Giáo trình Sinh học phân tử

a cho chúng tăng. Cơ chế chính xác của hiện tượng này chưa rõ ràng, nhưng có thể xảy ra theo hai cách: - Trao đổi chéo không cân bằng giữa hai nhiễm sắc tử (chromatid) của nhiễm sắc thể dẫn đến một số tế bào không có gen dhfr và một số khác có hai bản sao của gen này. Trong môi trường có độc tố, trao đổi chéo không cân bằng được lặp đi lặp lại và các tế bào chứa nhiều gen dhfr vẫn phát triển tốt trong môi trường này. - Các đoạn DNA (100-1.000 kb) chứa 2-4 gen dhfr (~31 kb/gen) được sao chép từ nhiễm sắc thể bình thường tạo ra các nhiễm sắc thể rất nhỏ, không có tâm động. Các nhiễm sắc thể nhỏ này ghép vào các nhiễm sắc thể bình thường khác. Quá trình này lặp đi lặp lại và qua một số lần phân bào nguyên nhiễm, tế bào nào mang số lượng lớn các gen dhfr càng có điều kiện phát triển thuận lợi trong môi trường có chứa độc tố. 3. Biến nạp gen Một phương thức tăng khả năng di truyền là ứng dụng các tương tác vật chủ cộng sinh-ký sinh, trong đó DNA lạ được chuyển vào tế bào vật chủ từ một vi khuẩn. Cơ chế này tương tự với sự tiếp hợp của vi khuẩn. Sự biểu hiện của DNA vi khuẩn trong vật chủ mới của nó sẽ làm thay đổi kiểu hình Sinh học phân tử 56 của tế bào. Ví dụ điển hình là vi khuẩn A. tumefaciens cảm ứng tạo khối u ở tế bào thực vật bị chúng xâm nhiễm. Khi DNA lạ được đưa vào tế bào eukaryote, nó có thể tồn tại ngoài nhiễm sắc thể hoặc được hợp nhất trong genome. Nếu xảy ra theo trường hợp thứ hai, genome sẽ mang những đột biến di truyền và nhiều khi DNA lạ vẫn tiếp tục hoạt động làm xuất hiện các tính trạng mới. Việc đưa các gen lạ vào tế bào soma hoặc tế bào sinh dục mà vẫn duy trì hoạt động của những gen đó được gọi là chuyển nhiễm (transfection). Cá thể biểu hiện tính trạng mới nhờ hoạt động của gen lạ đưa vào tế bào sinh dục được gọi là cá thể chuyển gen. Quá trình này có thể làm thay đổi sự ổn định của genome. DNA sau khi được tiêm vào trong các tế bào trứng động vật có thể được hợp nhất trong genome và truyền cho thế hệ sau như một thành phần di truyền bình thường. Khả năng đưa một gen chức năng đặc trưng có thể trở thành một kỹ thuật y học sử dụng cho việc chữa bệnh di truyền. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Võ Thị Thương Lan. 2002. Sinh học phân tử. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội. 2. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and Watson JD. 2002. Molecular Biology of the Cell. 3 rd ed. Garland Publishing, Inc. New York, USA. 3. Cantor CR and Smith CL. 1999. Genomics. John Wiley & Sons, Inc. New York, USA. 4. Dale JW and Von Schanzt M. 2002. From Gene to Genome. John Wiley & Sons, Ltd. West Sussex, UK. 5. Lewin B. 2000. Gene VII. Oxford University Press, Oxford, UK. 6. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL and Darnell J. 2004. Molecular Cell Biology. 5 th ed. WH Freeman and Company, New York, USA. 7. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M and Loscik R. 2004. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin Cummings/Cold Spring Habor Laboratory Press, San Francisco, CA, USA. 8. Weaver RF. 2003. Molecular Biology. 