Đồ án Tổng quan về collagen và ứng dụng của collagen

ng pyrrolidine, nó có thể bị oxy hóa để hình thành vòng pyrrole. Vòng pyrrole này tác dụng với tác chất Ehrlich, 4–(N,N– dimethylamino) benzaldehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vào nhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà). Thực hiện phương pháp so màu để tính hàm lượng hydroxyproline. Đo phổ hồng ngoại infrared (IR) spectroscopy. Phổ hồng ngoại IR là một trong những kỹ thuật phổ được sử dụng rộng rãi nhất, là phương pháp đo độ hấp thụ của mẫu thử ở các bước sóng khác nhau của tia hồng ngoại. Mục đích chính của việc phân tích phổ IR là xác định các nhóm chức hóa học có trong mẫu thử. Những nhóm chức khác nhau sẽ hấp thụ những bước sóng riêng biệt. Với nhiều thiết bị phụ tùng, máy phổ hồng ngoại có thể làm việc với nhiều dạng mẫu từ khí, lỏng đến rắn. Phân tích phổ IR là một công cụ phổ biến và quan trọng để làm sáng tỏ cấu trúc và xác định các hợp chất. Hình 1.12 Phổ hồng ngoại collagen trong dung dịch axit Collagen trên phổ hồng ngoại có thể thấy trên hình. Nhóm amide A phát hiện ở peak có cường độ 3330 cm-1, nhóm amide B được thấy ở peak có cường độ 3080 cm-1. Trên quang phổ còn thấy xuất hiện sự dao động của amide bậc I ở 1650 cm-1, amide bậc II ở 1545 cm-1 và amit bậc III ở 1237 cm-1. Cấu trúc của protein và amide bậc III chứng minh sự tồn tại của kết cấu có hình xoắn ốc (Surewicz và Mantsch, 1988, Muyonga, 2004). CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT COLLAGEN Trong các công trình nghiên cứu, qui trình thu nhận collagen gồm 3 giai đoạn chính : Giai đoạn phá vỡ tế bào: - Các phân tử collagen không có khả năng đi qua màng tế bào, vì vậy cần phá vỡ cấu trúc tế bào để chuyển collagen vào dung dịch. Các biện pháp được sử dụng có thể là các biện pháp cơ học như tiến hành ngiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, sau đó tiến hành đồng hóa (homogenizator). Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với motor quay và có thể điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào nằm giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bị phá vỡ. - Sử dụng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone kết hợp với các chất tẩy rửa. Các hóa chất này giúp cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào. Giai đoạn tách chiết collagen: - Sau khi phá vỡ cấu trúc tế bào, việc tách chiết collagen được tiến hành dễ dàng hơn, collagen có thể được chiết tách bằng acid hoặc bằng enzyme, quá trình tách chiết collagen được thực hiện trong các reactor ở nhiệt độ lạnh và trong điều kiện vô trùng, kết hợp khuấy trộn liên tục để đảm bảo collagen thu được có chất lượng tốt. Giai đoạn tinh sạch collagen: - Trong dịch chiết thô, ngoài collagen còn có các protein tạp, các lipid, muối khoáng, để loại các thành phần này cần sử dụng các biện pháp khác nhau. - Để loại muối khoáng thường dùng phương pháp thẩm tích. Thẩm tích là sự khuyếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan ( protein, một số polysaccaride...) nhưng thấm đối với các dung dịch tinh thể ( các muối của hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp,...). Để loại các protein tạp có thể tiến hành kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ hay dùng các phương pháp sắc ký trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel,… 2.1 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI Collagen thành phẩm Na2SO4 Da heo Ngâm Cạo lông Rửa Loại béo Nước Ly tâm Trích ly Kết tủa Kết tủa lại HCl 5M Bã Ly tâm CH3COOH 0,1M Bã 2.1.1 Qui trình chiết tách collagen từ da heo [6] Thuyết minh qui trình công nghệ : Da heo sau khi thu nhận sẽ qua quá trình xử lý ngâm với dung dịch Na2SO4, sau đó