Giáo trình Nuôi trồng thuỷ sản và bệnh học thuỷ sản

yên trên tiêu bản mô bằng cách sử dụng kháng thể có tính đặc hiệu với kháng nguyên qua phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Kháng thể dùng cho phản ứng có thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (kỹ thuật IFC), enzym, chất phóng xạ… để có thể nhận biết khi quan sát dưới kính hiển vi điện, kính hiển vi huỳnh quang hay những loại kính hiển vi khác (hình 2.1). II.2.2. Ứng dụng - Xác định tác nhân gây bệnh một cách chuyên biệt dựa trên tính nhạy và tính chuyên biệt của phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể. - Do khả năng phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản mô hay tế bào nên phương pháp này cho phép tìm hiểu khả năng gây bệnh của tác nhân gây bệnh . - Quan sát bằng kính hiển vi điện hay kính hiển vi huỳnh quang, một vài phương pháp đặc biệt được sử dụng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Hình 2.1. Nguyên lý kỹ thuật IHC (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên) 28 II.2.3. Mẫu phân tích Mẫu sử dụng là mô hay dịch cơ thể còn tươi: thời gian chuẩn bị mẫu thường là khoảng 24 giờ. Sau đó mẫu được xử lý bằng một trong các phương pháp sau: Vết bôi/kính phết: vết bôi dùng cho xét nghiệm IHC phải được gởi đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị tiêu bản. Trường hợp lâu hơn 48 giờ thì mẫu phải được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng để kháng nguyên không bị hư. Thông tin chi tiết về việc chuẩn bị tiêu bản phải được sự hướng dẫn của phòng thí nghiêm nhận mẫu. Formalin: cố định mẫu (dày khoảng <1 cm) trong dung dịch đệm trung tính (10% formalin) và đúc khối bằng paraffin trong vòng < 1 tuần. Hoặc cố định 48 giờ trong formalin, sau đó bảo quản trong ethanol để có thể bảo quản mẫu cho việc phát hiện bằng phương pháp mô học hoặc phương pháp miễn dịch. Đông lạnh: ưu điểm của mẫu đông lạnh là tách được trường hợp liên kết chéo của một số kháng nguyên với formalin làm ảnh hưởng đến sự liên kết kháng nguyên-kháng thể. Tuy nhiên phương pháp đông lạnh làm giảm đi chi tiết về hình thái của mô và tế bào, đòi hỏi phải có phương pháp trữ đông đặc biệt cho IHC, giới hạn việc xác định tình trạng bệnh trước khi mô được trữ đông và thao tác thực hiện tiêu bản khó hơn so với tiêu bản bằng cách đúc khuôn parafin như trong phương pháp mô bệnh học. Phương thức trữ đông tốt nhất là sử dụng môi trường trữ mô chuyên biệt, để trong isopentane và đông lạnh bằng nitơ lỏng hay ở –70°C. II.2.4. Thao tác Có nhiều phương pháp IHC được sử dụng tuỳ theo mục đích phát hiện kháng nguyên chủ yếu dựa trên loại mẫu (vết bôi, đúc parafin hay đông lạnh), dạng mẫu vật để phát hiện bệnh và độ nhạy cần đạt được. Những thông tin cần có khi thực hiện IHC là: (i) cách cố định mẫu; (ii) thời gian cố định; (iii) những miêu tả đặc trưng về mẫu và (vi) loài. II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp II.2.5.1. Ưu điểm: - Nhận dạng những mầm bệnh khó có thể phát hiện bằng phương pháp mô học hay nhuộm truyền thống. - Xác định chính xác tác nhân gây bệnh dựa vào tính chuyên biệt của kháng thể đối với kháng nguyên. - Có thể giúp xác định một cách trực tiếp khả năng gây bệnh của mầm bệnh qua sự tương tác ở mức tế bào về mặt hình thái hoặc cấu tạo. 29 II.2.5.2. Nhược điểm: - Thời gian giữ mẫu trong formalin càng lâu sẽ càng dễ gây ra hiện tượng liên kết giữa các kháng nguyên tạo kết quả dương tính giả. - Đòi hỏi quá trình tạo ra kháng thể chuyên