Giáo trình Sinh lý sinh sản gia súc

khỏe, sinh lý của mỗi cá thể khác nhau). - Kỹ thuật lấy tinh Khi lấy tinh nếu điều kiện cần và đủ cho gia súc xuất tinh đảm bảo, gia súc xuất tinh thoải mái thì tinh dịch sẽ thu được nhiều và ngược lại. Khi theo dõi về khoảng cách lấy tinh lợn, kết quả thu được như sau: + 4-5 ngày lấy tinh một lần: V = 150-200ml + 2-3 ngày lấy tinh một lần: V = 60-100ml + Hằng ngày lấy tinh: V = 50-60ml + 1 ngày lấy tinh 2 lần: V = 20-50ml Trong khi thụ tinh, nếu có những tác nhân kích thích khác thường, đều làm giảm hoặc không có lượng xuất tinh. Ví du: khi lấy tinh lợn bằng âm đạo giả mà nước quá nóng (ôn độ trong lòng âm đạo giả trên 450C) hoặc quá nguội (dưới 350C), áp lực trong lòng âm đạo giả quá cao hoặc quá thấp... Hoặc khi lấy tinh bằng tay nếu cầm nắm chắc dương vật quá chặt hoặc quá lỏng lẻo... cũng ảnh hưởng đến qúa trình xuất tinh của lợn. - Thời tiết, mùa vụ 84 Điều kiện thời tiết khí hậu và mùa vụ cũng ảnh hưởng đến thể tích tinh dịch. Trong điều kiện Việt nam, chúng ta thấy vào vụ đông xuân thì lượng tinh dịch thường cao hơn vụ hè thu. - Điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng Đây là yếu tố rất quan trọng, nó ảnh hưởng rất lớn đến lượng tinh dịch. Vì vậy trong quá trình chăm sóc nuôi dưỡng ta cần chú ý đến các chế độ ăn uống, vận động, tắm chải... 1.2. Màu sắc tinh dịch Màu sắc tinh dịch quyết định bởi nồng độ của tinh trùng và các hạt lipoit có trong tinh dịch. Xác định được màu của tinh dịch ta có thể sơ bộ biết được phẩm chất của tinh dịch, màu sắc càng đậm thì nồng độ tinh trùng càng cao. 1.2.1. Màu bình thường Màu sắc của tinh dịch tùy thuộc vào từng loại gia súc. Bảng 11. Màu tinh dịch của các loài gia súc Loài gia súc Màu của tinh dịch Ngựa Trắng xám Bò Kem sữa Cừu Kem Lợn Trắng xám Chó Trắng xám 1.2.2. Màu khác thường + Màu đỏ có thể là do lẫn máu (khi ta lấy tinh làm dương vật bị xây xát). Vì vậy khi khai thác tinh dịch đặc biệt là trong trường hợp lấy tinh bằng tay không để dương vật gia súc cọ xát vào giá lây tinh làm xây xát dương vật. + Màu xanh lam thường do lẫn mủ, nó thường xảy ra trong các trường hợp gia súc bị viêm nhiễm đường sinh dục. + Màu vàng thường do lẫn nước tiểu. Để khắc phục trong trường hợp này cần chú ý khi lấy tinh tránh hứng cả nước tiểu vào trong tinh dịch. 85 + Màu đen thường do lẫn phân hoặc các chất bẩn. Chúng ta chỉ được phép sử dụng những mẫu tinh có màu bình thường, còn tất cả các mẫu tinh có màu khác thường thì không được sử dụng. 1.3. Độ vẩn của tinh dịch Ta có thể dùng chỉ tiêu này đánh giá sơ bộ mức độ hoạt động, mật độ, nồng độ của tinh trùng có trong tinh dịch và đây là chỉ tiêu quan sát bằng mắt thường và kiểm tra thường xuyên. Người ta cầm lọ tinh dịch và quan sát từ thành bình bên này quan thành bên kia. Người ta đánh giá độ vẩn theo 3 mức: + Khi tinh dịch có độ vẩn ở mức kém nhất, nồng độ, hoạt lực kém nhất (Ta ghi nhận độ đậm đặc của mẫu tinh đó là +): người ta thấy từ thành bình này sang thành bình bên kia, không nhìn thấy sự chuyển động trong đó. Độ đậm đặc này