Đồ án Tình trạng ô nhiễm nguồn nước ở một số tỉnh thành thuộc khu vực phía nam

( hoặc số đơn vị Katal) ứng với 1ml dung dịch (nếu là dịch) hoặc 1mg Protein (nếu là bột khơ) của chế phẩm enzym. Nếu chế phẩm enzym đã tinh sạch, hoạt độ được biểu thị bằng số UI (hoặc Kat) trên 1mg enzym. Khi biết được khối lượng ptử của enzym ta hồn tồn cĩ thể tính được hoạt độ riêng của phân tử. d) Hoạt độ riêng phân tử: là số phân tử cơ chất được chuyển hố bởi một phân tử enzym trong một đơn vị thời gian. 3.2. Tính đặc hiệu của enzym: 3.2.1. Đặc hiệu kiểu phản ứng: Enzym lipase chỉ có thể xúc tác cho phản ứng thuỷ phân. 3.2.2. Đặc hiệu cơ chất: Cơ chất là chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzym và bị chuyển hoá dưới tác dụng của enzym. Lipase có tính đặc hiệu tương đối : nó có khả năng tác dụng lên 1 kiểu liên kết nhất đinh trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó. Lipase có khả năng thuỷ phân được tất cả các mối liên kết ester carboxylic. Cơ chế tác dụng của lipase: Thông thường, trong phản ứng có xúc tác enzym, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzym – cơ chất mà cơ chất được hoạt hoá, bởi lẽ khi cơ chất kết hợp vào enzym do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trởø nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng Quá trình tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản phẩm, giải phóng enzym tự do thường trải qua 3 giai đoạn : E + S ES P + E - Giai đoạn 1: Enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức ES không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hoá thấp - Giai đoạn 2: Khi cơ chất tạo phức với E sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ - Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm còn ezym dc giải phóng dưới dạng tự do. Cơ chế tác dụng của Lipase : tâm ái nhân của lipase sẽ tương tác với 1 trong 2 nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thuỷ phân. Sự tạo thành phức hợp trực tiếp như thế với trung tâm phản ứng sẽ làm cho sự đứt các liên kết và sự thuỷ phân dc dễ dàng thuận lợi. Một cơ chế khác liên hệ tính tác dụng của ezym với sự khuyết electron của liên lết bị thuỷ phân là : Enym làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó, bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiều gần gũi với liên kết bị thuỷ phân. Nhờ vậy mà làm cho sự phân bố electron trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo 1 chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết được dễ dàng hoặc khiến cho 1 trong 2 nguyên tử của liên kết tương tác được với các tác nhân ái nhân. AB + H2O AOH + BH Dưới tác dụng của enzym lipase, khi hợp chất AB kết hợp với enzym thì liên kết A-B bị kéo căng , kèm theo sự chuyển dịch electron dẫn đến làm đứt liên kết A-B và gắn nhóm HO- của nước vào phần B của phân tử. Sau khi hoàn thành phản ứng enzym dược giải phóng dưới dạng tự do. 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của enzym lipase. Cơ chất Hệ nhũ tương thường Hệ nhũ tương đảo Hệ nhũ tương nhỏ (các micell đảo) Liu và các đồng sự tìm ra tỷ lệ mỡ heo/tristearin 3:1 là tối ưu trong tổng hợp chất thay thế bơ cacao từ Lipozym IM-20 Báo cáo của Ting và các đồng sự thì tỷ lệ dầu nước là 10/5 là tối ưu với hiệu suất thủy phân dầu nành là 48% với lipase cố định trên hạt chitosan bằng phương pháp BINARY pH Ting và đồng sự báo cáo pH tối ưu cho lipase cố định trên hạt chitosan là 7-8 thì cho hiệu suất phản ứng hủy phân dầu nành là cao nhất Liu và các đồng sự báo cáo pH tối