biệt, kiểm tra tính ổn định của phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên. - Một số kháng thể chỉ có thể cho phản ứng có hiệu quả với mẫu đông lạnh. - Kết quả âm tính hay dương tính giả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của mô được sử dụng, phương pháp và thời gian cố định, kinh nghiệm làm việc với kháng thể của người phân tích. II.3. KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT Những kỹ thuật nuôi vi sinh vật giúp cho việc chẩn đoán sơ bộ mầm bệnh vi sinh vật ở mức họ hoặc có khi đến mức giống. Trong trường hợp đòi hỏi phải có chẩn đoán xác định thì phải sử dụng những phương pháp định danh chuyên biệt tùy theo loài hoặc týp. Tuy nhiên hạn chế của phương pháp nuôi vi sinh vật trong chẩn đoán bệnh là thường dễ gặp trường hợp âm tính giả đối với một số mầm bệnh vi sinh đòi hỏi điều kiện nuôi cấy đặc biệt. Mặt khác vấn đề tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy rất dễ gây nên hiện tượng dương tính giả trong chẩn đoán. II.2.1. Nuôi vi khuẩn II.2.1.1. Ứng dụng Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh phẩm II.2.1.2. Phương pháp Phân lập và nuôi vi khuẩn bằng môi trường chọn lọc tùy theo dạng vi khuẩn được nuôi. Vi khuẩn thường được nuôi trong môi trường có chứa kháng sinh mà chúng kháng. Cách làm này vừa có thể giúp kiểm soát sự phát triển của chúng, theo dõi sự thay đổi khả năng kháng thuốc trong cùng một quần thể cũng như giúp xác định loại kháng sinh có hiệu lực với loài vi khuẩn đó. Một số môi trường chọn lọc thường được sử dụng nuôi mầm bệnh vi khuẩn ở thủy sản như: - Vibrio sp: TCBS - Aeromonas sp: aeromonas agar + ampicillin, rimler short agar, ampicillin-dextrin agar - Flexibacter sp: Cytophaga - Edwardsiella ictaluri: Edwardsiella ictaluri agar 30 II.2.1.3. Mẫu phân tích Cơ, gan, thận hay máu của sinh vật bị bệnh. Trong một số trường hợp bệnh phẩm thủy sản lở loét mẫu có thể được thu bằng cách dùnh gạc bông gòn lấy mẫu tại vết thương. Mẫu cũng có thể được thu từ dịch cơ thể của bệnh phẩm. II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh. Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và dễ bị tạp nhiễm với các mầm bệnh cơ hội II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật II.2.2.1. Ứng dụng Giúp đánh giá tình trạng nhiễm nguyên sinh động vật trên mẫu bệnh phẩm II.2.2.2. Phương pháp Nguyên sinh động vật được nuôi trên các dòng tế bào đặc biệt có bổ sung fetal bovine serum và kháng sinh như penicillin, streptomycin để tránh nhiễm khuẩn. II.2.2.3. Mẫu phân tích Mẫu ruột, phân, máu hay các mô cơ thể. Cách tốt nhất là rửa mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý có chứa kháng sinh để tránh nhiễm khuẩn, sau đó giữ trong tủ lạnh trước khi chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh. Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và sau khi thu mẫu phải được xử lý trong vòng 24 giờ II.2.3. Nuôi vi-rút II.2.3.1. Ứng dụng Việc nuôi vi-rút thường được sử dụng nhằm hỗ trợ cho các phép chẩn đoán nhiễm vi-rút. Việc phân lập vi-rút thường gắn với các xét nghiệm phân tử như PCR nên phương pháp thu mẫu cũng phải được thực hiện tùy theo vi-rút là DNA hay RNA vi-rút. 31 II.2.3.2. Phương pháp Vi-rút là sinh vật sống ký sinh bắt buộc nên việc nuôi vi-rút thường được thực hiện trên tế bào sống hoặc trong cơ thể sinh vật sống. Tế bào sống thường được nuôi trong đĩa petri hoặc trong lọ tiệt trùng. Mẫu được nghiền và sau đó cho vào môi trường nuôi cấy và nhiệt độ thích hợp