Đồ án Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

nhiên này là một ưu thế hơn những chất mang tổng hợp. Kissiris có tính bền, ổn định, nguồn gốc tự nhiên. Mặc dù cả kissiris và tế bào nấm men đều tích điện âm trên bề mặt, kissiris ít điện tích âm hơn và trong khoảng pH từ 3 đến 7 thì sự liên kết với tế bào nấm men có thể xảy ra. Nhược: Nguyên liệu có thể bị rã ra trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, và có thể thải ra một số độc tố không mong muốn trong môi trường. b. Phương pháp chuẩn bị Kissiris:[39] Một miếng kissiris khoảng 100g được đập vỡ thành những miếng tròn đường kính khoảng 1cm sử dụng một cái búa nhỏ. Những miếng kissiris được ngâm vào trong dung dịch NaOH 0,1M trong một vài phút, sau đó được ngâm trong dung dịch H2SO4 0,05M. Những miếng này được rửa với nước cất một vài lần cho đến khi pH của dung dịch là pH 6,5 và không còn tính chất axit. Chúng được đặt trong một cái cốc đặt trong bể nước sôi trong 10 phút và sau đó làm khô chúng trong lò ở 105oC suốt đêm. Cuối cùng kissiris được khử trùng ở nhiệt độ 180oC trong một giờ. Kissiris Ngâm Làm khô Rửa Kissiris đã được chuẩn bị Hình III.4 Đá kissiris. c. Hiệu quả của phương pháp cố định: [3] Chất xúc tác sinh học được mang trên kissiris, được chuẩn bị bằng cách cố định chủng nấm men chịu cồn, chịu lạnh trên mineral kissiris, phù hợp với quá trình sản xuất rượu vang liên tục ở nhiệt độ thấp (5-16oC). Năng suất sản xuất ethanol ở 5oC bởi quá trình lên men liên tục thì bằng với năng suất quan sát ở nhiệt độ 22-25oC bởi quá trình lên men tự nhiên. Hiệu quả quan trọng đạt được ở nhiệt độ thấp là do sự giảm năng lượng hoạt hóa, gây ra bởi chất mang mineral kissiris. Thiết bị lên men liên tục hoạt động trong 75 ngày mà không có sự giảm bớt năng suất sản xuất ethanol. Và điều cuối cùng là rượu được sản xuất với lượng axit tổng cộng và axit bay hơi thấp khi so sánh với rượu đạt được bởi quá trình lên men tự nhiên ở 22-25oC. Vấn đề bảo quản chất mang liên tục ở nhiệt độ thấp: Tăng tính ổn định của chất xúc tác sinh học và tăng năng suất sản xuất ethanol và rượu. Đặc biệt tế bào có thể sống trong 2,5 năm, sản xuất rượu theo mẻ và quá trình liên tục. Thêm vào đó năng suất sản xuất rượu và ethanol cao hơn ít nhất là năm lần khi so với tế bào cố định trên chất mang tương tự mà không bảo quản ở nhiệt độ thấp. Sự chuyển hóa và nồng độ ethanol cao hơn khi lên men với chất xúc tác mang trên kissiris mà không bảo quản liên tiếp ở 0oC. DEAE-cellulose [24] a. Chất mang và nguyên tắc cố định tế bào: Hạt DEAE-cellulose (trao đổi ion yếu) là chất mang có thể tiệt trùng được và có tính chất không nén, kết tụ với polystyrene. Nó bền trong môi trường axit và kiềm, có thể chịu được nhiệt độ lên đến 100 oC nên dễ dàng tiệt trùng trong cột. Hệ thống chất mang được chuẩn bị như sau, hydrat hóa chất mang khô trong nước sau đó bơm vào cột phản ứng. Quá trình cố định tế bào nấm men được thực hiện sau khi tiệt trùng chất mang bằng cách bơm hỗn hợp huyền phù nấm men vào trong thiết bị phản ứng. Chất mang DEAE-cellulose có khả năng liên kết nấm men lên bề mặt của nó. Đó là nhờ vào đặc điểm bề mặt chất mang, gồ ghề, có mắt lưới, và tồn tại một mạng xốp dạng hạt hoặc liên tục. Khả năng liên kết này là do lực điện từ giữa nhóm trao đổi anion (tích điện dương) của chất mang và thành tế bào tích điện âm. Mật độ tế bào nấm men tốt nhất là vào khoảng 109-1012 tế bào trên 1 lít của chất mang, tối ưu là khoảng 109 tế bào. Mật độ phải có khả năng cung cấp đủ hoạt tính xúc tác để chuyển đường thành ethanol. b. Phương pháp chuẩn bị cột và cố định tế bào. Trước tiên cho nước vào nửa bình hydrat hoá, khởi động hệ thống và cho chất mang khô vào bình. Khi quá trình hydrat hóa hoàn thành (khoảng 5 giờ), cho nước vào reactor đến phân nửa và hỗn hợp chất mang từ bình hydrat được chuyển vào reactor. Để giữ mức nước trong reactor ổn định, van dưới cùng trong reactor được điều chỉnh để dòng chảy vào và ra như nhau. Chất mang trong thiết bị được khử trùng với dung dịch kiềm pha loãng bằng cách bơm nó qua reactor. Đệm chất mang sau đó được rửa với nước và trung hoà bằng một lượng axit loãng phù hợp bơm qua reactor và cuối cùng đệm chất mang được rửa bằng nước đã khử trùng. Hỗn hợp nấm men được bơm qua đệm chất mang trong khoảng 1 - 4 giờ và nấm men tự bản thân nó liên kết với chất mang. Nấm men cố định lên trên chất mang trong reactor. Chất mang Hydrat hoá Chuyển vào reactor Khử trùng Rửa và trung hoà Cố định tế bào Nấm men Tế bào cố định c. Hiệu quả của phương pháp cố định: Chất mang là một điều kiện quan trọng để cung cấp môi trường cho nấm men tăng trưởng và tiếp xúc với cơ chất. Chất mang trao đổi anion, không nén DEAE-cellulose có một vài đặc trưng có lợi hơn khi so sánh với chất mang mềm dạng gel như hạt gel alginat. Đó là gặp ít vấn đề về chuyển khối hơn, cố định dễ dàng hơn, sự khởi động nhanh hơn, mở rộng phạm vi dễ dàng hơn, cải thiện về khả năng tái sinh và thời gian sử dụng chất mang. Chất mang được làm từ DEAE-cellulose thì dễ sử dụng để lên men cồn do có sự tiếp xúc tốt giữa nấm men và cơ chất. Kiểu tương tác giữa tế bào nấm men cố định và chất mang này có thể giải thích cho sự tăng về năng suất. Đối với hạt alginat nấm men tăng trưởng trong từng vùng, một vài tăng trưởng đi qua lớp gel alginat đến bề mặt hạt. Những vùng nấm men như là những khu vực hoạt hóa trong hạt alginat. Còn những hạt DEAE-cellulose thì xốp và mạng hình mắt lưới của những vi sợi. Cấu trúc này cho phép cơ chất có thể đến gần tế bào nấm men tăng trưởng bên trong hạt. Do đó mà tế bào tăng trưởng khá lỏng lẻo và tách biệt nhau bên trong và bên ngoài của bao vi sợi và những tế bào riêng lẻ này hoạt động như là vị trí hoạt hóa lên men trong cột. Nhiều tế bào trên một đơn vị diện tích bề mặt có thể lên men. Cơ chế của việc cố định tế bào nấm men trên bề mặt hạt DEAE-cellulose, cung cấp nhiều lợi ích: 1.Tế bào nấm men về cơ bản thì tất cả ở trên bề mặt chất mang. Do đó tế bào nấm men hoạt động như là chúng lơ lửng tự do trong dung dịch. 2. Giới hạn về khuyếch tán không đáng kể, và cơ chất di động hình thành sự tiếp xúc tự do với nấm men. Cũng như chất dinh dưỡng mà nấm men cần để sống sẵn có để dùng mà không bị ngăn cản bởi nhu cầu thấm vào bên trong của phần tử chất mang. 3. Tính chất chất mang cho phép