thường gặp ở lợn nội và chó. + Khi tinh dịch có độ đậm đặc trung bình thì quan sát không thấy thành bình bên kia, không nhìn thấy sự chuyển động trong đó, ta ghi nhận độ đậm đặc của mẫu tinh là ++. Độ đậm đặc này thường gặp ở lợn ngoại. + Khi tinh dịch đậm đặc (nồng độ, mức độ, hoạt lực tốt nhất) thì khi quan sát không thấy thành bình bên kia và trong đó có những cuộn sóng chuyển động. Độ đậm đặc này thường gặp ở tinh dịch trâu, bò, dê, cừu và một số trường hợp của lợn ngoại. 1.4. Mùi của tinh dịch - Mùi bình thường: Bình thường tinh dịch có mùi nồng, hắc, tanh. Mùi của tinh dịch chủ yếu là do chất tiết của các tuyến sinh dục phụ quyết định. - Mùi khác thường + Mùi khai do có lẫn nước tiểu. + Mùi thối do lẫn phân. + Mùi thối khẳn là do có lẫn dịch của tuyến nacosi. * Chú ý: Chúng ta chỉ được sử dụng những mẫu tinh có mùi bình thường. 1.5. Độ pH của tinh dịch 86 pH của một chất lỏng được xác định bằng nồng độ ion H+ có trong đó. Số lượng ion H+ càng tăng thì chất lỏng đó càng toan và ngược lại thì kiềm tính. Tinh dịch bình thường phải có pH bình thường, nếu pH quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến chất lượng của tinh dịch. Bảng 11. pH của các loài gia súc [9] Loài g. súc Bò Cừu Lợn Ngựa Chó Thỏ pH 6.4 - 6.9 5.9 - 6.3 6.8 - 7.9 6.2 - 7.8 6.1 - 7.0 6.6 - 7.5 Để xác định pH của tinh dịch ta có nhiều phương pháp khác nhau. * Phương pháp xác định pH bằng pH meter. Đưa cực của máy đo pH vào dung dịch chuẩn và điều chỉnh kim đồng hồ để pH chỉ đúng pH của dung dịch chuẩn. Lấy cực của máy ra khỏi dung dịch chuẩn, rửa sạch bằng nước cất. Sau đó nhúng cực của máy vào cốc tinh dịch, máy sẽ báo pH của tinh dịch trên đồng hồ. * Phương pháp dùng giấy chỉ thị màu hoặc hệ thống ống màu. Chuẩn bị giấy chỉ thị sau đó dùng đũa thủy tinh nhỏ một giọt tinh nguyên lên giấy chỉ thị màu, màu của giấy chỉ thị sẽ thay đổi, ta so sánh với màu chuẩn trên cuộn giấy chỉ thị ta sẽ có kết quả (chú ý kết quả chỉ đọc trong vòng 2-3 giây nếu để lâu, kết quả sẽ không chính xác). * Dùng pH kế. Nhúng đầu pH kế vào nước và đọc kết quả. 1.6. Sức hoạt động của tinh trùng (A, active) a. Khái niệm Sức hoạt động của tinh trùng là tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi trường quan sát được. Việc đánh giá sức hoạt động của tinh trùng cso ý nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá phẩm chất tinh dịch vì nó là chỉ tiêu cấu thành nên chỉ tiêu tổng hợp VAC mà chỉ tiêu này cho biết tổng số tinh trùng có khả năng thụ thai trong một lần xuất tinh gia súc. b. Phương pháp đánh giá Ngày nay có nhiều phương pháp đánh giá sức hoạt động của tinh trùng. Các nước có điều kiện người ta sử dụng hệ thống máy tính để kiểm tra, phương pháp này rõ ràng và chính xác. Trong điều kiện Việt nam chúng ta thì đánh giá sức hoạt động của tinh trùng bằng cách quan sát qua kính hiển vi có độ phóng đại từ 200-600 lần. Việc đánh giá được cho điểm theo thang 10 điểm của Milavanov V. K như sau: Bảng 12. Thang điểm đánh giá sức hoạt động của tinh trùng 87 Điểm 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Số % t.t t. thẳng 95- 100 85- 95 75- 85 65- 75 55- 65 45- 55 35- 45 25- 15 15- 25 5-15 Phương pháp tiến hành như sau: Dùng đũa thủy tinh sạch, lấy một giọt tinh nhỏ lên một phiến kính sạch, dùng la men khô sạch đậy lên giọt tinh sao cho giọt tinh dàn mỏng, đều. