Đồ án Trichoderma Reesei: Tìm hiểu gen qui định Enzyme Cellulase và một số phương pháp nâng cao khả năng phân huy Cellulose

 Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii …. Hình 1 3: Chế phẩm enzyme trichoderma được bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất ở công ty Điền Trang. Cải thiện năng suất cây trồng : (kích thích sự tăng trưởng của cây trồng)  Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) giúp khả năng hút chất ding dưỡng .Ngoài ra, những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán. Hình 1 4 Tăng cường rễ phát triển trong lĩnh vực trồng ngô và đậu tương của dòng T. harzianum T-22 [G. E. Harman, Cornell University, Geneva]. Trong lĩnh vực xử lý môi trường Xử lý các phế phẩm nông nghiệp: Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngòai tác dụng sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, hay sử dụng như một lọai thuốc bảo vệ thực vật thì còn có tác dụng để xử lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất hiệu quả. Chế phẩm sinh học BIMA (có chứa Trichoderma ) của Trung Tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, chế phẩm Vi-ĐK của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam … đang được nông dân TP. Hồ Chí Minh và khu vực Đồng bằng Sông Cửu long, Đông nam bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón cho cây trồng. Việc sử dụng chế phẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ hoai phân chuồng từ 2 – 3 lần so với phương pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng. Người nông dân lại tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng của nấm đối kháng Trichoderma có chứa trong phân. Các chế phẩm của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm chứa các vi sinh vật do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma sp. và vi khuẩn Bacillus sp. Những vi sinh vật trên có tác dụng phân huỷ nhanh các hợp chất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò (protein và cellulose), gây mất mùi hôi. Trước đó, chế phẩm BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt. Trong lĩnh vực khác Trichoderma được bổ sung vào thức ăn gia cầm nhằm tăng khả năng tiêu hóa hemicellulose ở vật nuôi . Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển . Hình 1 5: Một số gen biocontrol từ T. harzianum have been inserted into plants, where they provide resistance to several diseases. harzianum đã được đưa vào cây thuốc lá để kháng nấm Alternaria alternata gây bệnh héo lá và vào cây khoai tây để kháng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh thối rễ [bởi G. E. Harman, Cornell University, Geneva]. Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzymee ngoại bào rất có hiệu quả. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzymee khác phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự . Khả năng ứng dụng ở Việt Nam Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả . Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei: Cellulose: Cấu trúc: Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-D-Glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật. Hinh 1 6: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose:Màu nâu-cacbon, màu đỏ-oxy, màu trắng-hydro [ web bách khoa toàn thư ]. Các đơn vị lặp đi lặp lại nhỏ nhất trong cellulose là cellobiose, trong đó bao gồm hai đơn vị glucose. Trong chuỗi cellulose tinh thể dính vào nhau bởi liên kết hydro và lực van der Waals để tạo thành cấu trúc cao phân tử không hòa tan. Hình 1 7: Cấu trúc của phân tử cellulose Nguồn gốc: Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,....). Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Điều không may là cellulose lại "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng may mắn là Trichoderma lại có khả năng phân hủy cellulose mạnh mẽ. Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật. Cellulose có nhiều trong sợi bông (95%) , sợi lanh (71%), sợi đay ( 71% ). Ngoài ra, cellulose còn có trong gỗ, thưc vật dưới nước (tảo, rong,…),sản phẩm phụ phẩm nông nghiệp ( rơm, rạ, lõi ngô,…). Hình 1 8: Hình ảnh mô tả cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật [bởi Michael W. Davidson ] Bảng 1 2: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật Cellulase: Cấu trúc: Cellulase có 2 vùng chức năng: trung tâm xúc tác và trung tâm tạo liên kết với cellulose. Hai vùng chức năng này nối kết với nhau thông qua vùng không xúc tác [5]. Hinh 1 9: Cấu trúc không gian 3 chiều của enzyme cellulase (Ngân hàng dữ liệu protein, cấu trúc 1JS4) Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản ứng. Thông thường cellulose chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một số trường hợp đặc biệt. Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose. Đơn vị chức năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hướng cơ chất là cellulose đến trung tâm xúc tác của cellulase. Bên cạnh đó, một số cellulose cũng tham gia vào quá trình xúc tác bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng tinh thể. Một số khác lại có xu hướng liên kết với cellulose vô định hình thay vì cellulose dạng tinh thể [6]. Trung tâm tạo liên kết với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc trưng cho enzyme thủy phân cellulose mà nó còn cấu thành tiểu đơn vị xúc tác cấu trúc cellulosome. Trung tâm tạo liên kết với cellulose liên kết thuận nghịch với cellulose nên nó được ứng dụng trong công nghệ sản xuất protein [7]. Vùng không xúc tác giữ vai trò cầu nối giữa trung tâm tạo liên kết với cellulose và trung tâm xúc tác. Đây chính là vùng đại diện cho sự tương tác giữa protein – protein và giữa protein – đường trong quá trình tổng hợp enzyme [5]. Hinh 1 10: Sơ đồ cấu trúc cellulase A. Cellulase ở nấm và một số vi khuẩn chỉ chứa 1 Trung tâm tạo liên kết với cellulose B. Cellulase ở một số vi khuẩn chứa 2 Trung tâm tạo liên kết với cellulose C. Sơ đồ cấu trúc cellulosome (cấu trúc gồm nhiều enzyme, hoạt động ngoài tế bào) Hinh 1 11: Ứng dụng trung tâm liên kết với cellulose trong sản xuất protein tái tổ hợp [7] Sử dụng phương pháp Bioseparation để phân tách cellulose sản xuất protein tái tổ hợp. (Bioseparation là quá trình tách các thành phần của hỗn hợp đi qua một cột hấp thụ để mỗi thành phần hấp thụ vào bề mặt khác nhau. Quá trình này được sử dụng để tinh chế các protein, các chất sinh học được sử dụng trong sản xuất dược phẩm và thực phẩm ). Sử dụng phương pháp Bioprocessing gắn thêm ligand vào để biến đổi cấu trúc của protein tái tổ hợp. Sử dụng enzyme để