Đồ án Tổng quan về peptit có hoạt tính sinh học

g phản ứng (làm giảm hàm lượng nước trong môi trường bằng cách sử dụng dung môi hữu cơ), enzyme, cơ chất…. Khác với phương pháp tổng hợp hóa học, phương pháp tổng hợp sử dụng enzyme có thể bắt đầu từ đầu amino hoặc đầu carboxy bởi vì xúc tác enzyme tránh được hiện tượng racemic hóa. Ngoài ra, phương pháp này còn có một số ưu điểm như: không tốn nhiều thời gian; không có quá trình bảo vệ và khử các nhóm bảo vệ; giảm việc sử dụng các dung môi và các chất hóa học (gây độc); có thể tái sử dụng enzyme. Hiện nay, lượng peptide tạo sản xuất ra nhờ phương pháp này vẫn còn rất ít; hầu hết các peptide được sản xuất nhờ phương pháp tổng hợp hóa học. Một vài di- và tripeptide có thể được tổng hợp với quy mô lớn bằng phương pháp tổng hợp dùng enzyme, thậm chí là quá trình tổng hợp có thể được tiến hành liên tục. Các di- và tripeptide này được sử dụng làm chất trung gian trong quá trình sản xuất các loại dược phẩm. Ưùng dụng trong công nghiệp của phương pháp ECS là việc tổng hợp Z-Asp-Phe-Ome là tiền chất của aspartame. Phương pháp tái tổ hợp gen Khái niệm về DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài hoặc của các loài khác nhau. Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau: Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho (ví dụ: tế bào của người) để cung cấp DNA. Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn gọi là phân lập gen. Bước 3: Cắt cả hai loại DNA ( DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng cùng một loại enzym giới hạn (restriction enzym – RE). Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị cắt bởi một loại enzym giới hạn như đã nêu trên. Bước 5: Bổ xung enzym nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh. Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuẩn E.coli) và nhân dòng. Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp và theo dõi hoạt động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy rừ tế bào cho. Sơ đồ khái quát của quá trình tạo dòng DNA tái tổ hợp Hình 3.6: Sơ đồ quá trình tạo dòng DNA tái tổ hợp Các enzym chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp Các enzym giới hạn. Trong Công nghệ di truyền, muốn tạo ra DNA tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn DNA của tế bào rồi cho chúng nối lại với nhau. Công cụ cắt DNA là các enzym giới hạn. Khái niệm về enzym giới hạn Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phagơ (thể thực khuẩn) thì vi khuẩn đó bị phagơ phá hủy. Một số loại vi khuẩn sau khi nhiễm phagơ lại không bị phá hủy do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzym có khả năng cắt DNA phagơ thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu tiên tách được loại enzym này từ vi khuẩn Haemophilus influenzae được gọi tên là HinII. Ngay sau đó, các nhà khoa học đã thấy rằng, phần lớn các loài vi khuẩn mang loại enzym có khả năng cắt DNA lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của các DNA lạ. Những enzym đó được gọi là enzym giới hạn. Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt DNA ở ngay điểm này hay điểm kế cận. Tùy theo phương thức cắt và nguồn gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzym giới hạn đó. Phân loại enzym giới hạn. Các enzym giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III. Các enzym giới hạn thường dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp, Công nghệ di truyền là enzym giới hạn thuộc kiểu II. Các enzym này cắt bên trong mạch DNA (không phân hủy từ 2 đầu của DNA) nên còn được gọi là enzym endonuclease. Enzym giới hạn kiểu II thực chất là endonuclease giới hạn kiểu II. Các endonuclease giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II cũng như