để vi-rút phát triển. II.2.3.3. Mẫu phân tích Mẫu phải được thu vào thời điểm có bệnh bộc phát vì vi-rút có thể không còn hiện diện trên cơ thể vật chủ khoảng 2 ngày sau khi có thấy dấu hiệu bệnh lý. Tùy theo điều kiện thực tế mà mẫu có thể được vận chuyển sống, ướp nước đá, nước đá khô hoặc nitơ lỏng để chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu gởi đến phòng thí nghiệm phải kèm theo các thông tin về loại mẫu, loại vi-rút tình nghi bị nhiễm và thời gian quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý liên quan đến vi-rút đó. Mẫu được thu có thể là mẫu mô hoặc dung dịch trích từ mô trong điều kiện vô trùng, mẫu máu được thu với dung dịch chống đông. Điều kiện vận chuyển và lưu trữ mẫu tùy theo loại vi-rút và sẽ tùy theo phòng thí nghiệm phân tích hướng dẫn. Một số phòng thí nghiệm đòi hỏi mẫu phải được giữ trong môi trường có bổ sung protein và kháng sinh khi vận chuyển, mẫu phải được vận chuyển trong nước đá trong vòng 24 giờ, hoặc phải giữ lạnh ở 4°C nếu vận chuyển trong vòng 5 ngày. Trường hợp lâu hơn 5 ngày phải giữ mẫu ở -70°C, v.v…. II.2.3.4. Đọc kết quả Nhìn chung, việc phân lập vi-rút từ mô hay máu của vật chủ bị bệnh là đầy đủ làm chứng cứ cho sự nhiễm vi-rút. Tuy nhiên, vi-rút có thể tham gia như là mầm bệnh thứ cấp chứ không phải là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Điều cần thiết trong quá trình chẩn đoán là phải có cơ sở cho thấy vi-rút có liên quan đến sự tổn thương của cơ thể vật chủ hoặc vi-rút là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Việc này đòi hỏi những kỹ thuật có thể xác định vai trò gây bệnh của vi-rút như tế bào học hoặc mô bệnh học đi kèm theo bằng những phương pháp như IHC hay hiển vi điện tử. Cần phải ghi nhận rằng hiện tại qui trình PCR đã được phát triển đối với hầu hết vi-rút gây bệnh ở thủy sản giúp cho việc sàng lọc và xác định vi-rút mới khá hiệu quả. Tuy nhiên việc sử dụng PCR thuần túy để chẩn đoán bệnh cần phải được thận trọng khi xác nhận quan hệ giữa vi-rút và dấu hiệu bệnh lý. 32 II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II 1. Alday de Graindorge, V. and Flegel, T.W. (1999). Diagnosis of shrimp diseases with emphasis on black tiger prawn, Penaeus monodon. 2. Austin, B., and Austin, D. A. (999). Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and wild fish 3rd Edition 3. FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. Fisheries technical paper 402/2. 4. Forbes, B. A., Sahm, D. F., and Weissfeld, A. S. (2002). Laboratory methods in basic virology In: Diagnostic Microbiology. 11th edition. 5. Hirsh, D. C., MacLachlan, N. J., and Walker, R. L. (2004). Laboratory Diagnosis. In: Veterinary Microbiology 2nd edition. 6. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp. 7. Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment. 8. OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 9. Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải. (2002). Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi. 10. Tonguthai, K., Chinabut, S., Somsiri,T., Chanratchakool, P., and Kanchanakhan, S. (1999). Diagnostic Procedures for Finfish Diseases 11. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình bệnh học thủy sản. 33 CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi. III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH III.1.1. Nguyên lý Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường. Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu. Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá thừa kháng nguyên hoặc kháng thể. Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù hợp với kháng thể. Nguyên lý chung: kết tủa miễn dịch chỉ có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro. Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thể là do hình thành một mạng lưới ba chiều các phân tử kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng thể (Marrack, 1934) (hình 3.1). 34 Hình 3.1. Hiện tượng tủa với sự hình thành mạng lưới cân bằng Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện như sau: - Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị. - Kháng nguyên đa hóa trị - Kháng nguyên phải hòa tan và thành phần của môi trường như lực ion hay pH có vai trò nhất định trong việc làm xảy ra hiện tượng kết tủa. - Các kháng thể IgG chỉ có chứa 3% glucid là những chất gây tủa tốt nhất, còn kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hòa tan và ít kết tủa hơn. - Các phức hợp kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ kết tủa III.1.2. Ứng dụng Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật đơn giản giúp phát hiện kháng nguyên trong mẫu huyết thanh hay huyết tương bằng cách định tính hay định lượng. III.1.3. Mẫu phân tích Mẫu huyết thanh hay huyết tương. III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng Phương pháp Heideiberger và Kendall Phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi không, đó là do thay đổi tỷ lệ nồng độ tương đối giữa kháng thể và kháng nguyên. Trong một loạt ống thí nghiệm, cho đều cùng một lượng kháng thể không thay đổi. Sau đó cho vào kháng nguyên với nồng độ tăng dần. Kết quả là hiện tượng kết tủa sẽ tăng dần từ ống đầu và sau đó giảm đi (hình 3.2). Nếu đem ly tâm thì có thể lấy tủa và định lượng nitrogen của tủa trong từng ống. Nếu kháng nguyên không phải là protein thì lượng nitrogen tủa tỷ lệ với lượng kháng thể bị tủa. Nếu lấy ống có tủa nhiều nhất thì có thể xác định được lượng kháng thể có trong huyết thanh bởi vì trong ống ấy hơn 95% kháng thể đã bị tủa. Hơn nữa, nếu biết được lượng kháng nguyên đã cho vào mỗi ống và trọng lượng phân tử riêng của kháng nguyên và kháng thể thì người ta có thể tính ra công thức của phức hợp Sau khi ly tâm tách tủa, có thể lấy nước mặt rồi nếu cho thêm kháng nguyên vào những ống đầu và kháng thể vào những ống cuối thì vẫn có được tủa thêm. Điều này cho phép xác định được 3 khu vực: 35 - Trong những ống đầu là khu vực thừa kháng thể, nơi mà do thiếu kháng nguyên nên đã ngăn không cho kết tủa hết kháng thể. - Trong những ống cuối là khu vực thừa kháng nguyên nên cũng không cho phép hình thành mạng lưới 3 chiều. - Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương ở đó kháng nguyên và kháng thể có tỉ lệ nồng độ tối ưu cho phép tủa gần hết các phân tử kháng thể và kháng nguyên. Hình 3.2. Hiện tượng tủa trong môi trường lỏng Định lượng bằng đo độ đục Dùng một tia sáng mạnh đơn sắc cho đi qua ống nghiệm trong đó đã có trộn kháng nguyên với kháng huyết thanh tương ứng. Tia sáng sẽ càng bị khuếch xạ mạnh nếu tủa càng nhiều. Việc định lượng được tiến hành tại vùng có thừa kháng thể và nhờ việc đọc độ cản quang rồi so sánh với đường chuẩn. Việc sử dụng tia laser cho phép việc định lượng có giá trị cao. Kỹ thuật này có rất nhiều ứng dụng trong việc định lượng các kháng nguyên khác nhau mà nồng độ trong một môi trường sinh học trong khoảng mg/l như IgG, IgA, IgM…và trong việc tìm các kháng kháng thể. 36 