cắt protein mong muốn và thu được protein đó. Phân loại: Ban đầu enzyme cellulase được phân chia thành 2 loại dựa trên khả năng phân hủy cellulose của enzyme: endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91). Trong đó, cellobiohydrolase có khả năng phân hủy mạnh cellulose kết tinh so với endoglucanase [5]. Tuy nhiên hiện nay tồn tại một hệ thống phân loại cellulase thành 3 nhóm theo cơ chế xúc tác của enzyme [8]. Cellulase Cơ chất Cơ chế Sản phẩm Endo-cellulase Cellulose kết tinh Cellulose vô định hình Cắt liên kết giữa các chuỗi cellulose Chuỗi đơn cellulose Exo-cellulase (cellobiohydrolase) Chuỗi đơn cellulose Cellulose kết tinh Cắt liên kết nội chuỗi (1 vị trí cắt sau 2-4 glucose) Tetrasaccharides, disaccharides Cellobiase Tetrasaccharides, disaccharides Cắt liên kết glycoside giữa 2 glucose Monosaccharide Bảng 1 3: Bảng phân loại cellulase [8, 9] Endo-cellulase (E.C.3.2.1.4) hay 1,4-β-D-glucan 4 glucanohydrolase tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh. Exo-cellulase (E.C.32.1.91) hay 1,4-β-D glucan cellobiohydrolase cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose (tetrasaccharides, disaccharides). Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endo-cellulase phân giải chúng. Cellobiase (E.C.3.2.1.21) cò được gọi là β-glucosidase, tham gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy các sợi cellulose. Cơ chế hoạt động: Quá trình phân hủy cellulose được diễn ra qua nhiều bước: Cellulase liên kết với cellulose thông qua trung tâm liên kết với cellulose trên enzyme (giai đoạn 1). Enzyme định hướng vị trí liên kết dễ phân giải trên bề mặt cơ chất (giai đoạn 2). Hình thành phức hệ enzyme – cơ chất ( giai đoạn 3 ). Thủy phân liên kết β-glycosidic nhờ β- glucosidase là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do T.reesei tiết ra. β- glucosidase nội bào hoặc gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa được làm sáng tỏ ( giai đoạn 4 ). Desorption of cellulases from the substrate or repetition of step 4 or steps 2/3 if only the catalytic domain detaches from chain (giai đoạn 5 ). Thủy phân cellobiose tạo thành glucose bởi β-glucosidase. Ngoài ra, sản phẩm ức chế và sự biến đổi cơ chất cùng với quá trình thủy phân thì ảnh hưởng tới các bước trên ( giai đoạn 6 ). Hinh 1 12: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase [10]. Các bước 1 – 4 để tạo thành sản phẩm cellobiose Bước 1 — vùng xúc tác kết nối với vùng liên kết nhờ tác nhân liên kết linker Bước 2 — xác định vị trí của chuỗi kết thúc Bước 3 — hình thành phức hệ enzyme – cơ chất Bước 4 — thủy phân liên kết β-glycosidic để tạo sản phẩm là cellobiose. Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei : Nhiều loại vi nấm có khả năng sản sinh enzyme phân hủy cellulose. Đó là các loại nấm mùn mềm, nấm mùn nâu, nấm mùn trắng, nấm kỵ khí trong dạ dày loài ăn cỏ... Các loại nấm tạo ra mùn mềm chủ yếu phân hủy polysaccharide. Trong nhóm nấm này, khả năng sinh sản các enzyme phân hủy cellulose cũng khác nhau. Loài nấm có khả năng sinh sản hàng loạt enzyme phân hủy cellulose và được nghiên cứu kỹ là T. viride (reesei). Trichoderma tiết ra một lượng lớn các enzyme khác nhau, có khả năng phối hợp để phân hủy tinh thể cellulose. T. reesei sản sinh 5 