2 nd ed. McGraw-Hill Company Inc. New York, USA. Sinh học phân tử 57 Chương 3 Cấu trúc và chức năng của gen I. Định nghĩa gen Chúng ta có thể điểm qua những mốc chính trong lịch sử nghiên cứu về gen như sau: Mendel (1865) là người đầu tiên đưa ra khái niệm nhân tố di truyền. Johansen (1909) đã đề xuất thuật ngữ gen (từ genos, nghĩa là sản sinh, nguồn gốc) để chỉ nhân tố di truyền xác định một tính trạng nào đó. Sau đó, Morgan trong những năm 1920 đã cụ thể hóa khái niệm về gen, khẳng định nó nằm trên nhiễm sắc thể và chiếm một locus nhất định, gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng. Vào những năm 1940, Beadle và Tatum đã chứng minh gen kiểm tra các phản ứng hóa sinh và nêu giả thuyết một gen-một enzyme. Tuy nhiên, trường hợp hemoglobin là một protein nhưng lại gồm hai chuỗi polypeptide do hai gen xác định, do đó giả thuyết trên buộc phải điều chỉnh lại là một gen-một polypeptide. Vào những năm 1950, DNA (deoxyribonucleic acid) được chứng minh là vật chất di truyền. Mô hình cấu trúc DNA của Watson và Crick được đưa ra và lý thuyết trung tâm (central dogma) ra đời. Gen được xem là một đoạn DNA trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một polypeptide hay RNA. Cuối những năm 1970, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở sinh vật eukaryote cho thấy có những đoạn DNA không mã hóa cho các amino acid trên phân tử protein. Vì thế, khái niệm về gen lại được chỉnh lý một lần nữa: Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide, nó bao gồm cả phần phía trước là vùng 5’ không dịch mã (5’ untranslation) hay còn gọi là vùng ngược hướng (upstream) và phía sau là vùng 3’ không dịch mã (3’ untranslation) hay còn gọi là vùng cùng hướng (downstream) của vùng mã hóa cho protein, và bao gồm cả những đoạn không mã hóa (intron) xen giữa các đoạn mã hóa (exon). Hiện nay, có thể định nghĩa gen một cách tổng quát như sau: Gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền chiếm một locus nhất định trên Sinh học phân tử 58 nhiễm sắc thể và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật chất di truyền mã hóa cho những sản phẩm riêng lẻ như các mRNA được sử dụng trực tiếp cho tổng hợp các enzyme, các protein cấu trúc hay các chuỗi polypeptide để gắn lại tạo ra protein có hoạt tính sinh học. Ngoài ra, gen còn mã hóa cho các tRNA, rRNA và snRNA... Bảng 3.1. Tóm tắt lịch sử nghiên cứu về di truyền học Mốc thời gian Năm Các sự kiện chính 1850 1865 Gen là các nhân tố hạt 1871 Khám phá ra nucleic acid 1900 1903 Nhiễm sắc thể là các đơn vị di truyền 1910 Gen nằm trên nhiễm sắc thể 1913 Nhiễm sắc thể là các dãy sắp xếp mạch thẳng của gen 1927 Đột biến là những thay đổi vật lý của gen 1931 Sự tái tổ hợp xuất hiện bởi hiện tượng vắt chéo 1944 DNA là vật liệu di truyền 1945 Gen mã hóa cho protein 1950 1951 Trình tự protein đầu tiên 1953 DNA có dạng xoắn kép 1958 DNA tái bản theo phương thức bán bảo thủ 1961 Mã di truyền là bộ ba 1977 Các gen của sinh vật eukaryote bị gián đoạn 1977 DNA có thể được phân tích trình tự 1995 Genome của vi khuẩn được