III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel Nguyên lý Kháng thể cũng như kháng nguyên có thể khuếch tán trong thạch (gel) và khi gặp nhau thì gây tủa, tủa ấy không di chuyển và hiện lên trông thấy bằng mắt thường hoặc nhuộm. Miễn dịch khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Trong một lớp thạch không dày, đục thủng suốt những lỗ cách đều nhau, khoảng cách này phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của từng chất phản ứng. Rồi nhỏ vào trong mỗi lỗ đối diện với nhau một dung dịch kháng nguyên và kháng thể. Thời gian xuất hiện các đường cung tủa có thể là hai ngày đến một tuần. Hình 3.3. Khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Kỹ thuật này dù ít nhạy nhưng cho phép phân tích các hệ thống kháng nguyên- kháng thể. Muốn so sánh giữa hai kháng nguyên hay để phát hiện sự có mặt của nhiều kháng thể trong một huyết thanh thì có thể bố trí hai lô kháng nguyên trước một lỗ có chứa huyết thanh. Kết quả có thể: (i) Phản ứng giống hệt khi hai kháng nguyên y hệt nhau hay có epitop tương tự thì các đường kết tủa với kháng thể sẽ nối liền nhau; (ii) Phản ứng không y hệt nếu hai kháng nguyên khác nhau thì sẽ kết hợp riêng với hai kháng thể và hai đường kết tủa sẽ cắt chéo nhau hoặc (iii) Phản ứng giống một phần khi hai kháng nguyên có cùng một epitop và một epitop riêng khác nhau thì các kháng thể tương ứng sẽ cho một đường tủa chung liền với nhau và một đường tủa phụ gắn với đường tủa trước đối với kháng nguyên thứ hai (hình 3.3). Ngược lại, có thể dùng kỹ thuật này để so sánh với nhau hai kháng huyết thanh gây tủa để xem chúng có nhận biết cùng một kháng nguyên hay không. Kỹ thuật này rất hay được dùng để phát hiện các kháng thể chống nhân của một người so với một huyết thanh chuẩn. 37 Miễn dịch khuếch tán vòng (kỹ thuật Mancini) Kỹ thuật này dùng để định lượng kháng nguyên. Kháng thể đặc hiệu được hòa đều vào trong thạch trước khi đổ dãy thạch lên trên kính hay hộp petri. Sau đó, đục các lỗ và cho vào đó dung dịch kháng nguyên có độ pha loãng khác nhau. Kháng nguyên sẽ khuếch tán và gặp kháng thể ngay trong thạch và tạo nên những vòng kết tủa mà bề mặt của nó sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên. Việc định lượng được suy ra từ một đường biểu diễn chuẩn lập ra từ những nồng độ đã biết của kháng nguyên. III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện Miễn dịch khuếch tán điện đơn (kỹ thuật Laurell) Xuất phát từ nguyên lý của kỹ thuật khuếch tán vòng, kỹ thuật này chỉ khác ở chỗ là sự di chuyển của các kháng nguyên định lượng được thực hiện trong điện trường. Do đó vùng kết tủa có hình tên lửa (còn gọi là điện di tên lửa) (hình 3.4). Chiều dài của hình tên lửa tỷ lệ với nồng độ kháng nguyên. Kỹ thuật này nhạy hơn kỹ thuật Mancini nhưng dùng nhiều chất phản ứng hơn. Hình 3.4. Khuếch tán điện: 1,2,3 mẫu chuẩn; x: mẫu Miễn dịch điện di (kỹ thuật Grabar và Williams) Khi dung dịch định phân tích có chứa nhiều kháng nguyên thì khuếch tán kép không đủ để xác định mọi đường kết tủa. Miễn dịch điện di bổ sung thiếu sót ấy bằng cách tách trước các kháng nguyên theo tốc độ di chuyển của chúng trong điện trường rồi mới gây tủa bằng kháng huyết thanh đặc hiệu rải trong một rãnh đào sẵn dọc theo chiều điện di. Các đường tủa xuất hiện theo hình thức những cung ở hai bên rãnh. Kỹ thuật này chủ yếu được dùng để định tính, cho phép đánh giá có hiện tượng tủa hay không so với một đối chứng. Đây là một kỹ thuật tốt để xác định một Ig đơn dòng do tạo ra một cung tủa dày hơn, cong và gần rãnh hơn đồng thời nối liền với cung tủa của Ig huyết thanh cùng lớp. III.1.4.4. Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ Trong kỹ thuật này dịch sinh học định nghiên cứu được cho chạy điện di trước, sau đó cho tác dụng của kháng thể đặc hiệu ngay trên lớp thạch để hình thành kết tủa kháng nguyên- kháng thể. Như vậy, các thành phần của hỗn hơp phức tạp như huyết thanh được tách ra bằn điện di trong thạch. Sau đó, các phân tử khác nhau định nghiên cứu sẽ được tủa một cách chọn lọc bằng các kháng huyết thanh đặc hiệu với các ptotein đã di chuyển 38 ngay trên bề mặt của thạch. Kháng thể này nhanh chóng thấm vào bên trong gel của thạch và kết tủa tại chỗ kháng nguyên tương ứng. Những phân tử không bị kết tủa thì sẽ được rửa cho đến hết. Từ đó, dễ dàng nhuộm các phức hợp kháng nguyên- kháng thể và sẽ cho ra một hình ảnh chính xác của tình trạng phân bố kháng nguyên sau điện di. Kỹ thuật này rất nhanh và nhạy hơn kỹ thuật điện di để chuẩn đoán những bất thường đơn dòng của Ig. Nó có lợi hơn là kháng nguyên không có thời gian để khuếch tán trước khi bị kết tủa bởi kháng thể. Tính thuần nhất của một thành phần đơn dòng nào đó nếu có ở một lượng rất thấp thì cũng được bảo tồn trong kỹ thuật này. Sau cùng việc giải thích những hình ảnh thu được cũng dễ dàng hơn trong kỹ thuật miễn dịch điện di. III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp III.1.5.1. Ư u đi ểm: Kỹ thuật đơn giản III.1.5.2. Nhược điểm: Kháng nguyên muốn phát hiện phải ở dạng hòa tan thì mới có thể khuếch tán được. Mặt khác phương pháp này có tính nhạy không cao. III.2. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH III.2.1. Nguyên lý Hiện tượng ngưng kết là do cơ chế hình thành một mạng lưới giữa kháng nguyên và kháng thể cho phép một lượng các hạt ấy sáp lại với nhau để hình thành đám ngưng kết đủ to để mắt thường có thể nhìn thấy được. Mạng lưới chỉ có thể xuất hiện với các kháng thể có ít nhất là hai hóa trị. IgM với đến 10 vị trí kết hợp nên có khả năng ngưng kết mạnh hơn IgG. Nói chung các kháng nguyên hữu hình bao giờ cũng đa hóa trị cho nên không bị hạn chế. Ở phản ứng ngưng kết miễn dịch đòi hỏi kháng nguyên hữu hình. Đó là kháng nguyên có kích thước lớn như hồng cầu và tế bào vi sinh vật. Kháng nguyên hữu hình có epitop bề mặt có thể liên kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng mắt thường. Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết. Phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh. Cơ sở lí hóa của phản ứng ngưng kết: một hỗn hợp bao gồm những tiểu phần lơ lửng trong một dung môi. Các tiểu phần giữ được trạng thái. 39 III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết Người ta phân biệt thành ngưng kết chủ động hay trực tiếp trong đó hạt hữu hình đã có mang sẵn những nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tinh trùng, vi khuẩn và ngưng kết thụ động khi các hạt chỉ là chất trơ làm giá đỡ cho các quyết định kháng nguyên hòa tan đã được gắn một cách nhân tạo lên bề mặt của nó, trong đó thường dùng là hồng cầu đã xử lý bằng formol. III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp: Cho các hạt hữu hình có mang sẵn các nhóm quyết định kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Các kháng thể kết hợp với kháng nguyên gắn trên các hạt sẽ dẫn đến hình thành mạng lưới và ngưng kết. III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp: Kháng nguyên hòa tan được