các enzym giới hạn khác dựa trên qui ước chung. Tên enzym giới hạn được ghép bởi chữ cái đầu tiên là tên chi và 2 chữ cái tiếp theo là tên loài của vi sinh vật mà enzym được tách chiết, những chữ và số La mã tiếp theo là tên của chủng và dòng của loài vi sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym . Ví dụ: Tên enzym Chi Loài Chủng Thứ tự dòng Escherichia coli Ry13 E.coRI E. co R I E.coRV E. co R Vi sinh vật Bacillus amyloliquefaciens H BamHI B am H I Haemophilus aegyptius HaeIII H ae III Serratia martesens SmaI S ma I Giá trị của enzym giới hạn là ở tính chất cắt đặc hiệu của chúng. Mỗi enzym cụ thể có thể nhận biết một đoạn trình tự đặc thù các cặp bazơ trên DNA. Đoạn nhận biết phổ biến nhất có chiều dài 4, 5 hoặc 6 nucleotit tương ứng với khoảng 44 = 256 cặp bazơ, 45 = 1024 cặp bazơ hoặc 46 = 4096 cặp bazơ có khả năng lặp lại một lần trong cấu trúc chung của DNA. Như vậy enzym giới hạn nhận biết đoạn trình tự 4 nucleotit sẽ cắt phân tử DNA ngắn hơn các enzym giới hạn nhận biết đoạn trình tự 5 hoặc 6 nucleotit Có 2 kiểu cắt của enzym giới hạn là: kiểu cắt tạo đầu bằng (blunt ends) và đầu so le (đầu dính – cohesive ends). Enzym giới hạn cắt đầu bằng không tự nối các đoạn DNA lại với nhau. Để nối các đoạn DNA sau khi cắt, cần sử dụng enzym nối ligase và các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzym. Enzym giới hạn cắt đầu so le tạo đầu dính. Sau khi cắt chúng có thể tự nối lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung. Chính ví vậy trong công nghệ DNA tái tổ hợp người ta thường dùng các enzym giơi hạn cắt đầu so le. Một số enzym giới hạn thường được sử dụng cùng với đoạn trình tự nhận biết và vị trí cắt của chúng . Bảng3.4: Một số enzym giơi hạn thường dùng Enzym Vi khuẩn có enzym Đoạn nhận biết và cắt trên DNA BamHI Bacilus amyloliquefaciens GGATCC CCTAG G EcoRI E.coli RY13 GAATTC CTTAA G HhaI Haemophilus haemolyticus G CGC C GCG HindIII Haemophilus influenzae A AGCTT TTCGA A PstI Providencia stuartii CTGCA G G ACGTC HaeIII Haemophilus aegyptipus GG CC CC GG SmaI Serratia martesens CCC GGG GGG CCC  Các enzym giới hạn cắt đầu so le cắt theo 2 kiểu hình dạng. Các đoạn có thể sinh ra đó là các đoạn có đầu 3’ nhô ra và các đoạn có đầu 5’ nhô ra HaeIII PstI EcoRI 5’ – GG CC – 3’ CC GG 5’ – C TGCA G – 3’ G ACGT C 5’ – G AATT C – 3’ C TTAA G Đầu bằng Đầu so le 3’ Đầu so le 5’ Hình 3.7 : Các dạng đầu mút tạo bởi các loại enzym giới hạn Hai loại enzym tạo đầu so le 3’ và đầu so le 5’ thường được dùng trong Công nghệ di truyền do khả năng tự nối lại với nhau, hoặc với các đoạn DNA khác có đầu tương tự. Khi sử dụng từng loại enzym giới hạn cần có các điều kiện nhiệt độ, độ pH, dung môi thích hợp. Nguyên tắt chung cắt DNA bằng một enzym giới hạn nào đó là ủ DNA sợi kép với một lượng enzym giới hạn thích hợp trong một chế độ dung dịch đệmtheo hướng dẫn của nhà sản xuất và ở một nhiệt độ tối ưu cho chính loại enzym này. Trong điều kiện thích hợp, phản ứng cắt hoàn toàn 1 microgam DNA sợi kép kéo dài 1-3 giờ và thường ở 370C. một số loại enzym có hoạt tính yếu, do vậy khi cắt có thể kéo dài thêm thời gian, hoặc bổ sung thêm enzym giới hạn sau 1-2 giờ rồi lại ủ tiếp. Các enzym polymerase Các enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleotit (DNA hoặc ARN) được sử dụng nhiều trong Công nghệ di truyền. Khi nói về một enzym polymerase nào đó, người ta thường dùng thuật ngữ “phụ thuộc DNA” hoặc “phụ thuộc ARN” để chỉ axit nucleic mà enzym này xúc táccho việc sao chép. DNA polymerase phụ thuộc DNA thì sao chép DNA sang DNA; DNA polymerase phụ thuộc ARN thì sao chép ARN sang DNA, còn enzym ARN polymerase phụ thuộc DNA thì phiên mã DNA sang ARN. Các enzym này tổng hợp axit nucleic bằng cách nối