phân tích trình tự 2000 2001 Genome người được phân tích trình tự Sinh học phân tử 59 II. Lý thuyết trung tâm 1. Sự xác định di truyền cấu trúc bậc một của protein Cấu trúc không gian của chuỗi polypeptide được xác định bởi trình tự sắp xếp của các amino acid tức cấu trúc bậc một. Như vậy, mặc dù có nhiều mức độ cấu trúc không gian khác nhau, nhưng cấu trúc bậc một tức trình tự sắp xếp các amino acid chi phối toàn bộ các mức độ cấu trúc khác. Việc xác định di truyền phân tử protein ở trạng thái tự nhiên có đầy đủ hoạt tính sinh học chỉ quy tụ lại chủ yếu ở xác định cấu trúc bậc một là đủ. 2. Các enzyme mất hoạt tính do đột biến Nhiều nghiên cứu cho thấy, việc mất hoạt tính enzyme nhiều khi không phải do vắng mặt của enzyme, mà chỉ do các biến đổi trên phân tử (modification). Có trường hợp đột biến dẫn đến những thay đổi tinh vi, enzyme vẫn có hoạt tính nhưng sẽ biểu hiện khác nếu thay đổi điều kiện. Chẳng hạn: Ở nấm mốc Neurospora crassa, enzyme tyrosinase do gen T xác định, xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tyrosine thành dihydroxyphenylalanine. Alelle T + của dòng hoang dại sản xuất tyrosinase có hoạt tính ở nhiệt độ bình thường và cả ở 60oC. Một đột biến TS sản xuất tyrosine có hoạt tính ở nhiệt độ bình thường, nhưng lại mất hoạt tính ở 60oC. Như vậy, trong đa số trường hợp, đột biến của một gen không làm biến mất enzyme mà chỉ biến đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi hoạt tính. Các đột biến của cùng một gen có thể gây ra những biến đổi khác nhau trên enzyme. Các hiện tượng đó chứng tỏ rằng cấu trúc của enzyme chịu sự kiểm soát trực tiếp của gen. 3. Bản chất các biến đổi di truyền của protein Bản chất đó chính là quan hệ một gen-một polypeptide. Như đã nêu trên, người ta khám phá ở người có những gen tạo ra hemoglobin (Hb) khi biến dị sẽ tạo ra những hemoglobin bất thường do sai hỏng ở các chuỗi polypeptide α hoặc β (Bảng 3.2 và 3.3) và gây ra các bệnh di truyền. Sinh học phân tử 60 Bảng 3.2. Các loại hemoglobin ở chuỗi polypeptide α Thứ tự amino acid 1 2 16 57 58 68 116 141 Tên amino acid Val Leu Lys Glu His Asp Glu Arg Loại hemoglobin Hb I Asp Hb Nocfolk Asp Hb M Boston Tyr Hb B Philadelphia Lys Hb O Indonesia Lys Ở trường hợp này, thứ tự các amino acid có thể bị sai lệch. Từ những dữ liệu trên ta thấy các dạng đột biến tạo một Hb bất thường đó là thay một amino acid này bằng một amino acid khác. Bảng 3.3. Các loại hemoglobin ở chuỗi polypeptide β Thứ tự amino acid 1 2 3 6 26 67 121 146 Tên amino acid Val His Leu Glu Glu Val Glu His Loại hemoglobin Hb S Val Hb C Lys Hb E Lys Hb M Minvauki Glu Hb O Ả Rập Lys Qua hai chuỗi polypeptide α và β chúng ta thấy có một số dạng hemoglobin bất thường ở người. Trên mỗi chuỗi, chỉ trình bày những amino acid đã bị thay đổi ở dạng đột biến. Số thứ tự chỉ vị trí của amino acid trong chuỗi polypeptide. Mỗi hemoglobin bất thường có thể được đặt cho một chữ cùng tên (nếu có) của địa phương được tìm thấy. Sinh học phân tử 61 Đột biến được biểu hiện bởi sự thay thế vị trí của một amino acid này bằng một amino acid khác. 4. Sự