ưu của Lipozym là 9 trong phản ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin. Romija chiết xuất trong dịch gan và tuỵ tạng của lớp đầu túc như mực (Sepiaofficinalis), bạch tuộc ( Eledne cierbosa ) được enzym lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân thấy pH thích hợp nhất của lipase dịch gan là 6.0, còn của dịch tuỵ tạng là 6.4 Hykeo đã lấy dịch ruột cá vược ( perca fluviatelis ) đem thuỷ phân tributirin thì thấy tác dụng của chúng mạnh nhất ở 25–37oC, pH = 12.3 – 12.8 Các nhà khoa học Nhật đã dùng dịch tuỵ tạng của tôm càng ( Squil-laoratoria ) thuỷ phân methylacetat thấy chúng hoạt động mạnh ở 38oC, pH = 7.2 với thời gian là 15h. Nhiệt độ: Ting và đồng sự báo cáo nhiệt tối ưu cho lipase cố định trên hạt chitosan là 35-600C thì cho hiệu suất phản ứng hủy phân dầu nành là cao nhất Liu và các đồng sự báo cáo nhiệt độ tối ưu của Lipozym là 500C trong phản ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin. Chất hoạt hóa và ức chế: Canxi ( Ca ) hoạt hóa lipase trong phản ứng thủy phân theo ba cơ chế : Kết hợp với enzym làm thay đổi cấu trúc Giúp lipase dễ dàng hấp thụ lên bề mặt cơ chất-nước Khử các axit béo sản phẩm của phản ứng thủy phân giảm khả năng ức chế của axit với enzym - Muối mật hoạt hóa lipase từ tuyến tụy của người - Một vài cơ chất ức chế như : Các hợp chất bề mặt có chứa anion Protein Ion kim loại Axit boronuc Các hợp chất có chứa phospho như cabarmate, β-lactone… Nước: Nước không những là môi trường để khuyếch tán enzym và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng nữa. Nước có ảnh hưởng không những tới vận tốc mà cả đến chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzym nữa. Nước cũng là 1 yếu tố điều chỉnh các phản ứng thuỷ phân bởi enzym, có thể dùng nước làm nhân tố tăng cường hay kìm hãm các phản ứng thuỷ phân có enzym xúc tác. Ting và đồng sự báo cáo tỷ lệ dầu-nước 10/5 là tối ưu cho lipase cố định trên hạt chitosan thì cho hiệu suất phản ứng thủy phân dầu nành là cao nhất. Liu và các đồng sự báo cáo aw tối ưu của Lipozym là 0.61 trong phản ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin. Condoret và các đồng sự [8] báo cáo aw tối ưu của Lipozyme IM-20 là 0.4-0.7 Aùp suất: Liu và các đồng sự báo cáo áp suất tối ưu của Lipozym là 17Mpa trong phản ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin. Nandy và các đồng sự báo cáo áp suất tối ưu là 15mbar cho lipase dùng tổng hợp dẫn xuất của AHA trong ngành mỹ phẩm. Lipase cố định và lipase tự do: Ting và đồng sự báo cáo lipase cố định trên hạt chitosan dùng tỷ lệ cơ chất nước 10/5 có hiệu suất 48% còn lipase tự do với tỷ lệ cơ chất 10/7 có hiệu suất thấp hơn là 45% trong phản ứng thủy phân dầu nành là cao nhất. Olivier và các đồng sự báo cáo rằng 20.1 mg lipase từ chủng Burkholdenia (BCL) cho phản ứng chuyển hóa ester nhanh hơn khi dùng 38mg lipase đó ở dạng tự do. Một vài báo cáo về các thông số ảnh hưởng : Thủy phân dầu nành bằng lipase cố định bằng phương pháp BINARY trên hạt chitosan báo cáo bởi Ting và các đồng sự Yếu tố tỷ lệ dầu nước (10/5) Tỷ lệ dầu-nước (w/w) Biến đổi nhờ lipase tự do (%) Biến đổi nhờ lipase cố định (%) 10:1 33.10 38.58 10:3 37.71 45.31 10:5 41.40 48.21 10:7 45.08 47.37 10:9 36.04 43.46 Động lực học phản ứng thủy phân Vmax (U/mg-protein) Km (mg) Lipase cố định 254 1841 Lipase tự do 21.6 469 Liu và các đồng sự báo cáo ứng dụng lipase trong tổng hợp chất thay thế bơ cacao từ mỡ heo và tristearin bằng phản ứng chuyển hóa ester trong hệ thống CO2 siêu