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi và xem ở độ phóng đại 160-600 lần. Trong khi kiểm tra, tiêu bản được sưởi ấm ở nhiệt độ 40-410C (ta có thể dùng máy ổn nhiệt để nâng nhiệt độ). Khi đưa tiêu bản lên kính ta quan sát tại ba điểm trên một vi trường, mỗi điểm ta quan sát và đếm 10 tinh trùng xem có bao nhiêu tinh trùng tiến thẳng và tính theo tỉ lệ %. Kết quả tại ba điểm cộng lại và chia trung bình thì đó là kết quả của sức hoạt động của tinh trùng. * Chú ý: - Tinh trùng cần phải kiểm tra sức hoạt động ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể gia súc hoặc ngay sau khi lấy ra khỏi nơi bảo tồn. - Khi kiểm tra phải ở nhiệt độ 40-410C. - Độ chênh lệch cho phép là 0.1 giữa các lần kiểm tra. - Sức hoạt động của tinh trùng một số loài gia súc sau khi khai thác xong phải đạt: dê, cừu A ≥ 0.9, trâu bò A ≥ 0.8, lợn A ≥ 0.7 chúng ta mới sử dụng tinh dịch đo trong thụ tinh nhân tạo. 1.7. Nồng độ tinh trùng (C) 88 a. Khái niệm Nồng độ tinh trùng là tổng số tinh trùng có trong 1 ml tinh nguyên. Đây là chỉ tiêu quan trọng vì nó là một trong những chỉ tiêu cấu thành nên chỉ tiêu tổng hợp VAC. b. Phương pháp kiểm tra - Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng, bạch cầu Tùy theo loài gia súc: Đối với lợn ta dùng buồng đếm bạch cầu, đốivới trâu bò ta dùng ống hồng cầu. Đây là phương phá Hình 34. Buồng đếm Niubaoơ khá chính xác và được sử dụng khá phổ biến hiện nay. Có nhiều buồng đếm hồng bạch cầu như Toma, Gariaep, Niubaoơ nhưng về hình dạng cấu tạo của chúng là tương tự nhau và nguyên tắc sử dụng cũng như nhau vì diện tích mỗi ô bé nhất của buồng đếm là: S = 1/400 mm2 và độ sâu của buồng đếm là 1/10mm. Chúng ta phải đếm số tinh trùng quan sát được trong 5 ô trung bình (80 ô nhỏ). Đó cũng là số tinh trùng có được TK trong một thể tích 1/50m3 (= 1/40. 1/10. 80). Từ đó có thể suy ra số lượng tinh trùng có trong 1cm3 (1ml) tinh dịch. Cách tiến hành như sau: + Phương pháp tính nồng độ tinh trùng lợn. * Phương pháp dùng buồng đếm bạch cầu Đưa buồng đếm lên kính hiển vi có độ phóng đại từ 200-600 lần, sau đó chỉnh kính hiển vi cho nhìn rõ buồng đếm. Đặt một la men khô và sạch lên trên buồng đếm. Dùng ống pha loãng bạch cầu đã được rửa sạch sấy khô hút tinh dịch đến vạch 0,5 hoặc vạch 1,0. Sau đó hút dung dịch nước muối NaCl 3% đến vạch 11 để giết tinh trùng và pha loãng tinh dịch. Trong quá trình hút tinh dịch hoặc hút nước muối cần chú ý không gây hiện tượng sủi bọt. Nếu có hiện tượng đó thì phải làm lại. Bịt hai đầu của ống pha loãng bằng ngón tay nhẫn, lắc nhẹ 5-6 lần cho đều. Như vậy trong đoạn phình của ống pha loãng bạch cầu, tinh dịch được pha loãng 20 lần (nếu hút tinh dịch đến vạch 0,50 và 10 lần nếu hút tinh dịch đến vạch 1,0). Bỏ đi đoạn nước muối 3% ở đoạn ống