tương quan đồng tuyến tính gen-polypeptide 4.1. Đột biến tryptophan synthetase-sự đồng tuyến tính giữa gen và chuỗi polypeptide Nghiên cứu trên enzyme tryptophan synthetase xúc tác cho phản ứng tổng hợp tryptophan của E. coli người ta nhận thấy có nhiều đột biến xảy ra trên cùng một gen mã hóa cho tryptophan synthetase. Thực hiện tái tổ hợp trong gen (nguyên tắc là gen ở các vị trí càng xa nhau trên nhiễm sắc thể càng dễ tái tổ hợp), người ta đã nhận được các dạng biến dị có tính chất khác nhau, và tính được khoảng cách tương đối giữa những điểm khác nhau của đột biến đã được xác định. Vị trí biến dị trên thể nhiễm sắc tương ứng với vị trí của amino acid trên chuỗi polypeptide. Như vậy, có thể cho rằng có sự đồng tuyến tính giữa gen và chuỗi polypeptide (Hình 3.1). Hình 3.1. Tương quan đồng tuyến tính giữa gen và enzyme tryptophan synthetase của E. coli thông qua các vị trí đột biến và các gốc amino acid bị thay đổi Nhiều dạng đột biến của tryptophan synthethase đã được tạo ra. Bằng cơ chế tái tổ hợp, những khoảng cách tương đối giữa những điểm khác nhau STOP Leu Val Gln Met Cys Arg Ile Arg Glu Val Cys Asp Leu STOP Lys Phe Glu Tyr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gln 1 15 22 49 175 177 183 211 213 234 235 243 268 Các vị trí của đột biến trên DNA Các gốc amino acid bị thay đổi +H3N COO - Sinh học phân tử 62 của đột biến đã được xác định. Sản phẩm protein của mỗi dạng đột biến đã được phân tích, và những thay đổi các amino acid khác cũng được xác định. Người ta đã tìm thấy mối tương quan hoàn toàn giữa những khoảng cách của các đột biến được tìm thấy trên gen với khoảng cách của amino acid bị thay đổi trong phân tử protein. 4.2. Đột biến 4.2.1. Khái niệm Một gen (DNA) có 4 loại base và một phân tử protein có 20 loại amino acid 1 , nhưng giữa chúng có mối tương quan như thế nào. Đầu tiên, người ta cho rằng một base qui định một amino acid, nhưng những tính toán cho thấy không hợp lý. Vì chỉ có 4 base trong DNA và 20 amino acid trong protein, cho nên mỗi codon phải chứa ít nhất 3 base. Hai base cũng không thể làm thành một codon bởi vì chỉ có 42 = 16 cặp hợp lý của 4 base. Nhưng 3 base thì có thể bởi vì sẽ có 43 = 64 bộ ba hợp lý. Vì số lượng bộ ba hợp lý lớn hơn 20, cho nên sẽ có trường hợp một vài codon chỉ định cùng một amino acid. Ví dụ: UCU, UCC, UCA, UCG, AGU và AGC đều cùng mã hóa cho serine. Từ đó, người ta đưa ra khái niệm mã di truyền (tín hiệu di truyền). Mã di truyền cho phép đọc thứ tự trên DNA để biết thứ tự trên chuỗi polypeptide. Mã di truyền không mơ hồ, có nghĩa với một trình tự chẳng hạn ATA ta biết nó ghi mã cho một amino acid gì, và cũng thấy rằng có nhiều mã di truyền xác định cho một amino acid (Bảng 3.4). 4.2.2. Đột biến điểm Là đột biến chỉ tác động một vị trí, nói rõ hơn đó là một base. Khi thay đổi một base trên DNA sẽ tạo ra sự thay đổi một amino acid (Hình 3.2). 