cố định trên những hạt khác nhau tùy theo typ phản ứng, sau đó hỗn hợp hạt sẽ được cho tiếp xúc với huyết thanh trong những điều kiện như ngưng kết trực tiếp. III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo: Khi kháng thể không phát huy được tác dụng trên hai vị trí trên, nghĩa là hiện tượng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể có xảy ra mà vẫn có hiện tượng ngưng kết. Coombs đã cho thêm kháng thể anti-globulin tạo một cầu nối giữa globulin miễn dịch đã có sẵn trên hạt theo hai hình thức sau: test coombs trực tiếp thử trên hồng cầu đã có gắn sẵn một cách tự nhiên các kháng thể không gây ngưng kết, khi cho thêm kháng thể anti-globulin vào thì sẽ gây ngưng kết; Test Coombs gián tiếp là một test huyết thanh cho phép tìm xem trong một huyết thanh có hay không có kháng thể chống hồng cầu nhưng không gây ngưng kết. Đầu tiên, ủ huyết thanh với một loại hồng cầu đã biết rõ nhóm. Sau đó, rửa sạch thì trên hồng cầu chỉ còn bám kháng thể trong huyết thanh cho nên khi thêm kháng thể anti- glubolin và nếu có ngưng kết thì có nghĩa là trong ấy có kháng thể định tìm (hình 3.5). Hình 3.5. Phương pháp test coombs trực tiếp vá gián tiếp 40 III.2.3. Ứng dụng Phát hiện kháng nguyên và đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với một kháng nguyên dạng hạt. Có 3 dạng thường gặp: - Ức chế sự ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination inhibition-HI): đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với vi-rút có chứa protein ngưng kết hồng cầu. - Ngưng kết vi khuẩn (Bacterial agglutination): xác định kháng thể huyết thanh được tạo ra để chống lại sự nhiễm khuẩn. - Ức chế ngưng kết (Agglutination inhibition): phát hiện một lượng nhỏ kháng thể chống lại một tác nhân gây bệnh nào đó . III.2.4. Mẫu phân tích Mẫu huyết tương hay huyết thanh III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp III.2.5.1. Ư u đi ểm: Kỹ thuật khá đơn giản III.2.5.2. Nhược điểm: Kháng nguyên của mầm bệnh muốn phát hiện phải ở dạng hạt. Mặt khác phương pháp này có tính nhạy không cao. III.3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG III.3.1. Nguyên lý Trong kỹ thuật này kháng thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Kỹ thuật dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc hiệu sẽ phát sáng. Chẳng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục, còn rodamin phát quang màu đỏ da cam. Kháng thể gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là kháng thể đánh dấu hoặc kháng thể huỳnh quang. 41 III.3.2. Phương pháp III.3.2.1. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Kỹ thuật chỉ có hai thành phần: Kháng nguyên và kháng thể, tạo ra hai lớp của phản ứng. Một trong hai thành phần được gắn trực tiếp với thuốc nhuộm huỳnh quang. Đầu tiên người ta cố định vi khuẩn trên lam kính sau đó phủ kháng thể huỳnh quang lên để kháng thể gắn với tế bào vi khuẩn. Rửa loại bỏ kháng thể thừa rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Chỉ có các vi khuẩn đặc hiệu với kháng thể huỳnh quang mới được quan sát (hình 3.6). Hình 3.6. Kháng thể huỳnh quang và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp III.3.2.2. Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp Kỹ thuật này ngoài hai thành phần chính là kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu tạo ra hai lớp của phản ứng còn có một thành phần nữa được gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang, tạo lớp thứ ba là kháng- kháng thể (hì