khởi động và tái sinh dễ dàng bởi vì sự cố định tế bào nấm men có thể thực hiện ngay trong cột. Phương pháp này làm giảm sự rủi ro nhiễm và cải thiện điều kiện của hệ thống về toàn bộ. Thêm vào đó cột có thể tái sinh dễ dàng thể hiện một tính kinh tế quan trọng. Việc tái sử dụng đôi khi cần thiết bởi vì tạp chất hóa học và sự nhiễm từ dung dịch, nhiễm vi sinh vật và từ sự biến đổi việc cố định tế bào nấm men. Để tái sinh cột phản ứng làm từ chất mang như DEAE-cellulose, cột đã sử dụng có thể được rửa và tiệt trùng với dung dịch kiềm nóng hoặc với một môi trường tiệt trùng khác như là một tác nhân hữu cơ trong nước. Sau khi rửa và trung hòa thì chất mang sẵn sàng để tái cố định tế bào. Ở quy mô nhỏ, cột có thể sử dụng 13 tuần mà không cần tái sinh. Trong phòng thí nghiệm, cột tương tự có thể dùng trong 30 tuần. Nói chung toàn bộ hệ thống thiết bị phản ứng, bao gồm cả chất mang, có thể tiệt trùng như trên. Khi nấm men trong môi trường vô trùng sau đó được bơm vào hoặc tách rửa qua đệm chất mang, rủi ro nhiễm nấm men hoặc chất mang với chủng dại, vi khuẩn dại là nhỏ nhất. Khi nấm men liên kết với cột (109-1012 tế bào nấm men/ 1lít chất mang), cột có thể có điều kiện tốt hơn bởi sự bơm chậm chất dinh dưỡng như là môi trường amoni phophat và đường qua cột phản ứng trong khoảng một ngày. Quá trình này giúp nấm men phát triển đến mật độ lớn nhất. Hệ thống sản xuất ethanol nhanh và thuận tiện hơn quá trình lên men truyền thống, sản xuất ra sản phẩm với mùi vị tương đương. Thời gian cần thiết để lên men giảm, từ vài tuần thành vài giờ tiết kiệm về thời gian và tiền bạc. d.Các yếu tố ảnh hưởng: Dưới áp suất thường, thiết bị lên men liên tục hay bình phản ứng có thể vận hành như sau. Cơ chất được cho vào ở dưới thiết bị phản ứng và CO2, hình thành trong suốt quá trình lên men, được phép tự do thoát ra khỏi đệm chất mang. Tuy nhiên với kỹ thuật này không thể đạt đến trạng thái chảy lý tưởng (khí CO2 luôn làm xáo trộn đệm) và sự hòa tan trở lại của nó gây ức chế ethanol nên năng suất thấp. Hệ thống chất mang này có thể vận hành dưới điều kiện áp suất để giữ cacbon dioxide ở trạng thái hòa tan. Cột vận hành trong điều kiện dòng chảy xuống, và tiến đến sự chảy lý tưởng. Aùp suất vận hành nên đủ cao để tránh cacbon dioxide trong cột và tránh sự tạo rãnh có thể xảy ra khi khí CO2 qua cột cố định nấm men. Giá trị điển hình là 14 bar. Tốc độ dòng chảy cơ chất là một thông số quan trọng bởi vì khả năng sản xuất cồn phụ thuộc vào tốc độ dòng chảy. Nó ảnh hưởng đến lượng tế bào nấm men còn liên kết với chất mang. Tốc độ dòng chảy cao, lượng tế bào nấm men thoát ra tăng; do đó năng suất sản xuất ethanol có thể phụ thuộc vào lượng tế bào liên kết với hệ thống cố định, không chỉ phụ thuộc vào lượng cơ chất vào. Tốc độ dòng chảy quá cao, năng suất sản xuất ethnol không đầy đủ, không tương xứng. Bằng cách điều chỉnh tốc độ chảy, nồng độ ethanol có thể được điều chỉnh. Ở tốc độ dòng chảy thấp, lượng tế bào còn liên kết với vật liệu chất mang tương đối ổn định, là do lượng tế bào tăng trưởng và lượng thoát ra khỏi chất mang cân bằng với nhau. Với tốc độ dòng chảy cao hơn thì sự thoát