1 Hai mươi amino acid được tìm thấy trong các phân tử protein là: Alanine (Ala), Arginine (Arg), Asparagine (Asn), Aspartic acid (Asp), Cysteine (Cys), Glutamic acid (Glu), Glutamine (Gln), Glycine (Gly), Histidine (His), Isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) và Valine (Val). Sinh học phân tử 63 Đột biến dĩ nhiên xảy ra trên DNA và được sao lại trên mRNA trong phiên mã, rồi trên protein trong dịch mã. Bảng 3.4. Mã di truyền chung Vị trí thứ nhất Vị trí thứ hai Vị trí thứ ba U C A G U Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) U U Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) C U Leu (L) Ser (S) STOP STOP A U Leu (L) Ser (S) STOP Trp (W) G C Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) U C Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) C C Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) A C Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) G A Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) U A Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) C A Ile (I) Thr (T) Lys (K) Arg (R) A A Met (M) Thr (T) Lys (K) Arg (R) G G Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) U G Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) C G Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) A G Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) G Chú thích Những đơn vị mã (codon) được đọc theo chiều 5’ 3’. STOP: codon kết thúc (còn gọi là vô nghĩa). Sinh học phân tử 64 Đột biến điểm có các dạng sau: - Đột biến sai nghĩa. Thay đổi một amino acid trong protein, có thể dẫn đến một trong ba kết quả sau: + Không hậu quả nào cả, vì amino acid không nằm trong vị trí hoạt động hoặc không có vai trò trong cấu trúc enzyme. + Có biến đổi nhẹ ở chuỗi polypeptide sẽ tạo ra tính mẫn cảm yếu với nhiệt, làm giảm sự ổn định chuỗi polypeptide. + Mất hẳn hoạt tính enzyme nếu đúng ngay vị trí hoạt động của enzyme đó. - Đột biến vô nghĩa. Thay đổi một base. Nếu đó là một codon vô nghĩa sẽ làm ngừng kéo dài (tổng hợp) chuỗi polypeptide ở vị trí amino acid này. Tức là nếu codon này nằm ở đầu sẽ không có chuỗi polypeptide hoạt động. - Đột biến acridine hoặc đột biến dịch khung. Đột biến này do chất acridine màu da cam tạo ra (hoặc còn gọi là đột biến dịch khung, frameshift, do thêm vào hoặc bớt đi một base) (Hình 3.2 E và D). Như vậy, một đột biến trên khung đọc khi thêm vào (C) hoặc mất đi (A) thường sẽ dẫn đến xuất hiện một codon stop làm ngừng chuỗi polypeptide và enzyme sẽ không có hoạt tính. 4.2.3. Đột biến kìm hãm Đến nay, người ta nhận thấy mọi sai lệch trong việc tổng hợp protein nếu có đều xảy ra từ DNA, còn quá trình diễn ra từ RNA đến polypeptide luôn luôn đúng. Nghiên cứu một vài kiểu protein đột biến ta thấy: - Đột biến sai nghĩa. Làm xuất hiện một bất thường trong trình tự amino acid. Kết quả protein mất hoạt tính. Hoạt tính này có thể được phục hồi, hoặc do một đột biến ngược để cho lại protein cấu trúc ban đầu. - Đột biến vô nghĩa. Làm mất đi một phần chuỗi polypeptide, phần còn lại không có hoạt tính, và hoạt tính này có thể có lại được nhờ đột biến trong một codon đã bị đột biến. Thông thường, những gen kìm hãm đột biến vô nghĩa không nằm ở gần vị trí của đột biến ấy. Đó là những gen làm biến đổi hệ thống dịch mã khi tổng hợp protein. Sinh