mao dẫn phía dưới của phần phình ra vì ở phần này không có tinh trùng. Sau đó nhỏ hỗn hợp này vào khe buồng đếm. Chú ý: chỉ cần đặt miệng của ống pha loãng vào mép la men và với lực mao dẫn hỗn dịch sẽ được hút đầy vào buồng đếm (không làm hỗn hợp tràn lên mặt của la men). Dùng ốc vi cấp chỉnh cho rõ buồng đếm và tinh trùng có trên đó. Nguyên tắc đếm tinh trùng giống như đếm hồng bạch cầu. * Chú ý: khi đếm những tinh trùng nằm trên các cạnh mỗi ô chỉ đếm hai cạnh còn hai cạnh kia nhường cho ô khác. Chúng ta đếm tinh trùng trong 5 ô trung bình (80 ô nhỏ), kết quả được bao nhiêu tinh trùng ta ghi nhận và tính theo công thức sau: C = n. D. 400/N.p.106 (1) Trong đó: C: nồng độ tinh trùng có trong tinh dịch n: số tinh trùng đã đếm được trong 80 ô nhỏ D: mức độ pha loãng (10 hoặc 20 lần) P: độ sâu buồng đếm N: số ô con đã đếm (80 ô) 89 Hình 35. Buồng đếm hồng bạch cầu a. Nhìn nghiêng b. Nhìn từ trên xuống Hình 36. Thứ tự đếm tinh trùng: Trên xuống, từ trái sang phải Để đơn giản hóa cách tính toán, chúng ta pha loãng tinh dịch 20 lần trong ống hút bạch cầu. Số lượng tinh trùng đếm được trong 80 ô con là n. Như vậy số lượng tinh trùng đếm được trong 1 ml tinh dịch sẽ là: Hình 37. Ống Karas C = n.50.20.103 = n.106 Và công thức (1) sẽ là: C = n.106 Như vậy 1 ml tinh trùng đếm được trên buồng đếm đại diện cho 1.000.000 tinh trùng. + Phương pháp dùng Spermiodensimeter - Cấu tạo ống: Spermiodensimeter còn gọi là ống Karras. Đầu là một ống thủy tinh hình chóp, miệng ống hình vuông (1(1cm). Sau đó dùng pypet hút 1 ml tinh nguyên cho vào đó (mức độ pha loãng là 1/10). Dùng ngón tay cái bịt lấy miệng đảo cho đều. Rót hỗn hợp này vào ống Karras cho đến vạch 100. Đặt mảnh giấy trắng phía sau ống Karras để đọc kết quả. Quan sát qua ống: do độ dày của lớp dung dịch dày dần từ dưới lên trên nên độ đục của lớp dung dịch trong ống cũng không giống nhau kể từ dưới lên trên. Vì vậy các vạch và các chữ số sẽ mờ tỏ khác nhau. Trước hết cần xác định số hàng chục trên bảng số của ống Karras mà mắt ta còn nhìn thấy được ở giữa phần tỏ mờ. Thí dụ: ở vạch 65 có thể nhìn thấy rõ, nhưng càng lên 90 phía trên thì các vạch càng mờ dần sau đó không nhìn thấy nữa. Như vậy ta sẽ ghi nhận vạch 65 và đối chiếu với bảng tính sẵn để xác định nồng độ tinh trùng trong 1ml dung dịch. Trong trường hợp nếu tinh dịch quá loãng, có thể đọc được vạch 100 thì phải thay đổi mức pha loãng. Có thể pha loãng với tỉ lệ 5/10 mà vẫn con nhìn thấy rõ vạch 100 thì những mẫu tinh đó có nồng độ tinh trùng quá thấp, ta không nên sử dụng nó trong tinh trùng nhân tạo. * Chú ý: phương pháp này rất tiện lợi cho các cơ sở sản xuất, nhưng mức đo chính xác của nó bị hạn chế. Vì vậy định kỳ ta phải dùng buồng đếm kiểm tra lại để có độ chính xác cao. Bảng 13. Bảng đối chiếu nồng độ tinh trùng dùng cho ống Karras Bảng trên Nồng độ loãng tinh trùng (106/ml) qua các mức pha loãng ống Karras 1/10 2/10 3/10 4/10 5/10 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 135,0 150,0 165,0 185,0 195,0 210,0 225,0 245,0 265,0 295,0 335,0 375,0 