enzyme endoglucanase, hai exoglucanase và một cellobiase (β-glucosidase) [8, 11]. Enzyme EC 3.2.1 Kí hiệu CD thuộc họ Endo-cellulase I II III IV V 4 4 4 4 4 EG I EG II EG III EG IV EG V 7/C 5/A5 12/H 61 45/K Exo-cellulase I II 91 91 CBH I CBH II 6/B 7/C Cellobiase 21 BG Bảng 1 4: Tóm tắt các loại enzymee có mặt trong T.reesei [8, 11]. Cellulase từ T.reesei là glycoprotein trong đó saccharide liên kết với gốc asparagin (liên kết qua N) hoặc với gốc serin và threonin (liên kết qua O). Hàm lượng đường của cellulase thay đổi từ 1 đến 10% bao gồm mannose, glucose, galactose, xylose, N-Acetyl glucozamin và galactozamin. Liên kết N-glycozyl tạo ra cấu hình đặc biệt ổn định cấu trúc của cellulase, nhờ đó, bảo vệ cellulase khỏi bị phân hủy protein trong quá trình tiết enzyme. Trong khi đó, liên kết O-glycozyl cấn thiết để tạo hoạt tính cellulase . Endoglucanase có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử cellulose. Nhờ đó, độ trùng hợp các phân tử giảm nhanh, đồng thời xuất hiện thêm các nhóm khử. Trong 5 loại endoglucanase tiết ra bởi T.reesei, EG I chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng 5÷10% tổng số protein tiết ra khi nuôi cấy T. reesei. Mặc dù cơ chế hoạt động khác nhau, EG I và CBH I có mạch tận cùng chứa N giống nhau. EG III có các dạng khác nhau, với khối lượng phân tử 48, 48 và 37 kDa và điểm đẳng điện tương ứng ở 5,4; 5,7 và 4,8 . Exoglucanase phân hủy cellulose theo phương thức tách dần từng đoạn cellobiose khởi đầu mạch không có tính khử của phân tử cellulose. Các enzyme này tác dụng rất hạn chế lên dẫn xuất của cellulose như cacboxycellulose và hydroxyetylcellulose. CBH I và CBH II khác nhau về số lượng đường gắn kết với protein. Thành phần aminoaxit không giống nhau. Tâm hoạt động của hai enzyme này cũng khác nhau, do đó, phương thức hoạt động có những nét riêng. CBH I ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của cellulose, trong khi đó, CBH II liên kết cả vùng tinh thể và vùng vô định hình. CBH I chiếm khoảng 60% lượng enzyme do T.reesei tạo ra. Hình 1 13: vùng xúc tác của các enzyme [] Cellobiase chỉ là một phần nhỏ trong số các protein ngoại bào do vi sinh vật tạo ra. Các enzyme làm xúc tác cho quá trình thủy phân Cellodextrin tan trong nước cũng như hợp chất alkyl- và aryl-β-glucoside. Cellobiase nội bào hoặc cellobiase gắn kết với màng tế bào cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Song mối quan hệ chính xác về gen và sinh hóa giữa các enzyme này chưa được làm sáng tỏ. Có ý kiến cho rằng enzyme ngoại bào xuất hiện do sự giải phóng enzyme nội bào cũng như enzyme gắn kết với màng tế bào và thoát ra ngoài theo cơ chế tự phân giải . Cellulase từ T.reesei tồn tại dưới dạng tổ hợp đa enzymee (cellulosome) và ít tồn tại dưới dạng từng enzyme biệt lập. Cellulosome thủy phân hiệu quả cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose. Trong khi đó, các enzyme đơn lẻ hoặc kể cả hỗn hợp của chúng không thực hiện đồng thời cả hai chức năng trên . Quá trình sản xuất enzyme cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm ứng và ức chế. Trong đa số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp cellulose được xúc tiến nhờ sản phẩm phân hủy của cellulose. Về phương diện này, các endoglucanase được