Đồ án Tổng quan tài liệu về Biosensor

h của Enzym theo thời gian. Mô và cơ quan: Có thể tận dụng các phần mô thực vật hay mô động vật làm nguồn nguyên liệu cung cấp enzym vì chúng có khả năng gắn kết cao, có một cấu trúc đủ mạnh để gắn kết trực tiếp lên bộ biến năng mà không cần đến kỹ thuật cố định protein. Mô thực vật – động vật: Thực vật là nguồn enzym hữu dụng cho hóa học phân tích. Bằng việc sử dụng bộ biến năng thích hợp, có thể chế tạo Biosensor có tính năng ổn định cao vì các enzym vẫn được duy trì hoạt tính trong mô thực vật. Tương tự như vậy, mô động vật được xem như là một bộ thụ cảm sinh học hữu dụng cho sự phát hiện chọn lọc L-amiono acid mà không bị ảnh hưởng đáng kể bởi D-amino acid. Để tăng khả năng chọn lọc có thể kết hợp một chất kháng khuẩn để tránh sự nhiễm khuẩn, chẳng hạn như thêm 0.02% NaOH vào điện cực glutamine. Bộ phận cơ quan: Các xúc tác sinh học cũng được tìm thấy trong các cơ quan tế bào như lysosome, lục lạp, thể hạt và vi thể vì chúng chứa nhiều hệ thống enzym được dùng trong biosensor. Chẳng hạn như vi thể gan có hệ thống enzym monooxidase với cytochrome P 450 xúc tác cho phản ứng oxy hoá nhiều acid béo, hormone steroids… Các cơ quan tế bào được gắn trực tiếp lên bộ biến năng đo dòng điện trong thiết bị Biosensor. Tác nhân miễn dịch: Kháng nguyên và kháng thể cũng được sử dụng làm bộ thụ cảm sinh học. Tính chọn lọc của Biosensor được quyết định bởi kháng thể và tính nhạy cảm được quyết định bởi enzym kết hợp. Kháng thể được cố định vào bộ biến năng nhờ vào kỹ thuật Miễn dịch học Enzym (EIA). Hoặc thay enzym bằng chất mang ion đóng vai trò như chất trung gian của các quá trình điện hóa miễn dịch. Kháng nguyên thích hợp với kháng thể được kết hợp với chất mang ion tạo ra sự tiếp hợp được phát hiện bởi bộ biến năng điện hóa. Bộ thụ cảm hóa học: Màng tế bào cũng được sử dụng do khả năng kích thích hóa học gây ra sự thay đổi cấu tạo. Các tế bào thần kinh cũng được dùng trong phát hiện thuốc, độc tố hay các chất khác. CHỌN LỰA BỘ BIẾN NĂNG: Bảng 3.1: Hiện trạng nghiên cứu của Biosensor với bộ biến năng tương ứng: Bộ biến năng Biosensor Enzym Tế bào, vi sinh vật Tác nhân miễn dịch Mô thực vật-động vật Bộ thụ cảm hóa học Tế bào điện hóa Đo dòng điện xxx xx xx x Đo điện thế xxx xx xx x x Bán dẫn (IFET) xx x Đo nhiệt (Thermistor) x x Đo quang (sợi quang học) x x Aùp điện x x Cơ hóa học x Chú thích: x: Đang nghiên cứu cơ bản xx: Đã nghiên cứu và phát triển những mẫu đầu tiên xxx: Những thiết bị có mặt trên thị trường Phụ thuộc vào kiểu phản ứng và từng ứng dụng cụ thể của Biosensor mà chọn bộ biến năng phù hợp. Nếu nó được dùng trong sinh học thì cần phải đáp ứng các tiêu chuẩn tương ứng như khả năng tách protein, lipid hay tế bào. Nếu nó được dùng trong invivo thì cần phải giảm kích thước tối thiểu và đòi hỏi hình dạng của nó phải phù hợp để không phá huỷ mô thực vật-động vật, đồng thời cũng có khả năng loại bỏ độc tố, kim loại hoặc các thành phần đa phân tử ra khỏi bộ biến năng. Vấn đề tác động hóa học cũng ảnh hưởng đến sự chọn lựa bộ biến năng. Có thể kết hợp enzym urese vào các điện cực pH, pCO2, hay pNH3. Bộ biến năng tốt nhất cho việc xác định ure trong một mẫu sinh học là các điện cực pCO2, pNH3 bởi chúng có một màng thẩm thấu để loại bỏ tất cả những ảnh hưởng của cation và anion. SỰ CỐ ĐỊNH THÀNH PHẦN SINH HỌC LÊN BỘ BIẾN NĂNG: Việc cố định các thành tố sinh học, nhất là enzym thường đem lại nhiều lợi nhuận hơn trong việc ứng như: Làm cho enzym trong nhiều trường hợp bền hơn. Tách phức enzym – chất mang ra khỏi mẫu dễ dàng. Hoạt độ enzym giữ được ổn định trong một thời gian dài. Tuy nhiên, việc sử dụng enzym cố định cũng có những hạn chế nhất định như: Sự chuyển khối bị hạn chế. Có thể mất hoạt tính khi cố định. Không có hiệu quả đối với cơ chất rắn. Mất tính thích nghi hình thể. Nhưng những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại. Do vậy ngày càng có nhiều nghiên cứu mới cũng như các công nghệ mới để cố định enzym. Người ta thường cố định các thành phần sinh học lên một chất mang rắn bằng nhiều cách. Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo những yêu cầu nhất định, nhất là khi các điện cực sinh học (biosensor) được đưa vào sử dụng trong thực tế: Các cấu tử sinh học phải giữ được hoạt độ khi gắn trên bề mặt biosensor. Màng sinh học phải được gắn chặt với bề mặt cảm biến và vẫn giữ được cấu trúc và chức năng. Màng sinh học đã được cố định phải ổn định và bền trong một thời gian dài. Vật liệu sinh học cần có tính đặc trưng riêng đối với từng cấu tử sinh học. Để cố định các thành phần sinh học trong Biosensor, người ta thường sử dụng các kỹ thuật như hấp thụ vật lý, bao gói trong khuôn gel hoặc trong polymer, liên kết đồng hóa trị với chất mang và liên kết chéo các protein. Hình 3.1: Một số phương pháp cố định thường dùng trong điện cực sinh học Sự cố định Enzym: Sự cố định bằng hấp thụ vật lý: Điện cực Enzym đầu tiên được chế tạo bởi Updike và Hicks bằng cách cố định Enzym Glucose oxidase trong một lớp gel polyacrylamide, sau đó Enzym này được gắn lên màng Plastic của điện cực oxy. Hoặc có thể cố định một enzym lên một thành phần nhạy cảm của một điện cực bằng màng thẩm thấu ngăn cản sự khuếch tán protein. Guibault và Shu đã chế tạo một điện cực enzym nhạy cảm với ure bằng cách trải một dung dịch huyền phù của enzym urease lên bề mặt của điện cực có màng nilon và bao bọc khít hoàn toàn bằng màng thẩm thấu, sau đó điện cực enzym này được rửa sạch với nước và sẵn sàng để sử dụng. Nguyên tắc của phương pháp hấp phụ vật lý như sau: Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein như lực Valderwaalls, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Khi chất mang không có lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang. Khi chất mang có lỗ xốp, enzym chui vào trong các lỗ xốp của chất mang. Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết giữa chất mang và enzym là liên kết ion (Liên kết này bền hơn so với hấp phụ). Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ hay liên kết ion: Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin. Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide của kim loại. Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE – celllulose, CM – cellulose. Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl. Phương pháp điều chế: Cho enzym và chất mang tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại bỏ những phân tử bị gắn yếu lên chất mang. Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bền của liên kết cố định: Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuận với nồng độ của nó ở một giới hạn nhất định. pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện ở chất mang cũng như ở protein enzym. Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzym cố định được bằng liên kết ion. Đồng thời sự thay đổi pH đột ngột thường dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzym. Lực ion của môi trường: sự có mặt của các muối tích điện trái dấu với chất mang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong dung dịch. Tuy nhiên, sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của protein do đó ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định. Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm tăng liên kết protein enzym với chất mang, nhưng cũng làm mất hoạt tính của enzym. Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzym có khối lượng phân tử càng nhỏ thì hấp phụ càng cao. Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt hơn và bền hơn. Tuy nhiên sự cố định vật lý ngày nay ít được sử dụng do sự có mặt của enzym trong dung dịch không giữ được hoạt tính trong thời gian dài. Do đó sự cố định hóa học, sử dụng các liên kết đồng hóa trị sẽ đảm bảo độ bền của enzym trong một thời gian khá dài. Sự cố định bằng liên kết ngang (cross – linking immobilization): Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nối giữa các nhóm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợp chất có trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và không có tính hòa tan. Có thể tạo liên kết ngang các phân tử của cùng enzym hay cố kết hai hay nhiều protein với nhau (enzym với enzym hay enzym với protein hoặc nhiều enzym trên protein mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bò (BSA). Ngay cả cơ quan hay các tế bào cũng có thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang. Glutaraldehyde là tác nhân tạo liên kết ngang thường dùng. Tác nhân có hai nhóm chức aldehyde ở các đầu mạch này sẽ phản ứng với nhóm amine trên phân tử protein hay enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base: Cũng có thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác như hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang. Có 4 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang: Phương pháp ngâm (Immersion method) Ứng dụng: Phương pháp ngâm này dùng để cố định enzym urease lên điện cực thủy tinh hay điện cực pH-nhạy cảm với các cation hóa trị I. Nguyên tắc: Chuẩn bị dung dịch cố định: Lấy 600 đơn vị I.U enzym Urease hòa tan trong 1ml đệm phosphate 0.02M, pH = 6.8. Thêm vào 1 ml dung dịch albumine huyết thanh bò 17.5%, sau đó thêm 0.07 mldung dịch glutaraldehyde 25% để thu được nồng độ cuối cùng 0.8%. Khuấy dung dịch trong 2 phút. Chuẩn bị bề mặt hoạt động: Đầu tiên điện cực cation được rửa bằng nước cất, sau đó lau khô bằng giấy lọc. Nhúng ngập bầu điện cực trong dung dịch cố định trên, xoay điện cực nhẹ nhàng xung quanh trục của điện cực trong 15 phút để tạo một lớp dung dịch cố định đồng nhất. Một vòng “O” được gắn khít vào để giữ cho màng enzym này bám chặt lên bầu điện cực. Sau đó rửa điện cực bằng nước cất, dung dịch glycine, và cuối cùng bằng nước cất để tách rửa hay trung hòa tác nhân tạo liên kết ngang. Hình 3.2: Nguyên tắc của phương pháp ngâm Ưu điểm: Phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các Enzym lên đa số các bộ biến năng, đặc biệt bộ biến năng nhỏ. Phương pháp kết hợp trực tiếp (Direct binding method): Nguyên tắc: Nhỏ 10 ml dung dịch chứa enzym lên trên đỉnh của một điện cực, sau đó nhỏ 10ml dung dịch chứa tác nhân tạo liên kết glutaraldehyde. Phương pháp này cũng được dùng để cố định enzym lên màng kỵ nước của các điện cực cảm ứng khí như màng fluorocarbon hay polytetrafluoroethylene. Hình 3.3: Phương pháp kết hợp trực tiếp Ưu điểm: Tiết kiệm enzym, dùng để cố định các enzym có giá thành cao. Phương pháp sử dụng bình phun (Use of aerosol): Nguyên tắc: đầu nhạy cảm của một điện cực được rửa và ngâm trong dung dịch enzym khoảng 20 phút để đảm bảo sự hấp thu enzym lên điện cực enzym. Điện cực này sau đó được sấy khô ở 4oC và xoay. Glutaraldehyde được bơm lên trên điện cực từ một khoảng cách đủ lớn để ngăn cản tạo giọt. Sau khi tạo liên kết ngang, điện cực enzym được rửa với nước, sẵn sàng cho việc sử dụng. Ưu điểm: bề dày lớp enzym cực kỳ mỏng (1-2mm) và các biosensor tạo ra có thời gian đáp ứng