tế bào tăng nhưng số lượng tế bào lại trở về mức bình thường khi tốc độ dòng chảy giảm trở lại. Nhưng tốc độ dòng chảy phải đủ cao để có thể loại khỏi chất mang những tế bào chết tránh hiện tượng tự phân. Nhốt trong khung mạng xốp. Polyvinyl alcohol Polyvinyl alcohol là chất mang cố định tế bào bằng phương pháp tạo cryogel, đây là một cấu trúc gel polymer mới. Việc nghiên cứu và tạo ra những cấu trúc mới như cryogel góp phần làm kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật đa dạng hơn. Cryogel được hình thành bằng cách sử dụng các phương pháp làm đông lạnh (như cấp đông, bảo quản ở trạng thái băng trong một thời gian xác định và làm tan giá) những tiền polymer có phân tử lượng thấp hoặc cao. Dưới điều kiện nhiệt độ rất thấp, mẫu nguyên liệu sẽ biến đổi và hình thành những cấu trúc mới. Kỹ thuật lạnh đông là một trong những phương pháp hữu dụng nhất được nghiên cứu nhằm khắc phục tính chất kém bền nhiệt và không bền trong dung dịch nước của nhiều loại vật liệu polymer. Trong kỹ thuật lạnh đông, mẫu thí nghiệm được xử lý ở nhiệt độ rất thấp dưới áp suất nhằm tránh sự chuyển pha của nước và sự oxy hoá. Kết quả là mẫu thí nghiệm sẽ cứng lại dưới tác dụng của nhiệt độ thấp và từ đó hình thành một cấu trúc như mong muốn. Những nhà nghiên cứu đã chứng tỏ rằng nhiều loại cấu trúc gel polymer khác nhau sẽ được tạo ra tương ứng với những quá trình thực hiện trong những chế độ khác nhau của quá trình lạnh đông – rã đông. a.Chất mang: Polyvinyl alcohol là một loại polymer thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu bởi nhiều tính chất đặc trưng của nó, thoả mãn những yêu cầu khi đưa vào ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như dược phẩm, sinh hoá, … Phân tử polyvinyl alcohol có cấu trúc hoá học tương đối đơn giản với các nhóm hydroxyl (-OH) nằm đối xứng nhau trong phân tử. Những monomer – vinyl alcohol – không tồn tại ở dạng ổn định mà chúng tự sắp xếp lại thành những tautomer của phân tử (acetaldehyde). Công thức phân tử polyvinyl alcohol: Hình III.5 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl alcohol. Polyvinyl alcohol được sản xuất bằng cách tiến hành polymer hoá các monomer vinyl acetate thành các polymer polyvinyl acetate. Polyvinyl acetate ngay sau đó sẽ tham gia phản ứng thuỷ phân tạo thành sản phẩm chính là các polyvinyl alcohol. [13] Hình III.6 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl acetate. Các bước tổng hợp polyvinyl alcohol từ các monomer vinyl acetate: [14] Polymer hoá các monomer vinyl acetate thành các polymer polyvinyl acetate: Thuỷ phân chuỗi polyvinyl acetate tạo polyvinyl alcohol: Thông thường, polyvinyl alcohol ở dạng rắn, khô. Dưới dạng chế phẩm thương mại, polyvinyl alcohol có dạng hạt nhỏ hay bột mịn màu trắng. Polyvinyl alcohol bền trong các loại dung môi, dầu thực vật và cả mỡ động vật. Chúng có khả năng hình thành một màng mỏng với lực căng bề mặt lớn. Polyvinyl alcohol là loại polymer có khả năng tan trong nước và an toàn. Đây là những tính chất cơ bản khiến nó trở thành một loại chất mang tốt trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật. Polyvinyl alcohol được