tiến hành cạo lông rồi cho qua quá trình rửa với nước theo tỉ lệ H20 : da = 6 : 1(w/w). Tiến hành rửa lần 1 trong vòng 30 phút, sau đó rửa tiếp lần 2 và 3, mỗi lần được thực hiện trong vòng 20 phút, nhiệt độ 300C. Quá trình rửa giúp loại bớt các tạp chất như phần thịt dư, máu, mỡ thừa, nhầy nhớt,… để chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo. Sau khi tiến hành rửa với nước, da heo sẽ được loại béo bằng dung dịch isopropyl kết hợp với bổ sung chất hoạt động bề mặt không ion. Tiến hành bổ sung chất hoạt động bề mặt 2 lần vào dung dịch chứa da heo và ngâm trong vòng 6h, trường hợp loại béo bằng dung dịch isopropyl ta tiến hành trong vòng 10h. Da heo sau khi được loại chất béo sẽ được trích ly bằng dung dịch NaOH 3% (w/v) và monomethylamine 1,9%(v/v) để tách chiết collagen, quá trình được tiến hành ở nhiệt độ 200C trong vòng 1 tuần để đảm bảo collagen có chất lượng tốt. Để kết tủa collagen vừa được trích ly ta dùng dung dịch acid HCl 5M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa, pH lúc này bằng 4,6 – 4,7. Để thu được collagen sạch ta tiến hành ly tâm lấy phần tủa hòa tan lại trong dung dịch dịch acid acetic 0.1M, quá trình được thực hiện ở 40C trong vòng 72h, tiến hành ly tâm lần nữa ta thu được collagen thành phẩm. Những kết quả phân tích collagen trên da heo : Kết quả cho thấy collagen được thu nhận từ da heo có cấu trúc chủ yếu gồm hai chuỗi α1 và α2. Ứng với mỗi chuỗi có 8 peptide khác nhau và những peptide này được phân tích giữa sự kết hợp trao đổi ion và sắc ký lọc gel để xác định thành phần các acid amin có trong mỗi chuỗi. Kết quả cũng cho thấy chuỗi collagen được đặc trưng bởi vị trí và trọng lượng phân tử của các acid amin. Bằng các phương pháp xác định cho thấy collagen từ da heo có nhiệt độ biến tính ở 370C, nhiệt độ biến tính của collagen có liên quan đến các thành phần acid amin, đặc biệt là các thành phần proline, hydroxyproline, glycine. Nhiệt độ biến tính này còn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ môi trường sống động vật. 2.1.2 Qui trinh chiết tách collagen từ gân chân gà [7] Collagen thành phẩm Gân gà Cắt nhỏ Loại protein hòa tan và carbonhydrat Trích ly Lọc DD đệm citrate 0,15M CH3COONa 0,5M Thẩm tích Rửa Kết tinh Na2HPO4 0,02M Nước muối Bã Thuyết minh qui trình công nghệ : Nguyên liệu là gân chân gà sau khi được cắt nhỏ được ngâm với dung dịch CH3COONa để loại đi các protein hòa tan và các carbonhydrat trong thời gian 3 ngày. Dung dịch thu được ta tiến hành trích ly để thu được collagen bằng cách bổ sung dung dịch đệm citrat 0,15M. Dung dịch sau khi trích ly được đem đi lọc để loại đi các tạp chất rắn khác, sau đó tiến hành thẩm tích dung dịch vừa thu được để loại đi các muối ra khỏi hỗn hợp để tinh sạch collagen. Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan ( protein, một số polysaccaride...) nhưng thấm đối với các dung dịch tinh thể ( các muối của hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp,...). Các tinh thể có thể khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo. Trong khi đó, các ion và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển từ dung dịch keo vào dung dịch có nồng độ thấp hơn. Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịch protein thì dung dịch protein được cho vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm, thường là dùng các túi cellophan. Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn, H20 hay lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng. Ở đây tác giả dùng dung dịch Na2HPO4 0,02M. Vì màng cellophan là màng bán thấm có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua các dung dịch đệm loãng. Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào dung dịch đệm loãng ( di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn dung dịch đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi. Sau khi thẩm tích , tiến hành rửa lại và sau đó kết tinh sẽ thu được collagen thành phẩm. 2.1.3 Qui trình chiết tách Collagen từ da mực [7] Bột Collagen Da mực Rửa sạch Làm khô Loại noncollagenous protein và màu NaOH 0,1M Ly tâm Rửa Trích ly Kết tủa CH3COOH 0,5M Bã Ly tâm NaCl 0,8M Sấy lạnh Thuyết minh qui trình công nghệ : Da mực sau khi được rửa sạch được làm khô rồi cho dung dịch NaOH 0,1M vào để tiến hành loại những hợp chất noncollagenous protein và màu. Sau đó tiến hành rửa và trích ly bằng dung dịch acid acetic trong vòng 3 ngày . Hỗn hợp sau khi trích ly sẽ được tiến hành ly tâm với tốc độ 50000 vòng / phút trong vòng 1h để thu lấy phần dịch, phần dịch chiết thu được là dịch lỏng, hơi sánh gọi là acid-soluble collagen. Để kết tinh collagen, cho NaCl sẵn vào dịch chiết đến nồng độ 0.8M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa. Để thu được collagen sạch, ta tiến hành ly tâm với tốc độ 50000 vòng / phút trong vòng 1h rồi tiến hành sấy lạnh thu được sản phẩm collagen dạng bột. Quy trình trích ly collagen từ da cá tuyết (Baltic cod) [9] Thuyết minh qui trình công nghệ Nguyên liệu là da cá được cắt nhỏ tới đường kính khoảng 3mm bằng máy nghiền, sau đó tiến hành khuấy trộn với dung dịch acid acetic nồng độ 0,1÷ 0,5M với tỉ lệ 1:6 ÷ 1:40 ở nhiệt độ lạnh trong vòng 2h. Tiến hành đồng nhất hóa dung dịch vừa khuấy trộn ở nhiệt độ trong thời gian 4 phút, tốc độ đồng nhất là 6000 vòng / phút. Sau đó dung dịch được tiếp tục khuấy trộn trong thời gian 24h ở nhiệt độ rồi được đưa qua máy đồng nhất hóa với thông số kĩ thuật giống như giai đoạn đầu. Sau khi hỗn hợp đã được đồng nhất với nhau ta tiến hành ly tâm thu lấy phần dịch có chứa collagen, quá trình ly tâm được tiến hành ở nhiệt độ lạnh trong thời gian 20 phút, tốc độ ly tâm đạt 6000 vòng / phút. Các quá trình được tiến hành ở nhiệt độ lạnh và trong điều kiện vô trùng để tránh da cá bị biến tính ảnh hưởng đến chất lượng collagen. Những kết quả phân tích collagen trên da cá tuyết Tác giả đã tính hàm lượng collagen thông qua việc phân tích hàm lượng hydroxyproline và nhân với hệ số chuyển đổi từ hydroxyproline qua collagen là 14,7. Hàm lượng collagen trong da cá tuyết là 21,5% (tính theo trọng lượng ướt), và 71,2% (tính theo trọng lượng khô). Đối với phương pháp chiết bằng acetic cho thấy hiệu suất chiết phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ acid và tỉ lệ nguyên liệu/dung dịch. Cho nên khi khảo sát quá trình chiết, cần tiến hành ở các nồng độ và tỉ lệ khác nhau để tìm mối liên hệ của chúng ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết. Đối với phương pháp chiết bằng acid citric, vẫn chiết được collagen nhưng hiệu suất tách chiết không cao hơn acetic. Tuy nhiên tác giả chỉ dừng lại ở việc khảo sát các quá trình tách chiết mà chưa phân tích được những thông số của collagen như các chuỗi cấu trúc của collagen, trọng lượng phân tử, vị trí và thành phần acid amin, nhiệt độ biến tính của collagen,… 2.1.5 Qui trình tách chiết Collagen từ phụ phẩm da, xương, vây của các loài cá ngừ ngừ ( Katsuwonus Pelamis), cá Pecca Nhật Bản ( Lacteolabrax japonias), cá Thu (Samber japonus), cá Tráp Vàng( Dentex tumifrons), cá Mập ( Heterodonus japonius). Collagen sạch NaOH Da cá Loại tạp chất Loại tạp chất Chiết Ly tâm Butyl alcohol Acid acetic 0.5M Ly tâm Kết tủa Thẩm tích Sấy thăng hoa NaCl Màng Cellophan Nước bẩn Bã Nước Thuyết minh qui trình công nghệ : Da, xương, và vây được bảo quản ở 25oC đến khi sử dụng. Tất cả quá trình tiền xử lý đến tách chiết đều tiến hành ở 4oC. - Mục đích: quá