cực ngắn (5-10s). Ứng dụng: Phương pháp này dùng để cố định enzym pennicilinase, urease và acetylcholinesterase, cố định các protein lên nhiều chất mang. Hình 3.4: Phương pháp sử dụng bình phun Sử dụng màng membrane: Các màng membrane tăng cường-gia cố (Re-inforced membranes): Enzym được cố định lên một diện tích rộng của màng nylon bằng những dĩa nhỏ chứa membrane enzym có cùng mẻ và sự cố định giống nhau. Sau đó các màng này được kẹp vào trong bộ biến năng. Màng membran tăng cường-gia cố này có phần sợi do đó cải thiện tính chất cơ học của màng enzym. Các màng membrane gắn nhóm chức sẵn (Prefunctionalized membrane) dùng các màng membrane xốp sẵn có trên thị trường. Những màng này có các nhóm chức liên kết có khả năng phản ứng với vị trí tự do của enzym. Các màng này sau đó đem ngâm trong dung dịch chứa enzym đã chọn để thu được một màng enzym với những tính chất cơ học hữu dụng. Sự cố định cofactor: Cofactor được cố định lên chất mang đồng thời cùng lúc với enzym bằng phương pháp hấp thụ vật lý, hay bằng liên kết ngang. Cố định Vi sinh vật Vi sinh vật có kích thước lớn hơn enzym do đó dễ dàng cố định bằng phương pháp vật lý. Chúng có thể được cố định bằng gel agar hay polyacrylamide hoặc màng thẩm thấu và màng lọc membrane như millipore 0.22 mm – chế tạo từ ester cellulosic. Toàn bộ tế bào vi sinh vật được cố định trong huyền phù collagen đã được xử lý bởi glutaraldehyde. Màng collagen cũng được sử dụng như một chất mang vật lý. Màng kỵ nước và vi sinh vật có thể được gắn đồng thời lên các điện cực khuếch tán khí chẳng hạn như điện cực pNH3, pO2, pCO2. Vi sinh vật được nhốt trong các lỗ màng lọc cellulose acetate, sau đó rửa các tế bào vi sinh vật tự do trên bề mặt và đặt màng vi sinh vật trên vào điện cực dùng màng thẩm thấu và ngâm trong dung dịch đệm để loại bỏ các thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng tới phép đo. Các điện cực vi sinh vật được bảo quản ở nhiệt độ 40C trong dung dịch đệm phosphate. Hình 3.5: Điện cực vi khuẩn đo dòng điện Cũng có thể cố định một enzym và một tế bào vi sinh vật lên cùng bộ biến năng. Vi sinh vât được cố định bằng phương pháp vật lý và enzym được cố định bằng phương pháp liên kết đồng hóa trị để tránh sự nhả protein. Vi khuẩn acetic thuộc loài Acetobacter xylinum có khả năng tạo ra màng mỏng trong môi trường tĩnh sau khi xử lý với glutaraldehyde và có những tính chất cơ học nhất định thì có thể cố định trực tiếp vào điện cực Oxy mà không cần dùng màng thẩm thấu. Cố định các tác nhân miễn dịch: Nhiều điện cực miễn dịch được tạo ra bằng các cố định các tác nhân miễn dịch lên các bộ biến năng khác nhau. Cố định kháng thể (Immobillization of antibodies): Mục đích: Để phát hiện ra kháng nguyên tương ứng tạo ra kháng thể. Do kháng thể có cấu trúc là protein nên phương pháp cố định kháng thể tương tự như phương pháp cố định enzym: dùng phương pháp cố định trực tiếp hay sử dụng màng membrane. Cố định trực tiếp lên bộ biến năng: Các kháng thể có thể được gắn lên một điện cực carbon bằng liên kết cộng hóa trị. Các nhóm COOH được tạo ra trên điện cực carbon bằng phản ứng điện hóa trong môi trường acid nitric HNO3 và kali bicromat K2Cr2O7 và gắn với kháng thể bằng một tác nhân tạo liên kết ngang như carbodiimide. Hoặc có thể cố định bằng phương pháp hấp phụ kháng thể lên các lớp kim loại vàng hay bạc lắng trên thủy tinh. Sau đó dùng phương pháp dò cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt. Sự cố định bằng màng membrane: Các kháng thể cũng có thể được cố định lên các màng membrane theo trình tự như sau: đầu tiên màng bromo-acetylcellulose được ngâm trong dung dịch chứa hexamethylene