nghiên cứu nhiều nhất. Một số nhà khoa học nhận thấy P.chrysosporium và G.trabeum tạo ra endoglucanase trong môi trường chỉ chứa cacboxymetylcellulose, cellobiose. Hiện tượng này không xảy ra đối với T.reesei . Cellobiose chỉ gây cảm ứng cho cellulase trong trường hợp T.reesei khi quá trình thủy phân cellobiose giảm đi bằng cách thêm nojirimixin vào môi trường nuôi cấy. Các sản phẩm khác của quá trình phân hủy cellulase như xenlobiono-1.5-lacton hoặc sản phâm oxy hóa cellulose cũng làm tăng khả năng hình thành cellulase từ T.reesei . Glucose là sản phẩm cuối của quá trình thủy phân cellulase. Glulcose gây hiện tượng ức chế endoglucanase ở T.reesei . Tính chất xúc tác của cellulase nhờ vào khả năng hoạt động phối hợp của toàn bộ hệ thống enzyme cellulose. Nó phụ thuộc vào tỉ lệ các enzyme riêng biệt và mức độ bão hòa của cơ chất và loại cơ chất. Hoạt động phối hợp của CBH I và CBH II cùng với EG I và EG III tinh chế từ T.reesei đã được đánh giá với các cơ chất khác nhau cho thấy rằng sự phối hợp giữa các EG và CBH II theo phương thức thông thường đối với endoenzymee và exoenzymee. Trong khi đó, sự phối hợp hoạt động giữa các EG và CBH I lại phụ thuộc vào đặc trưng cấu trúc của cơ chất. Hoạt tính của enzyme riêng biệt từ T.reesei là cao nhất đối với cellulose vô định hình. Trong khi đó, hệ enzymee hai cấu tử CBH I/EG III và CBH I/CBH II có khả năng phối hợp tốt hơn đối với cellulose tinh thể . Hình 1 14: Cơ chế enzym thủy phân cellulose . Hai cellobiohydrolases (CBH) tấn công vào vùng cellulose tinh thể ở chuỗi kết thúc và endoglucanases (EG) ở giữa khu của cellulose. Các vòng tròn đầy, ký hiệu là R, đại diện cho vùng kết thúc giảm và các vòng tròn mở, ký hiệu NR, đại diện cho vùng kết thúc không giảm. C là vùng cellulose kết tinh[ Teeri, 1997 ]. Quá trình sản sinh cellulase ở T.reesei còn chịu sự chi phối của các hiện tượng khác, ngoài hiệu ứng cảm ứng vá ức chế của các sản phẩm phân hủy. Nhiều loại hợp chất phenol đã được chứng minh là có tác dụng kìm hãm sự phát sinh cellulase ở T.reesei. Ngoài ra, các hợp chất phenol gây ức chế endoglucanase ở thể đột biến T.reesei không tạo ra phenol oxidase, nhưng không ức chế đối với thể hồi biến không tạo phenol oxidase và loại thông thường . Hơn nữa, hoạt tính của cellulase trong chất lọc nuôi cấy nấm không những phụ thuộc và sự điều tiết sinh tổng hợp cellulase mà còn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường nuôi cấy. Gluconolacton là chất ức chế mạnh đối với cellobiase ở T.reesei. Sự kìm hãm hoạt động của cellobiase khi có mặt gluconolacton hoặc nojirimixin có thể ngăn ngừa hiệu ứng cảm ứng của cellulase. Song, ngoài hiện tượng ức chế, khi nuôi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase. Chẳng hạn, theo báo cáo gần đây thì T. reesei sinh ra hai loại β-glucosidase là Bgl1 và Bgl2 được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose có khả năng làm tăng tới 10 lần hoạt tính endoglucanase của T.reesei (Alinda A. Hasper et al., 2001). Hệ gene qui định cellulase ở T.reesei Enzyme Gen Cellobiohydrolase I II Cel7A Cel6A Endoglucanase I II III IV V Cel7B Cel5A Cel12A Cel61A Cel45A Bảng 1 5: Tóm tắt các gen qui định cellulase ở nấm T.reesei Phần 2: Phương pháp tác động để nâng cao khả năng phân hủy