 50 – 55 6’-galactosyllactose Aspergillus niger 3.0 – 4.0 55 – 65 6’-galactosyllactose Streptococcus thermophilus 6.5 – 7.5 55 - 57 3’-galactosyllactose Bacillus circulans 6.0 55 – 60 4’-galactosyllactose Bacillus stearothermophilus 6.0 – 6.4 50 – 65 4’-galactosyllactose Cryptococcus laurentii 4.3 55 - 60 4’-galactosyllactose Cơ chế tổng hợp GOS: Enzyme β-galactosidase có nguồn gốc từ nhiều loài vi sinh vật khác nhau sẽ có các đặc tính khác nhau như khối lượng phân tử, độ dài mạch polypeptide, và vị trí của trung tâm hoạt động [38,64]. Tuy nhiên, chúng đều có các amino acid như nhau ở trung tâm hoạt động. Đó là histidine đóng vai trò như là m ột chất ái nhân/base (nhận proton) và cysteine như là một acid (cho proton). Hiện nay, có một giả thiết mới là β-galactosidase từ các vi sinh vật khác nhau có 2 gốc acid glutamic (Glu482 và Glu551) ở trung tâm hoạt động. Một gốc acid glutamic như là chất cho proton và gốc acid còn lại là chất nhận proton. Chúng tham gia đồng thời trong phản ứng enzyme [18,38]: • Bước đầu tiên được gọi là bước glycosyl hóa. Một acid carboxyl ở trung tâm hoạt động cho một proton vào nguyên tử oxy liên kết [18], giải phóng glucose [38,55]. Đồng thời, một acid carboxyl khác gắn vào galactosyl như là một chất ái nhân [18], hình thành phức enzyme-galactosyl [38,55] • Bước thứ hai là bước deglycosyl [18]. Phức enzyme-galactosyl được chuyển đến một chất nhận chứa nhóm hydroxyl [38,55]. Acid carboxyl thứ nhất đã cho một proton sẽ hoạt hóa chất nhận chứa nhóm hydroxyl, bằng cách nhận proton từ chất nhận đó [18]. Đồng thời, các phân tử nước hay các phân tử đường trong hỗn hợp phản ứng có thể là chất ái nhân, để nhận gốc galactosyl từ phức enzyme-galactosyl [64]. Đây là sự xúc tác cho phản ứng thủy phân hay galactoyl hóa, phụ thuộc vào Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 35 nồng độ tương đối của các chất nhận có chức hydroxyl là nước hay carbohydrate [18,62]. Trong dung dịch lactose được làm loãng, nước nhiều hơn các đường khác như glucose, lactose, có thể cạnh tranh hơn để làm chất nhận, do đó, galactose được hình thành và đư ợc giải phóng từ trung tâm hoạt động. Nếu dung dịch có lượng lactose cao, phân tử lactose có nhiều cơ hội hơn để là chất nhận, nối với phức enzyme-galactosyl [38, 55] tạo ra trisaccharride. Trisaccharide có thể đóng vai trò là chất nhận để tạo nên tetrasaccharide, pentrasaccharide hay hexasaccharide [18, 21, 31, 72]. Hình 3.2. Cơ chế phản ứng galactosyl hóa [21]. Như vậy, β-galactosidase hoạt động xúc tác cho phản ứng thủy phân và phản ứng galactosyl hóa. Quá trình tổng hợp GOS có bản chất là quá trình galactosyl hóa [25]. Quá trình galactosyl hóa bao gồm phản ứng giữa các phân tử và phản ứng nội phân tử: • Phản ứng nội phân tử là quá trình phức enzyme-galactosyl chuyển trực tiếp đến đồng phân vị trí glucose được sinh ra từ lactose. Liên kết glycosidic của lactose [β- (1-4)] được tách ra và hình thành ngay lại ở vị trí khác của phân tử glucose trước khi nó khuếch tán ra khỏi trung tâm hoạt động. Đây là cách allolactose (β -(1-*6) được hình thành dù lượng glucose tự do không nhiều. • Phản ứng giữa các phân tử là quá trình phức enzyme-galactosyl chuyển đến các phân tử di-, tri-, tetra-, và pentasaccharides khác. Kết quả là các oligosaccharide dài hơn được tạo thành. Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 36 GOS được hình thành có thể được xem là chất trung gian vì chúng cũng có th ể là cơ chất cho quá trình thủy phân. Vì tất cả những lý do trên, thành phần và hàm lượng GOS sinh ra thay đổi nhanh theo thời gian phản ứng. Cấu trúc hóa học và thành phần của GOS phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc enzyme [64]. Hình 3.3. Cấu trúc phân tử của allolactose và galactobiose.