các nucleotit với nhau theo nguyên tắc bổ sung dựa theo mạch khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều từ 5’-3’ và sự khởi đầu cần có đầu 3’-OH tự do. Các DNA polymerase Enzym DNA polymerase I (pol I) là enzym DNA polymerase I xúc tác cho việc lấp đầy chỗ trống trên phân tử DNA hoặc mạch đơn của DNA ngắn. Enzym DNA polymerase I xúc tác tổng hợp mạch đơn mới đồng thời có vai trò trong việc sửa chữa các sai sót trong quá trình sao chép DNA. Ngoài chức năng tổng hợp, enzym DNA polymerase I còn có hoạt tính exonuclease, nghĩa là nó có khả năng thủy phân liên kết giữa các nucleotit từ 2 đầu của phân tử DNA, cắt rời từng nucleotit theo cả 2 chiều 5’-3’ và 3’-5’. Trong nhiều trường hợp, enzym DNA polymerase I được sử dụng trong kỹ thuật xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxy, tổng hợp mẫu dò có đánh dấu phóng xạ hoặc thiết kế các vector mạch đơn. Trong thực tế enzym DNA polymerase I ít được sử dụng mà người ta thường sử dụng một sản phẩm thủy phân của nó được gọi là đoạn Klenow (Klenow fragment). Đoạn này vẫn giữ được hoạt tính của polymerase và exonuclease 5’-3’. Đoạn Klenow được sử dụng khi cần sao chép một phân tử DNA mạch đơn vì chức năng exonuclease bị thiếu khả năng cắt đầu 3’-5’ nên enzym này không thể thủy phân mạch đơn làm khuôn trong quá trình tổng hợp DNA mới. Enzym T4 DNA polymerase có nguồn gốc từ thể thực khuẩn T4 (phageT4) xâm nhiễm vi khuẩn E.coli. Hoạt tính của enzym T4 DNA polymerase tương tự đoạn Klenow. Do nó có hoạt tính exonuclease 3’-5’ mạnh nên thường được sử dụng để tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao. Enzym Tag polymerase được chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermophilus aquaticus. Enzym Tag polymerase thường được sử dụng trong việc nhân gen trong kỹ thuật chuỗi trùng hợp (kỹ thuật PCR). Enzym Tag có khả năng tăng cường sự bắt cặp tạo DNA bổ trợ (cDNA-complementary DNA) nhưng không hoạt động trên các phân tử DNA. Hiện nay còn có nhiều loại DNA polymerase khác lưu hành trên thị trường như T7 DNA polymerase, Vent DNA polymerase … Các enzym DNA polymerase Có 3 loại enzym DNA polymerase thường được dùng trong thực tế, đó là SP6 DNA polymerase, T3 DNA polymerase và T7 DNA polymerase. Enzym SP6 DNA polymerase được tách chiết từ phage xâm nhiễm vi khuẩn Samonella typhimurium. Enzym T3 DNA polymerase và T7 DNA polymerase được tách chiết từ phage xâm nhiễm E.coli. Các enzym này xúc tác quá trình phiên mã tổng hợp ARN từ mạch khuôn của phân tử DNA theo chiều từ 5’-3’ (mạch khuôn có chiều 3’-5’). Trên thực tế DNA polymerase được ứng dụng trong tổng hợp mẫu dò ARN và trong việc nghiên cứu quá trình phiên mã tổng hợp mARN. Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase) Enzym phiên mã ngược có khả năng tổng hợp DNA một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuôn mARN hoặc từ một đoạn polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có enzym phiên mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu như có mặt mARN của gen đó. Các cDNA mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA mạch kép (c-DNA duplex). Đoạn cDNA mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dòng c-DNA. Nếu cDNA có nguồn gốc từ 1 gen thì ta tạo được dòng gen. Trong trường hợp mARN trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được dòng gen chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon), không có đoạn không mã hóa (nitron). Các enzym nối (Ligase) Enzym ligase là enzym nối quan trọng trong tế bào. Các enzym này xúc tác hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn axit nucleic với nhau. DNA ligase xúc tác nối 2 đoạn DNA với nhau, ARN ligase xúc tác nối các đoạn ARN với nhau. Trong công nghệ DNA tái