diamine, sau đó ngâm trong dung dịch diepoxy butadiene, dung dịch này tạo ra các nhóm sẽ phản ứng với kháng thể, cuối cùng màng này với kháng thể đã đuợc cố định được rửa với dung dịch ethanolamine để loại bỏ những nhóm epoxy không phản ứng. Kháng thể cũng có thể được cố định trong các mạng nylon hoặc hấp thụ vật lý bằng các màng collagen và polyvinylbutyral, sau đó được lắp vào điện cực ISFET. Màng này được hoạt hóa với glutaraldehyde trước khi kết hợp với kháng thể. Các kháng thể cũng có thể được cố định lên sợi quang học. Sự cố định kháng nguyên: Kháng nguyên là các hợp chất bao gồm protein, hydratcarbon,…chúng được cố định bằng những cách khác nhau, không như kháng thể và enzym. Yếu tố quyết định tính kháng nguyên dinitrophenol (DNP) có thể được kết hợp với một chất mang ion dibenzo-18-crown-6 (DB18C6) và sau đó được cố định trong màng polymer. Đầu tiên, ether này được chuyển thành dẫn xuất dạng trans-dinitro và sau đó thành dẫn xuất arylaminey thích hợp cho việc kết hợp với fluorodinitrobenzene. Phức hợp này được hòa tan trong tetrahydrosulfan và thêm dibutylsebacate, sau đó kết hợp phức hợp này trong màng polyvinylchloride (PVC). Cuối cùng màng kháng nguyên được chia thành những đĩa nhỏ được gắn lên trên đỉnh của điện cực. Các biosensor tạo ra nhạy cảm trực tiếp với các kháng thể. Tuy nhiên, điện cực tạo ra bằng cách này vẫn có nhược điểm đó là DNP có một ái lực đối với ion K+ của dung dịch chất điện phân bên trong điện cực, do đó cho kết quả không chính xác. Để hạn chế điều này, một điện cực rắn với nhựa epoxy nhồi đá granite được chế tạo. Đầu tiên, người ta đổ nay nhựa thông vào bên trong ống PVC chứa một dĩa bằng Pt cùng đường kính với ống, sau đó đổ dung dịch tetrahydrofuran, 10 mg/ml DNP-kháng nguyên và 15% triocyl acetate vào trong lỗ khoan của nhựa thông. Hình 3.6: Sự cố định kháng thể lên màng membrane bromo-acetylcellulose Hình 3.7: Điện cực kháng nguyên dùng PVC rắn với DNP Sự gắn enzym: Khi một tác nhân miễn dịch được cố định lên bộ biến năng hay lên màng membrane thì sự kết hợp miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhưng khó được phát hiện bởi bộ biến năng, thông thường phản ứng miễn dịch có thể được dò khi bổ sung vào enzym để xúc tác quá trình phản ứng. Kháng nguyên hay kháng thể được gắn với một enzym sử dụng kỹ thuật EIA (miễn dịch enzym) hay ELISA. Enzym được gắn với tác nhân miễn dịch bằng tác nhân tạo liên kết ngang hai chức glutaraldehyde. Tuỳ thuộc vào từng loại bộ biến năng mà gắn kháng nguyên hay kháng thể với enzym cho phù hợp: Nếu sử dụng bộ biến năng là điện cực pO2 thì kháng nguyên được gắn với enzym glucose oxidase hoặc catalase. Khi bộ biến năng là điện cực pNH3 kháng nguyên được gắn với enzym urease. Cố định mô, cơ quan và chemoreceptor: Cơ quan và mô thực vật – động vật: Đầu tiên, một lát mô thực vật hay động vật được cắt ra, và chèn vào giữa hai màng bán thấm rồi gắn chúng lên bộ biến năng. Thường dùng điện cực pO2, pCO2, hay pNH3. Mô động vật có thể là gan bò, gan thỏ, bắp thịt thỏ hay cơ ruột, hay thành phần tế bào. Các cơ quan này được gắn vào bộ biến năng sẽ làm cho Biosensor chọn lọc hơn bởi vì chúng chứa những enzym đặc biệt. Biosensor gắn mô thực vật – động vật nhìn chung có thời gian đáp ứng dài hơn Biosensor gắn enzym. Thời gian đáp ứng nhanh của Biosensor này có thể đạt được nếu như gắn các mô này trong bột than dạng paste nhằm tạo ra sự tiếp xúc lớn hơn giữa chất xúc tác sinh học và thành phần cảm ứng: Cắt những lát mô và nhồi vào trong hồ vữa, sau đó trộn với dầu khoáng và bột than chì để tạo hỗn hợp nhão và cuối cùng trải đều lên đầu điện cực. Chemoreceptor: Receptor là râu