tới hạn và ảnh hưởng của các thông số. Cơ chất tối ưu (mỡ heo và tristearin) Nguồn dầu Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %) POP POS POO SOS SOO Thanh phần dầu ban đầu Dầu cọ 43.4 ± 0.5 6.2 ± 0.3 48.5 ± 0.3 0.0 ± 0.0 1.9 ± 0.1 Mỡ heo 19.0 ± 1.0 31.9 ± 0.6 42.8 ± 2.1 1.9 ± 1.1 4.4 ± 1.0 Mỡ bò 26.1 ± 0.6 22.6 ± 0.5 40.9 ± 0.2 4.0 ± 0.2 6.4 ± 0.3 Sau phản ứng nội chuyển hóa este Dầu cọ 21.6 ± 0.2 35.1 ± 0.1 20.3 ± 0.0 14.1 ± 0.2 8.9 ± 0.4 Mỡ heo 23.0 ± 0.4 39.9 ± 1.2 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.5 7.8 ± 0.7 Mỡ bò 19.3 ± 0.3 32.7 ± 0.8 18.8 ± 1.2 17.4 ± 0.9 11.8 ± 0.7 Thời gian tối ưu (3h) Thời gian phản ứng (h) Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %) POP POS POO SOS SOO 1 23.8 ± 0.7 36.9 ± 1.4 18.3 ± 1.2 12.3 ± 1.1 8.7 ± 1.0 3 23.0 ± 0.4 39.9 ± 1.2 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.5 7.8 ± 0.7 7 24.0 ± 1.1 38.4 ± 1.9 15.6 ± 1.2 14.0 ± 1.8 8.0 ± 1.9 Aùp suất tối ưu ( 17 Mpa ) Aùp suất phản ứng (MPa) Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %) POP POS POO SOS SOO 10 23.0 ± 0.4 39.9 ± 1.2 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.5 7.8 ± 0.7 17 22.6 ± 0.4 38.5 ± 0.9 14.9 ± 0.2 15.1 ± 0.4 8.9 ± 1.3 24 22.3 ± 2.0 39.7 ± 2.1 12.9 ± 0.8 16.6 ± 2.2 8.5 ± 1.2 Nguồn cho nhóm acyl: Nguồn cho nhóm acyl Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %) POP POS POO SOS SOO Stearic acid 34.5 ± 1.6 34.5 ± 1.2 20.0 ± 1.2 6.3 ± 0.9 4.7 ± 0.7 Stearic acid ethyl ester 34.8 ± 1.3 34.9 ± 1.3 18.3 ± 1.2 7.4 ± 0.7 4.6 ± 1.0 Stearic anhydride 32.0 ± 1.3 34.8 ± 1.0 18.1 ± 1.5 7.7 ± 0.7 7.4 ± 1.1 Tristearin 22.6 ± 0.4 38.5 ± 0.9 14.9 ± 0.2 15.1 ± 0.4 8.9 ± 1.3 Nhiệt độ tối ưu (500C) Nhiệt độ phản ứng (oC) Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %) POP POS POO SOS SOO 40 26.3 ± 0.5 36.0 ± 1.0 19.4 ± 0.1 11.3 ± 0.5 7.0 ± 1.0 50 22.6 ± 0.4 38.5 ± 0.9 14.9 ± 0.2 15.1 ± 0.4 8.9 ± 1.3 60 23.7 ± 1.6 38.5 ± 1.0 14.7 ± 0.5 14.7 ± 0.4 8.4 ± 0.8 Tỷ lệ mỡ heo và tristearin tối ưu (1.4): Mỡ heo/triesterate Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %) POP POS POO SOS SOO 8.6 27.3 ± 0.4 32.3 ± 1.3 25.9 ± 1.4 6.6 ± 0.3 7.9 ± 0.3 5.7 26.3 ± 0.6 35.5 ± 0.6 21.2 ± 0.9 9.0 ± 0.6 8.0 ± 0.6 2.9 22.6 ± 0.4 38.5 ± 0.9 14.9 ± 0.2 15.1 ± 0.4 8.9 ± 0.3 1.4 17.8 ± 0.3 40.8 ± 1.0 10.2 ± 0.3 23.2 ± 0.8 8.0 ± 0.2 1.0 13.7 ± 0.6 41.0 ± 1.1 7.3 ± 0.4 30.2 ± 1.5 7.8 ± 0.5 Hoạt độ nước aw tối ưu (0.61) pH tối ưu (pH=9) Năng suất thu hồi bơ cacao Loại dầu Hiệu suất (%) Nhiệt độ nóng chảy (0 C) Mỡ heo 63.0 ± 0.3 34.5 ± 0.7 Dầu cọ 53.0 ± 0.5 34.3 ± 0.6 Chú thích: POL = palmito oleo linolein POS = palmito oleo stearin SOS = stearin oleo stearin SOO = stearin oleo olein CHƯƠNG III : NGUỒN NGUYÊN LIỆU VÀ QUÁ TRÌNH THU NHẬN 1. Nguồn nguyên liệu : Vì enzym là những xúc tác sinh học phổ biến trong thiêên nhiên nên người ta thường thu chúng từ các vật liệu sinh học. Trong tay con người có 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản : các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tuỵ, màng nhầy, dạ dày, tim… những phế liệu của công nghiệp thịt va thuỷ sản dùng để tách enzym rất tiện. Dịch tuỵ ngoài chứa lipase còn có chứa amilase, protease và 1 số enzym khác. Trong phạm vi bài báo cáo này với mục tiêêu tận dụng phế liệu, ta nghiên cứu nguồn nguyên liệu từ tuyến tuỵ của động vật. Tuỵ heo, bò… được lấy ngay sau khi con vật bị giết hay đã được bảo quản ở nhiệt độ đông đá. Trước khi tách chiết để thu nhận enzym, phần tuỵ phải đươc loại bỏ mô liên kết và xay nhỏ bằng máy xay đồng hoá. (Nguồn thu enzym lipase từ tuỵ tạng heo là tốt nhất. Lượng enzym lipase chiếm 2.5% chất khô của tuyến tuỵ ( đã loại bỏ mỡ )). Trong cơ thể vi sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân, microxom, mitokondri…) của tế bào. Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử (mitokondri) của tế bào. Do đó, để có thể chiết rút enzym nội bào, trước hết cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học (nghiền với bột thuỷ tinh hoặc làm đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá) bằng tác dụng của các dung môi hữu cơ (rượu butylic, axeton, glixerin, etylaxetat…), của sóng siêu âm… Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. Đặc điểm nguồn thu nhận enzym từ tuỵ tạng : Cấu tạo : Tuỵ tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài của tuỵ tạng heo khoảng 30 – 35cm, dày 1cm và nặng khoảng 80 – 150g. Tận cùng bên phải là phần đầu, lớn hơn và hướng xuống, tận cùng bên trái là phần đuôi, nhỏ hơn , nằm ngang ở gần lá lách. Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tuỵ tạng thành nhiều thuỳ nhỏ. Tuỵ tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết . Tuỵ tạng được cấu tạo từ 2 loại tế bào gọi là tế bào ngoại tiết và tế bào nội tiết. 98% tuỵ tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hay là tế bào tuyến, các tế bào này tiết enzym tiêu hóa vào trong tá tràng, 2% còn lại của tuỵ tạng đươc cấu tạo bởi các tế bào nội tiết và các tế bào này tiết hormon vào mạch máu để duy trì sự cân bằng glucose trong máu. Phần ngoại tiết gồm các ống tuỵ tiết dịch tuỵa1 tràng gồm các enzym cần thiết cho quá trình tiêu hoá ở ruột. 2. Quy trình thu nhận lipase từ tuỵ heo: 2.1. Phương pháp tách chiết Lipase với aceton và rửa tủa (lần 2) bằng aceton: Tách bỏ mô liên kết Xay nhỏ Cân Tuỵ heo bảo quản tươi ở nhiệt độ đông đá Lọc lấy dd bằng rây Tủa thu lấy E Ly tâm lấy tủa (lần 1) Rửa tủa bằng aceton Ly tâm lấy tủa (lần 2) Sấy tủa nhẹ ở 30 – 35oC Nghiền nhỏ sản phẩm Lipase thô 2.2. Phương pháp tách chiết Lipase bằng cồn : Các giai đoạn tách chiết với cồn tuyệt đối với những tỉ lệ 1:4, 1:5, 1:7 và cồn 96o tương tự như với aceton nhưng thay aceton bằng cồn. 2.3. Phương pháp tách chiết Lipase kết tủa bằng (NH4)2SO4 : Cân Lọc lấy dd Tuỵ heo bảo quản tươi Tách bỏ mô liên kết Xay nhỏ sản phẩm Lipase thô Lọc lấy dd Ly tâm lấy tủa Sấy tủa nhẹ ở 40oC Nghiền nhỏ 2.4. Phương pháp thu nhận lipase thô bằng phương pháp sấy: Lấy tuỵ tươi đã được bảo quản, cân trọng lương và trộn với tinh bột 1 lượng bằng 10% so với trọng lương tuỵ tươi, tiếp theo sấy ở những nhiệt độ 50oC, 60oC, 70oC. Sau 1 thời gian sấy ở những nhiệt độ trên thì ta đem xay nhuyễn và được chế phẩm lipase thô. Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra 1 nhiệt lượng lớn có thể làm mất hoạt tính của enzym. Do đó dung dịch sau lọc cùng dung môi được làm lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp ( t = 5-10’, trong lúc đó nhiệt độ không quá 5oC ) Trong quá trình ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose, hay tinh bột là các chất phụ gia có tính chất ổn định enzym đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzym trong khi sấy . Thường sấy ở chân không nhiệt độ to = 45oC. Sấy khô : sau khi li tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô có thổi khí ở nhiệt độ 30 – 40oC hoặc sấy chân không hay thiết bị sấy đông khô. Để tránh bị mất hoạt tính người ta trộïn thêm vào chế phẩm enzym các chất độn như tinh bột hoà