phân loại chủ yếu dựa trên mức độ thuỷ phân và mức độ trùng hợp hoá. Mức độ trùng hợp hoá sẽ biểu thị cho số lượng monomer tham gia phản ứng tổng hợp. Mức độ thuỷ phân hay mức độ xà phòng hoá sẽ biểu thị cho khả năng chuyển hoá polyvinyl acetate thành polyvinyl alcohol. Hình III.7 Mức độ thuỷ phân của phân tử polyvinyl alcohol: (a) thuỷ phân hoàn toàn, (b) thuỷ phân một phần. Bảng III.2. Một số chế phẩm polyvinyl alcohol thương mại Ký hiệu Công ty sản xuất Khối lượng trung bình Tính chất P – 8136 P – 1763 38,834 – 3 56,390 – 0 Sigma – Mỹ Sigma – Mỹ Merck Merck 30.000 – 70.000 70.000 – 100.000 50.000 – 85.000 124.000 – 186.000 Độ nhớt của dung dịch 4% ở 200C là 4 cPs. Độ nhớt của dung dịch 4% ở 200C là 11 - 13 cPs. Độ thuỷ phân 97%, độ nhớt dung dịch 4% là 6 – 22 cPs. Độ thuỷ phân 99%, độ nhớt dung dịch 60 cPs. Tính chất: Tính chất của các loại polyvinyl alcohol thay đổi phụ thuộc vào khối lượng trung bình của phân tử polyvinyl acetate ban đầu và phụ thuộc vào mức độ thuỷ phân cũng như mức độ trùng hợp hoá của phân tử đó. Những yếu tố này đều có thể kiểm soát trong quá trình tổng hợp. Ngoài ra, những yếu tố môi trường cũng gây những tác động làm thay đổi tính chất của polyvinyl alcohol. Tính tan: Polyvinyl alcohol tan dễ dàng trong nước nhưng khả năng hoà tan của chúng phụ thuộc vào bản chất của phân tử polymer, khối lượng phân tử trung bình, mức độ thuỷ phân, mức độ trùng hợp hoá và nhiệt độ khi hoà tan: Khả năng hoà tan của phân tử polyvinyl alcohol trong nước tăng đáng kể khi khối lượng phân tử trung bình giảm, có nghĩa là mức độ polymer hoá càng thấp. Nhìn chung, các phân tử polyvinyl alcohol được thuỷ phân một phần dễ tan hơn các phân tử được thuỷ phân toàn phần. Nghĩa là, polyvinyl alcohol có mức độ thuỷ phân càng cao thì khả năng hoà tan trong nước của nó càng giảm. Các nhóm acetate kị nước chưa được thuỷ phân sẽ làm yếu liên kết hydro nội phân tử và giữa phân tử với các nhóm hydroxyl gần kề. Tỉ lệ hoà tan của polyvinyl alcohol cũng phụ thuộc vào nhiệt độ hoà tan. Nhiệt độ càng cao, tỉ lệ hoà tan càng lớn. Hình III.8 Khả năng hoà tan phụ thuộc vào mức độ thuỷ phân và nhiệt độ. Độ nhớt: Độ nhớt của một hợp chất polymer trong nước xuất phát từ hai nguồn gốc cơ bản, đó là tính bất cân đối về kích thước và hiện tượng quay nội tại. Độ nhớt của dung dịch polyvinyl alcohol tăng tỉ lệ với mức độ thuỷ phân và mức độ trùng hợp của phân tử. Tính chất này phụ thuộc nhiều vào mức độ trùng hợp hơn là phụ thuộc vào mức độ thuỷ phân. Như mọi chất lỏng khác, độ nhớt của dung dịch polyvinyl alcohol còn phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ dung dịch. Khi nhiệt độ tăng hoặc nồng độ dung dịch giảm thì độ nhớt giảm và ngược lại. Ngoài ra, các tương tác nội phân tử hay tương tác liên phân tử có tác dụng làm giảm độ nhớt của dung dịch polyvinyl alcohol. Các lực gây nên tương tác có thể kể đến là lực Val der Waals, lực Debye, lực London, lực liên kết hydro và lực tương tác ion. Bảng III.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt của dung dịch 10% polyvinyl alcohol có phân tử lượng là 115.000: Nhiệt độ (0C) Độ nhớt (mPa.s) 5 20 40 60 1.900 1.200 450 270 Bảng III.