học phân tử 65 A AUG ACU CGG AAG UCA CUA ACG AUU AGG CUU UAC ... Met Thr Arg Lys Ser Leu Thr Ileu Arg Leu Tyr ... B AUG ACU AGG AAG UCA CUA ACG AUU AGG CUU UAC ... Met Thr Pro Lys Ser Leu Thr Ileu Arg Leu Tyr ... C AUG ACU CGG AAG UGA CUA ACG AUU AGG CUU UAC ... Met Thr Arg Lys Kết thúc D AUG ACU CGG ACA GUG ACU AAC GAU UAG GCU UUA ... Met Thr Arg Thr Val Thr Asp Asp Kết thúc E AUG ACU CGG AGU GAC UAA CGA UUA GGC UUU AC ... Met Thr Arg Ser His Kết thúc Hình 3.2. Các dạng đột biến điểm A: trình tự các codon và các amino acid tương ứng ở dạng tự nhiên. B: thay đổi một base (C thành A) làm thay đổi một amino acid (Arg thành Pro) gây nên đột biến sai nghĩa. C: thay đổi một base (C thành G) sinh ra một codon vô nghĩa (UGA). D: thêm một base (C) gây nên đột biến acridine hoặc đột biến dịch khung, có sự dời khung đọc. E: mất một base (A), gây nên đột biến acridine, chấm dứt đọc. 5. Lý thuyết trung tâm của sinh học phân tử Tổng hợp protein trong tế bào có các đặc điểm sau: - Các phân tử thông tin như nucleic acid và protein được tổng hợp theo khuôn. Tổng hợp theo khuôn vừa chính xác vừa ít tốn enzyme. Tuy Sinh học phân tử 66 nhiên, căn cứ vào hàng loạt tính chất hóa học các protein không thể làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp của chính chúng. Vì vậy, khuôn mẫu để tổng hợp nên protein không phải là protein. - Sinh tổng hợp protein tách rời về không gian với chỗ chứa DNA. Nhiều nghiên cứu cho thấy tổng hợp protein có thể xảy ra khi không có mặt DNA. Sự kiện này thể hiện rõ ràng nhất ở những tế bào eukaryote. Trong những tế bào này, hầu như toàn bộ DNA tập trung ở nhiễm sắc thể trong nhân, còn tổng hợp protein chủ yếu diễn ra ở tế bào chất. Tảo xanh đơn bào Acetabularia khi bị cắt mất phần chứa nhân vẫn tổng hợp được protein và sống vài tháng nhưng mất khả năng sinh sản. Rõ ràng, nơi chứa DNA mang thông tin di truyền và chỗ sinh tổng hợp protein tách rời nhau về không gian. - DNA không phải là khuôn mẫu trực tiếp để tổng hợp protein, do đó phải có chất trung gian chuyển thông tin từ DNA ra tế bào chất và làm khuôn để tổng hợp protein. Chất đó phải có cả trong nhân và tế bào chất với số lượng phụ thuộc vào mức độ tổng hợp protein. - Chất trung gian đó được xem chính là RNA nhờ các đặc điểm sau: + RNA được tổng hợp ngay ở trong nhân có chứa DNA, sau đó nó đi vào tế bào chất cho tổng hợp protein. + Những tế bào giàu RNA tổng hợp protein nhiều hơn. + Về phương diện hóa học RNA gần giống DNA: chuỗi polyribo- nucleotide thẳng cũng chứa 4 loại ribonucleotide A, G, C và uracil (U). Nó có thể nhận được thông tin từ DNA qua bắt cặp bổ sung. Nói chung, trong tế bào không thể tìm thấy chất nào khác ngoài RNA có thể đóng vai trò trung gian cho tổng hợp protein. Mối quan hệ này chính là thông tin di truyền đi từ DNA qua RNA rồi đến protein và được biểu diễn ở hình 3.3. Mối quan hệ này còn được gọi là lý thuyết trung tâm (central dogma), được Crick đưa ra từ 1956 đến nay về căn bản vẫn đúng. Vào những năm 1970, người ta đã phát hiện quá trình phiên mã ngược từ RNA tổng hợp nên DNA nhờ enzyme reverse