tổ hợp, DNA ligase là enzym chủ yếu được sử dụng rộng rãi. Có một số enzym nối khác nhau nhưng enzym T4 DNA ligase kết hợp với 2 loại enzym T4 polynucleotit kinase và alkaline phosphatase được sử dụng rộng rãi nhất trong các thí nghiệm về Công nghệ di truyền. Có 3 loại enzym nối thường dùng trong Công nghệ di truyền. Enzym E.coli DNA ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản ứng nối 2 đoạn trình tự DNA có đầu so le. Enzym T4 DNA ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E.coli có chức năng giống như E.coli DNA ligase nhưng lại có khả năng nối 2 đoạn trình tự DNA có đầu bằng và là enzym nối được ưa chuộng nhất hiện nay. Enzym T4 DNA ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E.coli có khả năng nối 2 trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester. Ngoài các loại enzym kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính-adaptor) cho các enzym cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn DNA do các enzym giới hạn cắt đầu bằng, từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi loại enzym cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng. Các enzym nuclease Các enzym nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên kết phosphodiester là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Ngoài các enzym giới hạn đã nêu ở trên còn có các loại nuclease chủ yếu sau: Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết ngay sau 1 bazơ nitơ ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn ngẫu nhiên. Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc Aspegillus oryzae. S1 nuclease phân cắt các DNA mạch đơn và cả ARN Enzym nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của DNA và không có khả năng cắt nội liên kết. Enzym exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo thành các đoạn DNA có đầu 5’ nhô ra. Enzym ARNase A tách chiết từ tụy bò. Enzym này thường được sử dụng để loại bỏ ARN trong hỗn hợp DNA và ARN. Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai DNA-ARN, nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ 2 của cDNA, từ đó tạo nên phân tử cDNA kép. Các vector sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp Muốn chuyển được gen mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể nhận), hoặc tách dòng gen, điều cơ bản là cần phải có vật chuyển gen (vector chuyển gen). Vector chuyển gen là phân tử DNA nhỏ có khả năng mang được gen cần thiết. a) Yêu cầu của vector chuyển gen: Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép mà độc lập trong tế bào. Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp cho các đoạn gen lạ/ Có đoạn trình tự khởi điểm (prômter). Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận. Thông thường dấu chuẩn chọn lọc là các gen kháng chất kháng sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu. Để đảm bảo được tính bền vững của DNA tái tổ hợp, ngoài các đặc điểm trên vector chuyển gen cần những đặc tính khác để cho việc tạo, tách dòng dễ thực hiện như: Chứa các gen vô hiệu hóa các đoạn DNA không mong muốn bị gắn nhầm vào. Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm bảo sự khuếch đại của gen lạ mong muốn được gắn vào. Giá trị của các vector chuyển gen ở chỗ nó được cấu tạo thuận tiện cho mục đích sử dụng. Hiện tại chưa có loại vector chuyển gen toàn năng, mà cần phải lựa chọn vector chuyển gen cho từng đối tượng và tùy thuộc vào kích thước của đoạn gen cần được chuyển. b) Ứng dụng chủ yếu của vector chuyển gen : Tạo dòng, nhân dòngcác đoạn trình tự hoặc gen để tạo nhiều bản sao giống nhau. Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA hoặc một gen Chuyển gen vào tế bào của vi sinh vật khác (vật chủ nhận). Sản xuất các ARN. Sản xuất các protein được tổng hợp từ gen đã được tạo dòng. Do tính chất quan trọng và nhiều ứng dụng nên các vector chuyển gen ngày càng được khám phá, hoàn thiện không ngừng. Từ những vector chuyển gen sẵn có trong tự nhiên như plasmid ở vi khuẩn, ngày nay người ta đã tạo ra nhiều loại vector phức tạp ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau thậm chí tạo ra cả nhiễm sắc thể nhân tạo. Các vector chuyển gen: Plasmid Plasmid là những phân tử của DNA cực nhỏ nằm ở bào tương của Procaryote. Plasmid cĩ một số đặc điểm cơ bản sau: + Cĩ kích thước nhỏ hơn kích thước của DNA ở nhân tế bào. + Hồn tồn giống mã di truyền của DNA trong nhân. + Cĩ khả năng tái tạo độc lập. + Cĩ khả năng truyền lại một số tính chất đặc biệt cho thế hệ sau, thí dụ như tính kháng nguyên tố nặng, tính kháng sinh, tạo nhân tố CoIE1 (tức Plasmid cĩ E1). Các vector chuyển gen thường được sử dụng là các plasmid của vi khuẩn và các Bacteriophage. Plasmid được coi như vector chuyển gen và được nghiên cứu rất sớm, ngày càng hồn thiện. Thế hệ thứ nhất: là các plasmid tự nhiên. Hiện nay người ta khơng sử dụng loại plasmid này nữa. Thế hệ thứ hai: là các plasmid cĩ cấu tạo phức tạp hơn. Một trong những plasmid loại này được sử dụng nhiều nhất là pBR322. Ðây là plasmid được cấu tạo từ nhiều đoạn nhỏ của các plasmid khác nhau, để vừa cĩ được các gen kháng thuốc, vừa cĩ các điểm nhận biết cho các gen hạn chế và chúng cĩ chiều dài khoảng 5000 cặp base. Plasmid này cĩ khả năng sao chép độc lập với tế bào E.coli, và tồn tại với số lượng trung bình 20-30 bản sao cho mõi tế bào.  Trong những điều kiện nuơi cấy đặc biệt ta cĩ thể khuyếch đại cĩ chọn lọc làm tăng số lượng plasmid đến hơn 1000 bản sao cho 1 tế bào. Thế hệ thứ ba: Là những plasmid đa năng và chuyên dùng. Cĩ rất nhiều trình tự nhận biết các loại plasmid này, được xếp nối tiếp nhau tạo thành đoạn dài gọi là polylinkers. Các vector chuyển gen là phage lamđa (l) Nhiều thí nghiệm cho thấy là phage (l) cĩ khả năng tải nạp. Chúng mang gen từ tế bào vi khuẩn sang tế bào cho.  Ưu điểm nổi bật của vector phage (l) là: Chúng cĩ hệ thống tự động xâm nhập và khả năng sinh sản trong tế bào chủ với hiệu quả cao hơn rất nhiều so với việc đưa plasmid theo con đường biến nạp.DNA của phage cĩ thể ở dạng thẳng. Khi bị cắt ở giữa rời ra thành hai phần phải và trái. Ðoạn gen lạ được ráp vào giữa sao cho DNA tái tổ hợp khơng lớn hơn 105% hay nhỏ hơn 78% của bộ gen bình thường của phage lamđa. Chúng cĩ khả năng mang đoạn DNA lạ dài hơn của plasmid. DNA cĩ thể gĩi gọn vào đầu phage. Các vector chuyển gen khác: Cosmid: là vector được cấu tạo từ plasmid cĩ gắn thêm gen cos của phage .Gen cos s4 giúp cho DNA của phage ( từ dạng thẳng nối đấu lại thành vịng trịn). Cosmid cĩ thể chứa một gen lạ cĩ kích thước lên đến 45Kb. Phage M13: là loại vector thể sợi cĩ DNA mạch đơn. Người ta thường sử dụng chúng để xác định trình tự các nucleotid của gen, sản xuất các mẫu thăm dị DNA , thực hiện một đột biến định hướng. Phagemi: là vector được cấu tạo từ plasmid cĩ gắn thêm một đoạn DNA của phage M13. Plasmid Ti: loại này được sử dụng rộng rãi để chuyển gen vi khuẩn đất Agrobađerium tumefaciens sang cho thực vật. Nhân tố gây u cho thực vật là Plasmid Ti. (Tumor – Puducing) cĩ DNA vịng trịn và kích thước khoảng 200Kb, T – DNA là phần rất quan trọng của plasmid. Khi được chuyển, nĩ gắn xen kẻ một cách ngẫu nhiên vào bộ gen của tế bào thực vật. Nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men: Người ta tìm thấy ở nấm men Saccharomyces cerevisiae một loại plasmid vịng trịn 2 (cĩ độ dài vào khoảng 6.300 cặp nucleotid). Đây là trường hợp duy nhất được tìm thấy ở Eucaryote. Từ loại plasmid này người ta đã tạo ra được một loại plasmid nhân tạo