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đến độ nhớt của dung dịch polyvinyl alcohol có phân tử lượng là 115.000: Nồng độ dung dịch (%) Độ nhớt (mPa.s) 7 10 15 200 1.900 15.000 Sức căng bề mặt: Dung dịch polyvinyl alcohol có chức năng giống như một màng keo bảo vệ. Sức căng bề mặt của dung dịch polyvinyl alcohol tăng khi mức độ thuỷ phân tăng. Nó phụ thuộc rất ít vào mức độ trùng hợp hoá. Tính keo: Polyvinyl alcohol có khả năng bám dính cao hơn so với các polymer tự nhiên tan trong nước khác. Khi mức độ trùng hợp và mức độ thuỷ phân tăng, tính bám dính của phân tử polyvinyl alcohol trong nước cũng tăng. Dung dịch polyvinyl alcohol có tính bám dính mạnh đối với các chất ưa nước. Khả năng chịu nhiệt: Polyvinyl alcohol sẽ chuyển sang màu vàng dưới tác dụng của nhiệt độ. Nhiệt độ chảy mềm là 150 – 1900C đối với phân tử thuỷ phân một phần và 210 – 2300C đối với phân tử thuỷ phân toàn phần. Polyvinyl alcohol bị phân huỷ một phần ở 200 – 2500C và phân huỷ nhanh chóng khi trên 2500C. Phản ứng phân huỷ là phản ứng làm đứt các liên kết hoá học trong mạch chính của phân tử polymer, làm thay đổi giá trị khối lượng phân tử trung bình của polymer đưa đến việc thay đổi tính chất vật lý nhưng không làm thay đổi thành phần hoá học của nó. Ứng dụng của polyvinyl alcohol: Từ những tính chất đáng chú ý trên, người ta kết luận rằng polyvinyl alcohol là loại vật liệu đa năng. Nó trở thành vật liệu polymer đang rất được quan tâm nghiên cứu và đưa vào ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là trong ngành dược, hoá sinh học, … Trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật, phân tử polyvinyl alcohol trở thành một lựa chọn hàng đầu với những ưu điểm nổi bật như không độc, không gây ung thư, có khả năng gắn kết sinh học và quy trình sản xuất dễ dàng. Thêm vào đó, phân tử polyvinyl alcohol còn có cấu trúc không quá phức tạp, có thể thay đổi cấu trúc gel tạo thành bằng cách chọn loại polyvinyl alcohol có phân tử lượng trung bình thích hợp. Đây chính là những tính chất giúp polyvinyl alcohol trở thành chất mang khi thực hiện cố định tế bào vi sinh vật. b. Phương pháp thực hiện: Cryogel có thể thu nhận nhờ sự hình thành cả liên kết vật lý lẫn liên kết đồng hoá trị của hệ thống polymer không đồng nhất. Có nhiều phương pháp để hình thành phân tử polyvinyl alcohol – cryogel đi từ dung dịch polyvinyl alcohol với nồng độ ban đầu xác định. Sau đây là một trong những phương pháp đó. Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thích hợp, ta tiến hành ly tâm canh trường để thu nhận huyền phù sinh khối tế bào vi sinh vật. Tế bào thu được tạo huyền phù trong dung dịch PVA 10% (khối lượng phân tử 70000-100000 Da). Huyền phù tế bào và PVA được nhỏ giọt vào một cột (30x90 cm) chứa hexan được làm lạnh ở nhiệt độ -20oC và hạt đông lạnh được tập hợp lại bởi một lưới dây đặt ở dưới cột. Hạt sau đó được chuyển đến máy lạnh -20oC và bảo quản qua đêm. Rã đông được thực hiện chậm bằng cách đặt hạt ở nhiệt độ 4oC trong khoảng thời gian không ít hơn 6 giờ. Khi quá trình rã đông hoàn tất, phần dung dịch keo (tinh thể đá chảy và PVA mà không tham gia hình