tan, maltose dextrin trong quá trình sấy. Phương pháp tách và làm sạch enzym: Gần đây ứng dụng các phương pháp mới (điện di, sắc ký trao đổi ion, lọc gel…) phối hợp với các biện pháp thường đđược dùng trước đây ( biến tính chọn lọc, kết tủa phân đoạn, sắc ký hấp phụ) cho phép thu được phẩm vật của nhiều enzym với độ thuần khiết cao. Mặc dù trong việc xây dựng phương pháp mới đã đạt được nhiều kết quả, tuy nhiên vấn đề tách làm thuần khiết enzym hiện nay vẫn còn là một công tác phức tạp, khó khăn. Nguyên nhân chủ yếu do một mặt enzym có trong tế bào với lượng rất ít, mặc khác nó luôn có đồng thời với các protein khác cũng có các tính chất lý hoá rất giống nhau, hơn nữa enzym lại rất không bền, dễ bị mất khả năng xúc tác do tác động của các yếu tố bên ngoài. Trong dịch chiết, ngoài enzym còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng các biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadexê Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel. Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường chỉ dùng đối với trường hợp của các enzym bền nhiệt hoặc bền axit. Dịch enzym đươc giữ ở 50-70oC hay ở pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác định sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein (enzym) ở một nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hoà) xác đinnh5 được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzym. Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ. Phương pháp này chỉ dùng với những enzym ít bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ được chọn dùng. Để giữ cho enzym khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình phải đươc thực hiện ở nhiệt độ thấp (-5oC). Phương pháp hấp phụ chọn lọc – hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch enzym) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym. Chất hấp phụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao. Hấp phụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách: chất hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụ enzym. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Enzym sau đó đươc chiết bằng các dung môi thích hợp. Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa tên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein đđược tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hoặc các dẫn xuất ester của xelulloza (cacboxymetylxelluloza, dietylaminoetylxelluloza, trietylaminoetylxelluloza…). Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza (DEAE-xelluloza) có ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còn có khả năng loại bỏ các tạp chất axit nucleic. Điều đó cho phép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixin sunfat thường được dùng trước đây. Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đó các phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng của epiclohidrin tạo thành “sàng phân tử”. Số liên kết ngang tạo thành càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp một hỗn hợp gồm nhiều chất trên cột sephadex, các chất phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuyếch tán vào bên trong các sephadex đã đươc ngâm trong dung dịch đệm, còn các phân tử chất có kích thước lớn hơn không có khả năng đi vào các hạt sẽ đươc chiết nhanh khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của các enzym (12700-1000000) cho phép tách và làm sạch enzym bằng phương pháp lọc gel sephadex là phương pháp có nhiều triển vọng. Cho o6ng có phương pháp tách làm sạch chung cho các enzym. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzym nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau. CHƯƠNG V : CÁC ỨNG DỤNG CỦA ENZYM LIPASE 1. Ứng dụng Lipase trong công nghiệp thực phẩm : - Trong công nghiệp chất béo và bơ thực vật: Tổng hợp nên các chất béo có giá trị cao từ các chất béo có giá trị thấp hơn như tổng hợp chất thay thế bơ cacao từ dầu cọ phân đoạn bằng phàn ứng nội chuyển hóa Xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ester trong các dung môi hữu cơ tạo ra các chất tương đương với bơ cacao, chất thay thế chất béo có trong sữa người có tên “Betapol”, sử dụng lipase trong cong nghiệp sản xuất ra các axit béo nhiều nối đôi quan trọng và sản xuất dầu diesel sinh học từ dầu thực vật Xúc tác phản ứng thủy phân chất béo như mỡ bò ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn tránh làm hỏng các axit béo sản phẩm đặc biệt là các axit béo nhiều nối đôi có giá trị dinh dưỡng cao Thủy phân chất béo tạo ra axit béo và glycerol, axit béo được dùng trong công nghiệp sản xuất xà phòng v.v. - Trong chế biến thực phẩm làm tăng hương vị và nâng cao chất lượng Chuyển đổi các loại dầu kém chất lượng thành các triacylglycerol có giá trị dinh dưỡng như tổng hợp chất thay thế bơ cacao Lipase được thêm vào thực phẩm nhằm biến đổi hương bằng phản ứng ester hóa tạo ra các ester tạo hương và mùi thơm Lipase thủy phân loại bỏ mỡ trong quá trinh chế biến các sản phẩm thịt nạc như thịt cá Lipase còn được dùng trong việc tăng hương thơm cho gạo, biến đổi sữa đậu nành và tăng hương thơm cho rượu táo. - Tạo hương cho sản phẩm bánh kẹo và phomat: Nguyên lý Lipase tham gia phản ứng thủy phân tạo ra các axit béo góp phần tạo hương cho sản phẩm Nếu giải phóng các axit béo mạch ngắn C4-C6 tạo cấu trúc và tạo mùi gắt Nếu giải phóng các axit béo mạch trung bình C12-C14 thường tạo mùi xà phòng Phomát được ủ với lipase ở nhiệt độ cao tạo ra sản phẩm phomát biến đổi bằng enzym (EMC) có mùi đặc trưng Tác giả Shay (1971) dùng lipase thủy phân dịch chiết từ mỡ bò tạo ra các axit béo tạo hương phomát Lipase góp phần tăng thời gian sử dụng của bánh mì - Trong chế biến chè: Nguyên lý Lipase thủy phân phân hủy lớp màng béo trong quá trình chế biến chè đen tạo ra các sản phẩm axit bay hơi góp phần tạo hương cho sản phẩm Lipase từ chủng Rhizomucor miehei giúp nâng cao hàm lượng của các axit béo nhiều nối đôi (tạo hương cho sản phẩm). 2. Ứng dụng của lipase trong các ngành công nghiệp : Sản xuất ra các hợp chất cao phân tử có thể phân giải bằng phương pháp sinh học: Nguyên lý Lipase được dùng như một chất xúc tác trong quá trình tổng hợp nên các chất cao phân tử có khả năng phân giải bằng phương pháp sinh học Ví dụ như tổng hợp 1-butyl oleate từ phản ứng ester hóa butanol và axit béo với xúc tác là lipase có tác dụng làm giảm độ nhớt của dầu diesel sinh học dùng trong mùa đông Ester trimethylolpropan cũng được tổng hợp tương tự như trên dùng làm chất bôi trơn - Ứng dụng lipase như một chất cảm ứng sinh học ( Đầu dò sinh học): Nguyên lý: Một chất cảm ứng sinh học hoạt động dựa trên sự hòa tan lớp màng polymer (có thể phân hủy bằng phương pháp sinh học) bằng enzym. Lipase sẽ phân huỷ lớp màng polymer đó. Ứng dụng lipase trong công nghiệp dệt: Nguyên lý: Lipase thủy phân các chất nhớt trong sợi vải giúp tăng tính bền, tăng khả năng hấp thụ khi nhuộm màu Thủy phân các thành phần màu có cấu tạo ester để làm phai màu vải Jean trong hệ thống có sử dụng đá, chất xúc tác và enzym