425,0 67,5 67,5 82,5 90,0 97,5 105,0 112,5 122,5 132,5 147,5 167,5 187,5 212,5 45,0 50,0 55,0 60,0 65,0 70,0 75,0 81,6 88,3 98,3 111,6 125,0 141,6 33,7 37,5 41,2 45,0 48,7 52,5 56,2 61,2 66,2 73,7 83,7 93,7 106,2 27,0 30,0 33,8 36,0 39,0 42,0 45,0 49,0 53,0 59,0 67,0 75,0 85,0 91 30 25 20 485,0 555,0 635,0 242,5 277,5 317,5 161,6 185,0 211,6 121,2 130,0 158,2 97,0 111,0 127,0 - Dùng máy so màu quang điện (Colometer) - Dùng máy vi tính để kiểm tra nồng độ Hiện nay người ta sử dụng hệ thống máy vi tính để kiểm tra nồng độ của tinh trùng và một số các chỉ tiêu khác. Sử dụng phương pháp này rất tiện lợi, ta chỉ cần đưa vào máy 0,1 ml tinh dịch, máy sẽ lời ngay kết quả trên màn hình và in ra giấy các thông số: Nồng độ của tinh trùng, mức độ pha loãng cần thiết, số liều tinh có thể sản xuất được. Tóm lại, việc kiểm tra nồng độ của tinh trùng có nhiều cách vì vậy tùy theo các cơ sở khác nhau mà có phương pháp kiểm tra phù hợp. 2. Những chỉ tiêu đánh giá định kỳ 2.1. Acrosome của tinh trùng (Ac) Đây là chỉ tiêu quan trọng bởi vì nếu như tinh trùng mất Acrosome thì không còn khả năng thụ thai nữa. 92 Cách tiến hành kiểm tra chỉ tiêu này như sau: Dùng một phiến kính khô, sạch nhỏ lên đó một giọt tinh và 1-2 giọt dung dịch Acrota. Đậy lamen lên giọt hỗn hợp này. Đặt phiến kính lên kính hiển vi có tụ quang kính nền đen (dùng ánh sáng đèn xem rõ hơn). Chúng ta nhận thấy Acrosome của tinh trùng phát ra quãng sáng ở phía đầu, đo là tinh trùng còn nguyên Acrosome. Những tinh trùng mà Acrosome bị Hình 38. Kiểm tra sức kháng tinh trùng lợn ngoại tổn thương thì không có quầng sáng này. Những gia súc tinh trùng có tỉ lệ Acrosome hoàn chỉnh càng cao thì chất lượng tinh trùng càng tốt. Và ta có tể tính tỉ lệ đó theo công thức sau: Ac = S. 100/300 hoặc (500) Trong đó: - Ac: tỷ lệ Acrosome còn nguyên vẹn (%) - S: tổng số tinh trùng Acrosome còn nguyên vẹn đếm được (thường người ta đếm tinh trùng Acrosome bị tổn thương thì nhanh hơn). - 300 hoặc 500 là tổng số tinh trùng đếm 2.2. Sức kháng của tinh trùng (R) a. Định nghĩa Sức kháng của tinh trùng là khả năng chống chịu của tinh trùng đối với dung dịch nước muối 1%. Nếu tinh trùng càng chịu được mức độ pha loãng càng lớn chứng tỏ sức đề kháng của tinh trùng càng cao và như vậy tinh trùng càng tốt và ngược lại. b. Phương pháp tiến hành Hiện nay chúng ta thường sử dụng phương pháp của Milovanov (1952) - Phương pháp kiểm tra sức kháng của tinh trùng lợn ngoại Dùng ba ống nghiệm (hoặc ba lọ) có dung tích 10 ml và đánh số thứ tự 1, 2, 3. Dùng pipet hút dung dịch NaCl 1% (đã được thanh trùng từ trước) cho vào ống 1: 5 ml, ống 2: 1 ml, ống 3: 0,5 ml. Dùng micropipet hút 0,01 ml tinh nguyên cho vào ống 1, lắc nhẹ cho đều. Như vậy ở ống 1 tinh dịch được pha loãng 500 lần (500.0,01). Hút 1 ml hỗn dịch ở ống 1 sang ống 2, lắc nhẹ để hỗn dịch đều. Như vậy hỗn dịch ở ống 2 được pha loãng là 1000 lần (500, 2). Dùng ống hút khác hút 0,5 ml hỗn dịch ở ống 2 sang ống 3. Như vậy ở ống 3 được pha loãng là 2000 lần (1000, 2). Dùng đũa thủy tinh khô sạch lấy 1 