[64] Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng galactosyl hóa: Trong suốt quá trình phản ứng, số lượng và bản chất của hỗn hợp oligosaccharide hình thành (kiểu liên kết giữa các đường galactose và DP) bị tác động bởi hoạt tính transferase (Ut) và hoạt tính thủy phân (Uh) của enzyme. Tỉ lệ này phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme, từ đó đưa ra những điều kiện phản ứng (pH, nhiệt độ, thời gian) và nồng độ và bản chất của cơ chất khác nhau. Như vậy, nguồn gốc là yếu tố quyết định hiệu suất phản ứng galactosyl hóa [18, 21, 31, 32, 52, 77, 91, 94]: • Tỉ lệ hoạt tính transferase và hoạt tính thủy phân (Ut/Uh): Enzyme có tỉ lệ Ut/Uh càng cao thì hiệu suất tổng hợp GOS càng tăng. Để tăng hiệu suất phản ứng, người ta cũng c ải thiện tỉ lệ Ut/Uh của enzyme β-galactosidase bằng cách sử dụng kỹ thuật gen. Enzyme chuyển gen sử dụng khoảng 90% lactose để tạo thành GOS trong khi chỉ có 10% lactose bị thủy phân. Tỉ lệ Ut/Uh là 9:1 này được duy trì trong dung dịch lactose có nồng độ từ 10 – 40% (w/w) [18]. • pH tối thích: Lactase từ nấm men có pH tối thích là 6.0 – 7.0, từ nấm mốc có pH 2.5 – 4.5, và từ vi khuẩn có pH 6.5 – 7.5. Do đó, lactase nấm mốc được sử dụng trong whey acid. Lactase từ nấm men và vi khuẩn thích hợp cho sữa (pH 6.6) và whey ngọt (pH 6.1) [49, 91]. Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 37 • Khả năng chịu nhiệt [18]: So với enzyme từ nấm men, β-galactosidases của nấm mốc chịu nhiệt hơn, nhưng nó nhạy cảm với sự ức chế hơn, chủ yếu bởi galactose [38]. • Ảnh hưởng của ion kim loại: Hoạt lực của các β -galactosidases khác nhau phụ thuộc vào sự hiện diện của ion kim loại. β-galactosidases từ nấm mốc hoạt động không cần các ion đóng vai trò là cofactor. Enzyme t ừ nấm men, ví dụ β- galactosidase từ Kluyveromyces lactis cần có ion như Mn2+, Na+; β-galactosidase từ Kluyveromyces fragilis cần Mn2+, Mg2+, K+ . Nói chung, cation hóa trị hai như Mn2+ và Mg2+ có thể làm tăng hoạt lực của β-galactosidase. Cation hóa trị một có thể có tác động tích cực hoạt tiêu cực đến hoạt động của enzyme. Tuy nhiên, Ca2+ và các kim loại nặng đều ức chế hoạt động của tất cả β-galactosidases [64]. Hầu hết calcium trong sữa được nối với casein và do đó không tự do trong dung dịch. Nên β-galactosidase hoạt động trong sữa sẽ không bị ức chế [49]. • Ảnh hưởng nồng độ cơ chất và nhiệt độ phản ứng: Phản ứng galactosyl hóa đạt hiệu quả cao ở nồng độ cơ chất ban đầu cao [20,55,91]. Tuy nhiên, lactose có tính hòa tan thấp nên hạn chế cho hiệu suất của phản ứng. Ở 250C, 25% (w/v) lactose tan được trong nước [91]. Khi nồng độ lactose càng cao cũng s ẽ làm giảm hoạt độ nước của dung dịch phản ứng. Hoạt độ nước ảnh hưởng đến mức độ polymer hóa của sản phẩm GOS hình thành. Hoạt độ nước thấp sẽ có xu hướng tạo trisaccharide và hoạt độ nước cao hơn sẽ tổng hợp nên GOS có độ dài lớn hơn [18]. Thông thường, người ta tăng nhiệt độ để tăng tốc độ phản ứng và tăng khả năng hòa tan của lactose. Đồng thời, tăng nhiệt độ cũng ngăn ngừa sự kết tinh của lactose và làm giảm độ nhớt của cơ chất để hoạt tính tranferase có ưu thế hơn hoạt tính thủy phân [18]. Do đó, đối với những enzyme ưa nhiệt, phản ứng tổng hợp có thể được tiến hành ở nhiệt độ cao (50 – 800C) với nồng độ lactose cao hơn [31,91], nhằm tăng hiệu suất phản ứng [18]. Hai loại β-galactosidases được sử dụng nhiều trong chế biến công nghiệp là loại bền nhiệt và loại hoạt động lạnh. Loại bền nhiệt, liên quan đến giảm độ nhớt của dung dịch phản ứng và giảm sự tạp nhiễm vi sinh vật không mong muốn. Loại hoạt động Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 38 lạnh cung cấp các sản phẩm sữa dưới những điều kiện ôn hòa để mùi vị và giá trị dinh dưỡng vẫn không thay đổi.[64] 1.2.2.Quy trình sản xuất GOS Hình 3.4. Sơ đồ quy trình sản xuất GOS trên quy mô công nghiệp (Matsumoto,1990 và Sako et al.,1999). [18,31,62] Nguyên liệu để sản xuất GOS thương mại là dung dịch lactose được chiết tách từ whey có nồng độ cao, khoảng 20 – 40 % (w/v). Tuy nhiên whey chứa lactose ở nồng độ cao vẫn được sử dụng để sản xuất GOS [18, 21, 94]. Kỹ thuật sản xuất GOS có thể dùng enzyme tự do để sản xuất theo mẻ hoặc hệ thống cố định để sản xuất theo mẻ hoặc liên tục [31]. Kỹ thuật cố định enzyme β- galactosidase gồm hấp phụ không hóa trị, liên kết hóa trị, nhốt và encapsulation[25,38]. Chất mang để cố định có thể là cotton, chitosan, agarose, chitosan được xử lí glutaraldehyde [38,91]. Thiết bị phản ứng có thể được thiết kế để sản xuất GOS theo mẻ hoặc liên tục. Cho nguyên liệu và enzyme β -galactosidase vào trong thiết bị phản ứng [18]. Điều chỉnh nhiệt độ phản ứng thích hợp, khoảng 45 – 850C [62]. β-galactosidase Dung dịch lactose Galactosyl hóa Khử màu Khử khoáng Tinh sạch Cô đặc GOS syrup Sấy GOS (bột) Tìm hiểu prebiotic trong các sản phẩm sữa 39 Dung dịch sau khi phả