trình loại tạp chất nhằm mục đích loại đi các chất non- collagen ( chất béo, chất màu, chất gây mùi tanh,...) để chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo. - Các biến đổi của nguyên liệu: da cá có quá trình hút nước, trương nở, lúc này trọng lượng của da cá tăng lên. - Thiết bị và thông số công nghệ : lần loại tạp chất đầu tiên, ta tiến hành xử lý bằng dung dịch NaOH 1%, sau đó da cá được cho xử lý tiếp với dung dịch Butyl alcohol 10% để loại tiếp tạp chất. Sau quá trình loại tạp chất, collagen được tách chiết bằng dung dịch acid acetic 0.5M trong 3 ngày. Quá trình chiết collagen được thực hiện trong các bình reactor ở nhiệt độ lạnh, trong điều kiện vô trùng, khuấy trộn liên tục để đảm bảo chiết được collagen có chất lượng tốt. Sau quá trình chiết collagen ta tiến hành ly tâm thu lấy phần dịch, cả hai phần dịch chiết thu được là dung dịch lỏng, hơi sánh gọi là acid-soluble collagen. Phần bã thu được cũng được chiết lần hai với dung dịch aid acetic 0.5M trong vòng 2-3 ngày. Để kết tinh collagen, cho NaCl sẵn vào dịch chiết đến nồng độ 0.9M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa. Để thu được collagen sạch, ta tiến hành ly tâm, lấy phần tủa hòa tan vào dung dịch acid acetic 0.5M. Tiến hành thẩm tích thu được collagen sạch. Collagen sạch được làm lạnh và bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịch protein thi dung dịch protein được cho vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm, thường là dùng các túi cellophan. Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn, H20 hay lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng ( có thể dùng đệm phosphat có pH = 7, nồng độ 0.01M). Vì màng cellophan là màng bán thấm có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua các dung dịch đệm loãng. Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào nước hoặc dung dịch đệm loãng ( di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hay dung dịch đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi. Sau khi tiến hành thẩm tích ta thực hiện ly tâm collagen vừa thu được, sau đó tiến hành sấy thăng hoa để thu được sản phẩm : - Các biến đổi nguyên liệu: tách nước khỏi vật liệu bằng cách biến nước trong vật liệu thành đá, sau đó biến nước đá thành hơi nước mà không qua trạng thái lỏng. - Thiết bị: Hệ thống sấy thăng hoa tuần hoàn * Hạ nhiệt độ sản phẩm sấy xuống dưới điểm đông lạnh (-10oC÷-20oC) và được đặt trong bình chân không có áp suất gần với áp suất chân không tuyệt đối, khi đó nước thoát ra khỏi sản phẩm sấy ở trạng thái rắn, tức là thăng hoa ẩm. * Mô hình hệ thống thiết bị sấy thăng hoa gồm 5 bộ phận: bình thăng hoa, bình ngưng của máy lạnh, máy nén của máy lạnh, bình ngưng-đóng băng, bơm chân không. Quá trình sấy thăng hoa gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đông lạnh, giai đoạn thăng hoa và giai đoạn sấy ẩm dư. Sấy thăng hoa có ưu điểm giảm thời gian sấy xuống 3 lần, không ảnh hưởng lớn đến giá trị dinh dưỡng và mùi vị sản phẩm, tuy nhiên chi phí năng lượng riêng cao hơn các phương pháp khác khoảng 50-60%. Hình 2.1 sơ đồ làm việc thiết bị sấy thăng hoa Những kết quả phân tích collagen trích chiết từ da cá Về hiệu suất tách chiết: đạt được hiệu suất tương đối cao 51,4% (cá pecca Nhật Bản), 49,8% (cá thu), 50,1% (cá mập) tính trên trọng lượng khô. Về phân tích cấu trúc chuỗi collagen : Hình 2.2 Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá. (Điện di trên 3,5% gel chứa urea 3,5M: (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu Bằng phương pháp điện di như đã nói trên, hình 2.2 cho thấy collagen da của cá pecca và cá mập gồm 2 chuỗi α khác nhau, đó là α1 và α2. Trong đó, α2 có hàm lượng rất nhỏ. Nếu có α3 tồn tại thì cũng không thể tách khỏi α1 trong điều kiện điện di này. Còn đối với cá thu, collagen dạng α chỉ gồm chuỗi α1 mà hoàn toàn không có α2. Trong hình 2.2 ta cũng thấy có sự tồn tại của chuỗi ở cả 3 loài cá. Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng phương pháp điện di SPS-PAGE theo phương pháp của Weber và Osborn ( 1969) để xác định chuỗi collagen. Trong đó chuỗi collagen được hòa tan vào Sodium photphat 0.02M ( pH = 7.2) chứa 1% Sodium dodecyl sunphat ( SDS) và 3.5 ure. Tiến hành điện di trên 3.5% gel với đệm photphate 0.1M (pH = 7.2) chứa 1% SDS. Tác giả đã đo nhiệt độ biến tính của hỗn hợp collagen 0.03% hòa tan vào acid acetic 0.1M tại một số nhiệt độ. - Nhiệt độ biến tính collagen của da cá rất thấp : 26.5oC ( cá Pecca), 25.6oC(cá thu), 25oC (cá mập), thấp hơn khoảng 10 oC so với collagen của da cá heo ( 37oC). Nhìn chung, tác giả đã đưa ra phương pháp tách chiết đơn giản, dễ thực hiện, chỉ là tách chiết dựa trên các hoá chất thông dụng, không quá đắt tiền, các thiết bị cũng thông dụng trong phòng thí nghiệm. Tác giả cũng khảo sát được cấu trúc chuỗi collagen gồm α1, α2, và α3. Khảo sát được nhiệt độ biến tính của collagen da cá và so sánh với collagen da heo. Tuy nhiên cũng có một số nhược điểm là khi sử dụng butyl alcohol trong quá trình rửa da cá loại tạp chất, phải qua công đoạn chưng cất thu hồi dung môi. Butyl alcohol không được khuyến cáo sử dụng trong thực phẩm. Tác giả khảo sát cấu trúc collagen nhưng chưa xác định được trọng lượng phân tử của chúng, chưa xác định thành phần acid amin trong collagen. 2.1.6 Năm 2005, Kittiphattanabawon, Benjakul, Visessanguan, Nagai, Tanaka, trên cơ sở sử dụng các phương pháp tách chiết collagen theo qui trình trên có kết hợp một số thay đổi và phát triển thêm việc tách chiết collagen trên da và xương của loài cá chỉ vàng (Priacanthus tayenus). Tác giả đã có những nghiên cứu khá hoàn thiện và đầy đủ các phân tích về collagen: - Đã phân tích các chỉ tiêu về hàm lượng ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng các chất béo, protein và hàm lượng hydroxyproline. Trong đó hàm lượng chất béo trong da cá nguyên liệu là 0,98%, còn trong collagen thành phẩm là 0,33% (theo trọng lượng ướt), cho thấy việc xử lí da cá chưa loại sạch triệt để các chất béo. - Đã phân tích thành phần acid amin trong collagen và xác định trong đó glycine là acid amin chính chiếm 30%. - Về sắc kí điện di xác định chuỗi collagen : tác giả cũng có nhận định giống như các bài báo khác, collagen chứa chuỗi α gồm chủ yếu là α1 và α2 ; còn α3 khó tách ra trong điều kiện điện di. Ngoài ra, trong collagen còn có các chuỗi và . Ở đây chúng ta cần lưu ý rằng việc xác định sự tồn tại của các chuỗi α , , là quan trọng, nó cho chúng ta biết được một thông tin là chuỗi dạng α là những monomer có trọng lượng phân tử 100kDa, chuỗi dạng lại là những polymer có trọng lượng phân tử từ 100-200 kDa, chuỗi dạng cũng là những polymer nhưng lại có trọng lượng phân tử 200 kDa. - Trọng lượng phân tử collagen nằm trong khoảng 186,5-69,5 kDa. - Việc xác định độ nhớt của dung dịch collagen: tác giả cho rằng khi nhiệt độ càng cao càng làm cho mối liên kết hydro bị phá vỡ, nhờ mối liên kết hydro này cấu trúc collagen mới bền. Trên 40oC, collagen bị biến đổi thành một hổn hợp các dây đơn, đôi, và ba cuộn lại một cách vô trật tự (random-coil single, double, triple strand). Sự phá vỡ cấu trúc collagen gây ra bởi sự thay đổi nhiệt độ và có liên hệ với sự thay đổi độ nhớt của dung dịch collagen. - Tác giả còn phân tích thêm ảnh hưởng của pH lên độ nhớt của dung dịch collagen. Dung dịch collagen có độ nhớt cao trong khoảng pH từ 2-5. Điều này giúp cho chúng ta nghiên cứu tách chiết collagen trong dung dịch có pH thích hợp, trong đó pH = 2 cho độ nhớt cao nhất. - Còn đối với ảnh hưởng của NaCl lên dung dịch collagen. Ở nồng độ khoảng 3% NaCl trong dung dịch acetic 0,5M của collagen, độ nhớt không thay đổi. Nhưng khi tăng nồng độ NaCl lên, độ nhớt giảm xuống. Điều này được giải thích là khi nồng độ NaCl tăng, độ hòa tan của protein giảm do làm lộ các nhóm kị nước nằm bên trong phân tử protein. 