transcriptase. Đến nay, việc sao chép (tổng hợp) RNA trên khuôn mẫu RNA cũng đã được chứng minh ở nhiều loại virus. Ngoài ra, thông tin từ protein cũng có thể được truyền sang protein (prion của bệnh bò điên). Riêng dòng thông tin từ protein ngược về mRNA/DNA thì chưa được tìm thấy (Hình 3.4). Sinh học phân tử 67 Hình 3.3. Lý thuyết trung tâm của Crick Hình 3.4. Những bổ sung mới vào lý thuyết trung tâm của Crick 6. DNA và mã di truyền Chúng ta đã biết có sự liên quan đồng tuyến tính giữa DNA và phân tử protein, từ đó dễ dàng dự đoán rằng trình tự đặc hiệu của các amino acid trên phân tử protein sẽ được mã hóa bằng nhóm các nucleotide trên phân tử DNA. Có tất cả 4 loại base, nếu các base có nhóm đôi tức 2 nucleotide mã hóa cho một loại amino acid thì tất cả chỉ có 16 tổ hợp, không đủ cho 20 loại amino acid. Như vậy, đơn vị mã hóa (codon) phải gồm 3 nucleotide (xem phần 4.2). Vấn đề tiếp theo là xác định chính xác các codon nào mã hóa cho từng amino acid. Nirenberg và Matthaei đã sử dụng enzyme để tổng hợp nhân tạo RNA. Khi dùng chỉ một loại nucleotide là U sẽ nhận được RNA là poly(U), nếu chỉ dùng A sẽ nhận được poly(A). Năm 1961, Nirenberg và Matthaei đã dùng poly(U) thay cho khuôn mẫu mRNA để tổng hợp protein trong hệ thống vô bào (có amino acid, enzyme tổng hợp protein, nhưng không có DNA...), sản phẩm thu được là chuỗi polypeptide polyphenylalanine chỉ chứa một loại amino acid là phenylalanine. Điều đó chứng tỏ codon UUU mã hóa cho phenylalanine. Đây là codon đầu tiên được xác định. Sau đó, họ cũng chứng minh được rằng AAA mã hóa cho lysine, GGG cho glycine và CCC cho proline. mRNA Protein Phiên mã Dịch mã DNA Sao chép Phiên mã ngược ? (virus) (prion) mRNA Protein Phiên mã Dịch mã DNA Sao chép Sinh học phân tử 68 Năm 1964, Khorana tìm ra phương pháp tổng hợp mRNA nhân tạo với trình tự lặp lại (như AAG AAG AAG...) và nhờ nó giải quyết xong các vấn đề còn chưa rõ ràng. Bảng mã di truyền (Bảng 3.4) cho thấy trong 64 codon, có 3 codon UAA, UAG, UGA không mã hóa cho amino acid được gọi là vô nghĩa (non- sense), đồng thời là codon kết thúc (termination) tức dấu chấm câu, chấm dứt chuỗi polypeptide. Mã di truyền có tính suy biến (degeneration) tức một amino acid có nhiều codon mã hóa, chỉ trừ methionine và tryptophane chỉ có một codon (tương ứng là ATG và TGG). Các codon đồng nghĩa tức mã hóa cho cùng một amino acid thường có hai base đầu tiên giống nhau, nhưng khác nhau ở cái thứ ba. Ví dụ: CCU, CCC, CCA và CCG tất cả đều mã hóa cho proline. Trên thực tế, U và C luôn luôn tương đương nhau ở vị trí thứ ba, còn A và G tương đương nhau trong 14 trên 16 trường hợp. Trừ một số ngoại lệ, mã di truyền có tính phổ biến (universal) tức toàn bộ thế giới sinh vật có chung bộ mã di truyền. III. Cấu trúc và chức năng của gen Khi nghiên cứu các quy luật di truyền Mendel và học thuyết di truyền nhiễm sắc thể, gen được quan niệm như một điểm trên nhiễm sắc thể, vừa là đơn vị chức năng xác định một tính trạng, vừa là đơn vị đột biến, vừa là đơn vị tái tổ hợp. Cùng với sự phát triển của di truyền học, khái niệm về gen được cụ thể hóa thêm, cấu trúc và chức năng của gen được hiểu chi tiết hơn. 1. Cấu trúc gen Một gen thường được xem gồm có hai phần, phần mang mã di truyền được phiên mã sang phân tử mRNA và phần DNA làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen (Hình 3.5). Cả hai phần đều có cấu trúc cơ bản khá giống nhau ở mọi sinh vật prokaryote và eukaryote. Tuy nhiên, gen eukaryote còn có cấu trúc đặc thù liên quan đến các cơ chế kiểm soát khác nhau đối với hoạt động của gen. Cấu trúc một gen điển hình nói chung đều có promoter, vị trí để RNA polymerase hoạt động khởi đầu phiên mã. Đôi khi nằm rất xa gen, có thể thấy các enhancer (vùng tăng cường) hoặc silencer (vùng ức chế) có vai trò Sinh học phân tử 69 liên quan đến quá trình phiên mã. Độ dài của một gen thay đổi tùy theo số lượng và độ dài của các intron chứa trong nó. Hình 3.5. Cấu trúc chung của một gen Vùng DNA mang mã di truyền sẽ được phiên mã sang phân tử mRNA. Quá trình này thực hiện theo chiều 5’ 3’ trên sợi mRNA đang được tổng hợp. Không phải mọi phiên mã di truyền trên phân tử mRNA đều được dịch mã sang phân tử protein. Hai đầu 5’ và 3’ của phân tử mRNA gồm một số nucleotide không được dịch mã mà lại liên quan đến tính bền vững của phân tử mRNA hoặc tham gia kiểm soát quá trình dịch mã. Hai đoạn này gọi là vùng không dịch mã 5’ và 3’ (untranslated region). Vùng không dịch mã 5’ nằm trước điểm khởi đầu dịch mã (3 nucleotide AUG mã hóa cho methionine đầu tiên của chuỗi polypeptide) và vùng không dịch mã 3’ nằm sau điểm kết thúc dịch mã (stop codon có thể là UAA, UGA và UAG). Do tế bào prokaryote không có cấu trúc nhân nên quá trình phiên mã (tổng hợp mRNA) và dịch mã (tổng hợp protein) xảy ra đồng thời. Còn phân tử mRNA của eukaryote được phiên mã trong nhân, sau đó phải cắt bỏ intron và gắn các exon lại, chịu biến đổi tại các đầu 5’ và 3’ trước khi vận chuyển ra ngoài tế bào chất để dùng làm khuôn mẫu tổng hợp protein. Hoạt động của một gen được đánh giá thông qua quá trình phiên mã (tổng hợp mRNA) và quá trình dịch mã (tổng hợp protein). Hoạt động này được kiểm soát rất chặt chẽ bằng các cơ chế khác nhau ở mọi giai đoạn, như bắt đầu và kết thúc phiên mã, quá trình biến đổi mRNA, quyết định tính bền vững và kiểm tra lại thông tin di truyền trên các phân tử này... Do cấu trúc Vùng 5’ ngược hướng Đơn vị phiên mã Vùng 3’ cùng hướng Vùng promoter Các exon Chuỗi 5’ Các intron Chuỗi 3’ không mã hóa không mã hóa Các enhancer Hộp CCAAT Hộp TATA Các enhancer Sinh học phân tử 70 sắp xếp các gen prokaryote khác với gen eukaryote nên sự phối hợp giữa các cơ chế điều khiển mang tính chất riêng biệt cho từng loại genome. Các gen prokaryote thường sắp xếp nằm gần nhau và chịu sự điều khiển chung của một promoter, tức là chúng được phiên mã sang cùng một phân tử mRNA. Cấu trúc này được gọi là operon. Như vậy, một operon gồm hai hay nhiều gen nằm cạnh nhau trên một nhiễm sắc thể. Thông thường, đó là các gen cùng tham gia vào một con đường chuyển hóa, ví dụ như các gen mã hóa cho các enzyme cần thiết cho quá trình chuyển hóa glucose. Do có chung promoter điều khiể