nhỏ của loài cua xanh Callinectes sapidus có sợi thần kinh được sử dụng như bộ biến năng để truyền dẫn xung động thần kinh gây ra bởi khứu giác hay vị giác, chúng được cố định trực tiếp vào điện cực dò Pt của điện cực đo điện thế. Điện cực so sánh Ag/AgCl được nhúng vào dung dịch muối, và sẽ tạo ra sự chênh lệch điện thế so với điện cực dò. Bằng việc dùng các liều tác nhân kích thích khác nhau vào trong dòng chất mang sẽ gây ra những thay đổi về cấu tạo của receptor và kết quả tạo ra một sự thay đổi về khả năng thấm của màng kích thích hay sự thay đổi hoạt tính enzym được gắn lên màng. Sự phân cực của sợi trục axon sẽ làm tăng điện thế đo được. Biosensor dựa trên các receptor thần kinh có thể dùng để phát hiện độc tố hay các chất độc hóa học đã sử dụng trong chiến tranh. Sử dụng receptor acetylcholine có thể xác định acetylcholine bằng cách dò trở kháng đặc trưng so với các bộ truyền thần kinh khác, receptor này được gắn enzym acetylcholinesterase nhạy cảm với hợp chất phosphor hữu cơ và carbamate, receptor được cố định lên bộ biến năng thích hợp bằng cách ngâm đầu nhạy cảm của điện cực vào trong dung dịch liposome chứa receptor. CHƯƠNG 4 ĐIỆN CỰC ENZYM NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG: Điện cực enzym hoạt động như sau: Chuyển cơ chất từ trong dung dịch vào trong màng enzym Khuếch tán cơ chất bên trong màng enzym, kèm theo quá trình biến đổi cơ chất thành sản phẩm nhờ phản ứng có enzym xúc tác. Chuyển sản phẩm về phía bộ biến năng Chuyển đổi nồng độ sản phẩm ở bề mặt phân cách giữa bộ biến năng và sản phẩm thành tín hiệu điện nhờ bộ biến năng. Hình 4.1: Nguyên tắc hoạt động của điện cực enzym S : cơ chất P: sản phẩm Lớp màng enzym càng mỏng thì sự cân bằng nồng độ cơ chất bên trong và bên ngoài lớp màng enzym càng nhanh đạt được. Dung dịch mẫu cần được khuấy đảo đồng đều để đảm bảo cơ chất là đồng nhất. CƠ SỞ LÝ THUYẾT: Sự xúc tác của enzym thường được thực hiện bằng cách tạo ra ít nhất một phức hợp tạm thời giữa enzym và cơ chất. Mô hình đơn giản nhất là mô hình của Michaelis. Mô hình này thừa nhận rằng phản ứng chỉ xảy ra với một cơ chất và tạo ra chỉ một sản phẩm: Tốc độ phản ứng: (2) Với Km là hằng số Michaelis, , Vm là tốc độ phản ứng cực đại khi [S] >> Km, Vm = k+2 [E0] – [E0]: nồng độ enzym ban đầu. [S]: nồng độ cơ chất [P]: nồng độ sản phẩm. Đối với enzym đã biết, tốc độ phản ứng V là hàm của tỷ số [S]/Km. Khi , thì . Khi thì . Bên trong lớp màng enzym, tốc độ phản ứng bao gồm cả tốc độ khuếch tán nhiều cơ chất trong dung dịch: (3) (4) Với t: thời gian phản ứng, DS, DP là hệ số khuếch tán của cơ và sản phẩm ở bên trong lớp màng enzym x: khoảng cách giữa một điểm cho trước trong màng enzym và bề mặt ngoài của điện cực. Sự trả lời tín hiệu ở trạng thái nhanh: Phương trình (3) và (4) cho biết nồng độ của cơ chất và sản phẩm ở bề mặt bộ biến năng phụ thuộc vào hằng số Michaelis Km, vận tốc phản ứng cực đại Vm của lớp màng enzym, bề dày của lớp màng và hệ số khuếch tán DS, DP. Giả thiết rằng nồng độ của sản phẩm ở bề mặt ngoài của điện cực bằng không (do sự khuếch tán chỉ xảy ra ở trong lớp màng enzym. Nhiệt độ, Vm, Km, DS, DP xem như không đổi trong suốt toàn bộ lớp màng. Đồng thời giả định rằng bộ biến năng không làm thất thoát sản phẩm hay cơ chất. Ta có: Với e: bề dày của lớp màng enzym. Khi đó phương trình (3) và (4) trở thành: (3’) (4’) Ở giai đoạn này, phản ứng xảy ra nhanh chóng, có sự kết hợp giữa cơ chất và enzym để tạo ra phức hợp enzym - cơ chất. Nồng độ cơ chất và nồng độ sản phẩm trong một đơn vị thể tích dung dịch là Km, thời gian khuếch tán của cơ chất qua bề dày của lớp màng là e2/DS. Ở thời gian t