2.1.7 Qui trình tách chiết Collagen trên da của loài cá nóc bằng acid acetic và enzyme pepsin. Collagen sạch NaOH Da cá Loại tạp chất Loại tạp chất Chiết Ly tâm Butyl alcohol Acid acetic 0.5M Ly tâm Kết tủa Thẩm tích Sấy thăng hoa NaCl Màng Cellophan Nước bẩn Nước bẩn Bã Nước Chiết lần 2 Thuyết minh qui trình công nghệ : Quá trình tiền xử lý tạp chất vẫn sử dụng dung dịch NaOH 1% và butyl alcohol 10% . Bên cạnh việc tách chiết bằng acid acetic, qui trình còn sử dụng enzyme pepsine. Da cá sau khi rửa sạch tạp chất sẽ được chiết với dung dịch acid acetic 0,5M trong vòng 3 ngày. Ly tâm lấy phần dịch cho kết tủa với NaCl bổ sung đệm tris – HCl (pH = 7,5) thu được collgen thô. Còn phần bã được chiết tiếp bằng hỗn hợp acid acetic 0,5M và enzyme pepsin 10%(w/v) trong 2 ngày , ở 40C . Điểm đẳng điện của enzyme pepsin trong khoảng pH = 1, pepsin thủy phân mạnh các liên kết peptide nối mạch do các nhóm amin của các acid amin thơm trong trong phân tử protein tạo thành. Sản phẩm được tách ra là các peptide và các acid amin tự do. Trong môi trường acid, pepsin hoạt động thích hợp nhất trong khoảng pH = 1.5 – 2 , pepsin có độ bền tối đa ở pH = 4-5, ở vùng pH này, hoạt lực của pepsin thấp, từ pH = 5,6 thì hầu như không có hoạt tính protease. Dung dịch pepsin trong H20 ở dạng pepsinogen và được hoạt hóa bởi H+ với pH = 1.5 – 2, chúng tiến hành phân giải gần 30% mạch peptide và thủy phân protein thành polypeptide. Tiến hành ly tâm lấy phần dịch này với dung dịch Na2HPO4 0,02M (pH= 7.2) trong 3 ngày. Sau đó, dịch thẩm tách được ly tâm, lấy phần kết tủa hòa tan vào acid acetic 0,5M . Kết tủa collagen bằng NaCl bổ sung đệm tris – HCl (pH = 7,5). Ly tâm lấy phần tủa hòa tan vào dung dịch acid acetic 0,5M để loại bỏ các tạp chất không tan trong acid. Tiến hành thẩm tích loại bỏ acid acetic, làm khô lạnh thu được sản phẩm collagen. Kết quả phân tích collagen Đối với phương pháp sử dụng enzyme để chiết collagen, ta nhận thấy collagen không tan hoàn toàn trong acid nhưng tan hoàn toàn trong enzyme pepsin. Hiệu suất chiết bằng enzyme đạt 44,7% trong khi đó chiết bằng acid acetic chỉ đạt 10,7%. Việc bổ sung enzyme giúp cho sự phá vỡ các màng tế bào nhanh và mạnh hơn. Vì thế collagen dễ dàng được tách ra và cho hiệu suất cao. Kết quả cũng cho thấy rằng nhiệt độ biến tính của collagen ở da cá nóc là 280C thấp hơn collagen ở da heo. Thành phần acid amin trong collagen ở loài cá nóc gồm 19 loại, trong đó hàm lượng glycine chiếm 30% cho thấy được glycine là thành phần amino acid chủ yếu trong collagen. Bảng 2.1 Thành phần a.a của dung dịch collagen da cá nóc chiết bằng enzyme pepsine. Thành phần acid amin Số gốc / 1000 gốc Hydroxyproline 67 Acid aspartic 50 Threonine 25 Serin 48 Glutamic acid 87 Proline 103 Glycine 351 Alanine 106 Cystein 2 Valine 17 Methionine 14 Isoleucine 12 Leucine 23 Tyrosine 4 Phennylalnine 10 Trytophan 0 Lysine 19 Histidine 8 Arginine 54 Tổng 1000 2.1.8 Năm 2009, Zhang Liu Li đã có các nghiên cứu trên loài cá da trơn (Largefin longbabel) Trong nghiên cứu này, quá trình tẩy rửa được tiến hành ở 40C, trong điều kiện khuấy trộn. Da được ngâm với dung dịch NaOH 0,1M với tỉ lệ 1/20 (w/v) trong vòng 24h. Tiến hành thay dung dịch một lần sau 24h để loại bớt tạp chất non-collagen, chất béo, chất màu và mùi tanh