thành mạng gel) và hexane bị loại ra bởi sự nhúng hạt vào nước vô trùng hoặc là đệm acetate 0,1M, pH 5 trong 1 giờ ở 4oC. Hạt PVA cryogel sau đó được đặt vào môi trường tăng trưởng nấm men để hoạt hóa nấm men. Nấm men Tạo huyền phù Dung dịch PVA 10% Tạo hạt Đông lạnh Rã đông Rửa Tế bào cố định Dung dịch monomer hay tiền polymer của gel dưới chế độ cấp đông ôn hoà sẽ tạo thành mẫu đặc cứng. Tuy nhiên, khi nhìn ở góc độ vi mô, cấu trúc mẫu thí nghiệm không hoàn toàn đặc cứng. Trong cấu trúc mẫu đặc cứng mới hình thành còn có những khu vực chưa đông hay còn gọi là tiểu pha lỏng chưa đông. Sau quá trình rã đông, gel với những lỗ xốp lớn đặc trưng hay còn gọi là cryogel được hình thành. Các lỗ xốp này chứa đầy chất lỏng đã tan ra. Vì thế, tính chất đa tinh thể của dung môi đóng băng đóng vai trò là tác nhân hình thành lỗ xốp. Trong suốt quá trình kết tinh, những tinh thể cứ lớn dần cho đến khi tiếp xúc với một mặt của tinh thể khác, hệ thống các lỗ xốp lớn trong cryogel được nối liền với nhau. Đó chỉ là vài đặc điểm về hình thái của vài loại cryogel khác nhau khiến chúng trở thành những công cụ đắc lực để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Những chất xúc tác sinh học như enzyme hoặc tế bào vi sinh vật có thể được cố định trong gel với nhiều hình dạng khác nhau. Tính linh hoạt này không thường thấy ở nhiều loại vật liệu polymer đông khô khác. Dạng hình khối và dạng viên mặc dù dễ sản xuất nhưng cũng dễ bị mài mòn. Dạng bản mỏng cũng dễ sản xuất nhưng chỉ được dùng trong những loại thiết bị đặc biệt. Nhiều thiết bị có thể sử dụng dạng sợi đặc hoặc sợi rỗng. Tuy nhiên, hình thức thường gặp nhất ở các chất xúc tác sinh học cố định là dạng hạt cầu. Dạng hạt cầu có thể được sử dụng trong hầu hết các loại thiết bị phản ứng mà không bị mài mòn, lại dễ tính toán lượng trao đổi sinh khối, vấn đề hay gây tranh cãi khi đưa vào sản xuất trên quy mô công nghiệp. Để thu được tế bào cố định ở dạng hạt, người ta phải tiến hành tạo hạt ở nhiệt độ thấp một cách tỉ mỉ. Phương pháp này cho phép việc tạo ra những hạt cryogel có kích thước khác nhau. c. Các yếu tố ảnh hưởng: Những nghiên cứu về tính chất hoá lý và cấu trúc của polyvinyl alcohol – cryogel chứng tỏ rằng, tính chất xốp của phân tử chủ yếu phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch polymer ban đầu. Ngoài ra, tính chất của cryogel còn có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ lạnh đông, thời gian giữ trong trạng thái lạnh đông, tỉ lệ lạnh đông – rã đông, các dung môi tự nhiên và các chất phụ gia hoà tan hoặc không hoà tan. Gần đây, người ta còn chứng minh được rằng việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt có thể ảnh hưởng đến tính chất xốp của phân tử polyvinyl alcohol – cryogel. Ví dụ, thêm khoảng 6 mM sodium dodecyl sulfate sẽ làm tăng tiết diện ngang của lỗ xốp khoảng 1 – 5micromet hoặc nhiều hơn. Do đó, ta cần chú ý khi sử dụng các chất phụ gia khác nhau trong quá trình hình thành phân tử polyvinyl alcohol – cryogel, vì những chất phụ gia này có thể làm thay đổi hình thái của các lỗ xốp trong cấu trúc chất mang có lỗ xốp lớn như polyvinyl alcohol – cryogel.