cellulose cao Phương pháp hiện đại: Nâng cao khả năng sản xuất cellobiohydrolases ( CBH ) ở chủng T.reesei Khuếch đại biểu hiện cbh1 bằng cách tăng số bản sao gen cbh1: Plasmid pALK496 (Hình 21) đã được xây dựng và chuyển vào nấm T. reesei ALKO2221 để tăng số lượng bản sao của gen cbh1. Hinh 2 1: Plasmid pALK496 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHI [ Kelly và Hynes, 1985 ]. a. Khảo sát sự tồn tại của đoạn ADN cần chèn vào các chủng biến đổi: Kết quả Southern Blotting cho thấy vạch có kích thước 4,5 kb, 3 kb và 2.3 kb tương ứng casset biểu hiện cbh1, amdS và đoạn egl1 tìm thấy ở những chủng ALKO3760, ALKO3761 và ALKO3862 . Vạch 4.5 kb của chủng ALKO3762 và chủng ALKO3760 đậm hơn so với vạch 4.5 kb của chủng ALKO3761, chứng tỏ số lượng bản sao casset biểu hiện cbh1 của chủng ALKO3762 và chủng ALKO3760 nhiều hơn. Vạch 2.0 kb (pALK496 phân đoạn bởi enzyme cắt giới hạn Xba1) của chủng ALKO3862 và chủng ALKO3760 chứng tỏ chúng chứa 2 bản sao liên tiếp của đoạn ADN tách ra từ pALK496. Vạch 6 kb, 3.3 kb, 2.1 kb, 1.9 kb của chủng ALKO3760 chứng tỏ chủng chứa một phần casset biểu hiện cbh1. Như vậy, ALKO3862 chứa ít nhất 2 bản sao cbh1 và 2 đoạn sao chép này nằm liên tiếp nhau. ALKO3760 chứa ít nhất 2 bản sao cbh1, trong đó, đoạn sao chép thứ 2 chưa hoàn chỉnh là đoạn ADN chứa trong plasmid pALK496). Hình 2 2: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi. Giếng 1 và 2: marker Giếng 3: ALKO2221, giếng 4: ALKO3760, giếng 5: ALKO3761, giếng 6: ALKO3862. b. Khảo sát khả năng tổng hợp cellulase ở các chủng: Các chủng biến đổi được khảo sát khả năng tổng hợp cellulase bằng phương pháp filter paper-hydrolyzing activity (FPU). So với chủng chủ ALKO2221, lượng CBHI tăng 1.5 lần ở chủng ALKO3760, 1.4 lần ở chủng ALKO3862 và 1.3 lần ở chủng ALKO3761 (bảng 2 1). Ngoài ra, những thay đổi trong số lượng của CBHII và EGI đã được tìm hiểu. Số lượng CBHII giảm 25% ở chủng ALKO3760 và chủng ALKO3862, nhưng ở chủng ALKO3761 lượng CBHII đã tăng 15% so với chủng chủ ALKO2221. Đáng ngạc nhiên, số lượng EGI giảm 30% và 40% trong ALKO3760 và chủng ALKO3862 so với chủng chủ ALKO2221, mặc dù các gen egl1 được giữ nguyên vẹn trong bộ gen. Mức độ tiết ra các protein tăng lên so với chủng chủ. Chủng Số bản sao casset biểu hiện cbh1 CBHI (mg/ml) CBHII (mg/ml) EGI (mg/ml) ALK02221 0 2.2±0.1 0.18±0.01 0.32±0.01 ALK03760 2 3.4±0.2 0.13±0 0.22±0 ALK03862 2 3.1±0.1 0.13±0.01 0.17±0.01 ALK03761 1 3.0±0.2 0.22±0.04 0.00 Bảng 2 1: Sản xuất cellulase bởi chủng chủ ALK02221 và bởi chủng đã biến đổi ALK03760, ALK03862, ALK03761. Khuếch đại biểu hiện cbh2 bằng cách sử dụng promoter mạnh cbh1: Casset của pALK546 (hình 23) chứa promoter mạnh cbh1 biến nạp vào chủng ALKO2221 nhằm điều khiển biểu hiện cbh2 bằng promoter cbh1. Chủng biến đổi được phân tích bằng phương pháp Southern Blot nhằm khẳng định sự tồn tại của đoạn promoter. Hinh 2 3: Plasmid pALK546 sử dụng cho biến đổi của chủng ALK02221 nhằm sản xuất lượng lớn CBHII . Hình 2 4: Kết quả Southern Blot của các chủng biến đổi. ADN toàn phần được phân cắt bởi enzyme cắt giới hạn XhoI. Sản phẩm của quá trình này được lai với đoạn ADN của pALK 546 được phân cắt bởi EcoRI và BamHI. Giếng 1 và 6: khối lượng phân tử marker , Giếng 2: ALKO2221, giếng 3:ALKO3798, giếng 4: ALKO3799, giếng 5: ALKO3873 Locus của cbh1 và cbh2 có kích thước 9.1 kb và 9.8 kb nằm trên cùng một vị trí kích thước được tìm thấy ở mọi chủng. Vạch có kích thước 4.9 kb tương ứng đoạn gen ble liên kết với promoter cbh1( ble-cbh1 promoter), vạch có kích thước 3.4 kb tương ứng đoạn cbh2 và đầu 3’ của gen egl2, vạch có kích thước 2.3 kb là đoạn 5’ của gen egl2 liên kết với ble. Kết quả cho thấy chủng ALKO3898 và ALKO3899 chứa 1 bản sao có nguồn gốc từ plasmide pALK546 tuy nhiên vị trí chèn của bản sao này chưa được xác định. Một số nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng ALKO3873 chứa 1 bản sao chèn vào vị trí egl2. Hình 2 5: Kết quả Southern Blot ở các chủng biến đổi. Làn 1: marker, kDa, làn 2: ALK02221, làn 3: ALK03873, làn 4: ALK03798, làn 5: ALK03799. Làn 1: ALK02221, làn 2: ALK03873, làn 3: ALK03798, làn 4: ALK03799. Kết quả SDS-PAGE cho thấy ở 3 chủng biến đổi, lượng CBHI/II được tổng hợp nhiều hơn so với chủng đối chứng dựa vào độ đậm của các vạch. Khảo sát lượng CBHII tổng hợp bằng Western Blot, độ đậm của các vạch phản ánh lượng CBHII cao được tìm thấy ở cả 3 chủng biến đổi. Lượng CBHII tăng từ 3- 4 lần khi ta tăng thêm số lượng bản sao gen cbh2 dưới sự điều khiển của promoter mạnh cbh1. Chủng ALK03798 (chứa EGII ) sản xuất lượng lớn CBHII (gấp 4 lần so với chủng chủ ALKO2221). ALK03873 (không chứa EGII) và ALK03799 (chứa EGII) sản xuất lượng CBHII lớn gấp 3 lần so với chủng chủ. Chủng ALKO3798 và ALKO3799 sản xuất lượng CBHI khoảng 20% và ALKO3873 khoảng 10% so với chủng chủ. Lượng endoglucanase giảm 20% ở chủng ALKO3798 và ALKO3799. Như vậy thiếu gen egl2 trong chủng ALKO3873 là nguyên nhân làm giảm lượng endoglucanase. Chủng CBHI (mg/ml) CBHII(mg/ml) EGI(mg/ml) ALK02221 0.18±0.01 0.18±0.01 0.32±0.01 ALK03798 0.70±0.07 0.70±0.07 0.31±0.05 ALK03799 0.50±0.05 0.50±0.05 0.28±0.01 ALK03873 0.53±0.17 0.53±0.17 0.39±0.10 Bảng 2 2: Sản xuất cellulase bởi chủng ALKO2221 và chủng ALKO3797, ALKO3798, ALKO3873. Nâng cao khả năng sản xuất endoglucanases ( EG ) ở chủng T.reesei bằng cách sử dụng promoter mạnh : T.reesei VTT-D-79125 là chủng đột biến sản xuất lượng lớn cellulase gồm EGI/II, CBHI/II. ALKO2698 là chủng sản xuất lượng lớn EGI không chứa gen cbh1- được thay thế bởi casset biểu hiện egl1. Vì vậy, hai chủng này được sử dụng như thể nhận plasmid nhằm tạo chủng biến đổi có khả năng sản xuất lượng lớn EGII. Endoglucanase sản xuất bởi chủng biến đổi EGII liên quan đến số lượng bản sao của casset biểu hiện egl2. Chủng T.reesei sản xuất lượng lớn EGI/II và không tổng hợp CBHI/II được xây dựng bằng cách thay cbh2 bằng gen egl2. Các chủng được biến đổi nhờ vào pALK537 và pALK540. pALK537 gồm promoter cbh1 kich thước 2.2 kb và đoạn AvaII của vùng kết thúc cbh1 có kích thước 0.7 kb. pALK540 chứa promoter cbh1, nhân tố kết thúc và egl2 như trong pALK537. Hình 2 6: Sơ đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pALK537. egl2 được nối với promoter cbh1. Đoạn NotI 9.2 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi. Hình 2 7: Giới hạn của plasmid pALK540. Đoạn ClaI-PvuI 11.6 kb thì được tách ra từ plasmid để thực hiện biến đổi. Biến đổi chủng T.reesei : để gen egl2 biểu hiện cho lượng lớn EG, promoter mạnh của gen cbh1 được dù