giống y như thế và đã đặt tên cho nĩ là YAC (Yeast Artificial Chromosome). Loại plasmid này cĩ một số nucleotid rất quan trọng. ARS (Autonomously Replicating Sequence) trình tự sao chép của chúng tương tự ori ở plasmid. CEN (Centromere – tâm động). Trình tự CEN đảm bảo cho sự phân đơi và đi về hai cực tế bào như tâm động. 2 TEL (Telemere) là 2 trình tự duy trì hai đầu mút thẳng mà khơng bị cắt, vãn sao chép và tiến hành phân chia nhiễm sắc thể. Các điểm nhận biết cho endonuclease Sma I, Bam HI, Xho I và Sfi I, Not I. Tạo plasmid tái tổ hợp 1) Tạo nguồn gen Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gen. Có 3 phương pháp khác nhau để thu nhận gen: Thu nhận DNA từ hệ gen (thư viện DNA): Đây là phương pháp thường dùng ngay từ giai đoạn đầu tiên phát triển công nghệ DNA tái tổ hợp. Toàn bộ phân tử DNA của một loài sinh vật được tách thành các đoạn nhỏ bằng cách lắc cơ học hoặc dùng enzym giới hạn. Công đoạn sau đó là gắn các đoạn này vào plasmid. Phương pháp này được dùng để lập ngân hàng DNA của cả hệ gen. Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học: Muốn tổng hợp hóa học đoạn DNA hay một gen cần phải biết trình tự các đoạn DNA hay gen đó. Sử dụng các máy tổng hợp DNA tự động (DNA synthesizer). Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA): Đây là phương pháp tạo gen từ mARN nhờ enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase). Đầu tiên, từ mARN tổng hợp được cDNA mạch đơn. Nhờ enzym phiên mã ngược nên bất cứ gen nào có mARN hoặc một đoạn polyribonucleotit tổng hợp bằng con đường hóa học đều có thể tổng hợp được cDNA. Từ các cDNA mạch đơn có thể tạo thành cDNA mạch kép nhờ có enzym DNA polymerase. Các cDNA mạch kép được gắn vào plasmid để tạo ra plasmid tái tổ hợp. Ngân hàng DNA bổ trợ có nhiều ưu thế vì các dòng cDNA chứa đoạn trình tự nucleotit chỉ gồm các đoạn mã hóa của một gen. Mặt khác có thể tạo ra những tế bào vi khuẩn chuyên hóa chỉ tạo ra một loại protein tương ứng với một mARN cụ thể, từ đó sản phẩm tạo ra dễ được tinh sạch và được sản phẩm như mong muốn. Tạo plasmid tái tổ hợp Khi có các đoạn DNA hay cDNA mong muốn. Bước tiếp theo là gắn chúng vào vector chuyển gen để tạo ra plasmid tái tổ hợp. Có nhiều phương pháp gắn các đoạn DNA hoặc cDNA vào plasmid hoặc các vector chuyển gen khác. Phương pháp dùng đầu dính: Theo phương pháp này, đầu tiên cần xử lý DNA chứa đoạn gen mong muốn và vector chuyển gen (như plasmid) bằng các loại enzym giới hạn cắt tạo đầu dính (ví dụ: E.coli). Trộn lẫn DNA và vector chuyển gen đã bị cắt bằng cùng một loại enzym giới hạn như đã nêu trên. Bước tiếp theo là dùng enzym nối ligase để gắn các đoạn cần nối với nhau. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong việc tạo plasmid tái tổ hợp. Phương pháp dùng đoạn nối (linkers): Các đoạn DNA hay ARN ngắn khoảng 10-20 nucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học, gọi là oligonucleotit. Đoạn oligonucleotit tổng hợp này cần có đoạn trình tự nhận biết tương ứng với một loại enzym giới hạn (ví dụ: E.coRI) dùng làm đoạn nối (linker). Các đoạn nối được gắn vào 2 đầu của đoạn DNA (gen) lạ tạo thành đoạn DNA có 2 đoạn trình tự tương ứng với điểm cắt của enzym giới hạn. Bước tiếp theo là xử lý các đoạn DNA lạ có gắn đoạn nối và xử lý vector chuyển gen bằng cùng một loại enzym giới hạn (E.coRI). Trộn chung vector và DNA đã xử lý bằng enzym giới hạn (E.coRI) và gắn chúng với nhau nhờ enzym nối ligase. Phương pháp dùng enzym terminal transferase: Đây là phương pháp gắn đuôi oligo, một loại nucleotit, ví dụ CCCCC (đuôi dC) vào đầu 3’-OH của một mạch DNA (đuôi homopolymer), do đó tạo ra được mạch đơn thứ 2 của cDNA có đuôi bổ sung là GGGGG. Khả năng tạo đuôi homopolymer là do enzym terminal