giọt hỗn hợp ở ống 3 cho lên phiến kính đã rửa sạch sấy khô, dàn mỏng và nâng nhiệt độ 400 - 410C và đưa lên kính hiển vi với độ phóng đại 160 lần trở lên để kiểm tra (A). Nếu thấy tinh trùng còn tiến thẳng thì thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% vào ống thứ 3, mức pha loãng sẽ là 2.2000 lần (1,1 ml. 2000). Sau đó lại kiểm tra A. Nếu thấy tinh trùng còn tiến thẳng lại thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1%, bấy giờ River = 2400 (1,2 ml. 2000). 93 Công việc được tiến hành lặp đi lặp lại cho đến khi vào không còn tinh trùng tiến thẳng nữa thì dừng lại. Sức kháng của tinh trùng được tính theo công thức của Milovanov (1933) R = V/v (1) Trong đó: R : sức kháng của tinh trùng V : lượng dung dịch NaCl 1% đã sử dụng v : lượng tinh dịch đã dùng để kiểm tra Trong quá trình tiến hành, vì phải pha chuyển 3 ống, để khỏi nhầm lẫn, người ta đã biến đổi công thức trên trở thành công thức tổng quát sau: R = r0 + r.n R : sức kháng của tinh trùng r0 : mức pha loãng tinh dịch ở ống thứ 3 (ở đây là 2000 lần) r : mức pha loãng của mỗi lần cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% (r = 200) nü : số lần thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% Công thức tổng quát trên có thể sử dụng để tính sức kháng của hầu hết các loại gia súc gia cầm. - Phương pháp kiểm tra sức kháng tinh trùng của lợn nội Do sức kháng tinh trùng của lợn nội thấp nên chúng ta chỉ dùng phương pháp hai lọ. Dùng hai ống nghiệm (hoặc hai lọ) có dung tích 10 ml rửa sạch, sấy khô ghi thứ tự lọ 1, 2. Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch NaCl 1% cho vào lọ 1 và 0,5 ml cho vào lọ 2. Nhỏ 0,01 ml tinh nguyên vào lọ 1. Lắc nhẹ cho đều, tinh dịch được pha loãng 500 lần (5: 0,01). Hút 0,5 ml hỗn hợp đó từ lọ 1 sang lọ 2, lắc nhẹ trộn đều. Tinh dịch được pha loãng 1000 lần (500.2). Dùng một phiến kính rửa sạch, sấy khô. Lấy 1 giọt hỗn hợp ở lọ 2 nhỏ lên phiến kính. Dùng đũa thủy tinh dàn mỏng (nhẹ nhàng, càng mỏng càng tốt). Nâng nhiệt độ lên 400C - 410C và đưa lên kính hiển vi có độ phóng đại 160 lần trở lên kiểm tra hoạt lực. Nếu còn tinh trùng tiến thẳng thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% vào, tiếp tục kiểm tra A. 94 và cứ làm như vậy cho đến khi không còn tinh trùng tiến thẳng ta dùng lại và sử dụng công thức tổng quát (2) trên để tính, ở đây ro = 1000 và r = 100. Trong thụ tinh nhân tạo người ta yêu cầu sức kháng của tinh trùng lợn ngoại phải lớn hơn hoặc bằng 3000 lần, lợn nội phải lớn hơn hoặc bằng 1500 lần. - Phương pháp kiểm tra sức kháng ở trâu, bò, dê, cừu Ta dùng 3 ống nghiệm (hoặc 3 lọ) có dung tích 10 ml đã được rửa sạch, sấy khô. Đánh số thứ tự 1, 2, 3. Cho dung dịch NaCl nồng độ 1% lần lượt vào: - ống 1:5ml, - ống 2: 1ml, -ống 3: 0,25ml. Sau đó dùng micropipet hút 0,01ml tinh nguyên cho vào ống thứ nhất, lắc nhẹ cho đều, hút 1ml hỗn dịch ở ống thứ nhất sang ống thứ 2, lắc nhẹ cho đều sau đó hút từ ống thứ hai sang ống thứ 3: 0,25ml. Như vậy, ở ống thứ nhất có mức độ pha loãng là 500 lần, ống thứ 2 có mức độ pha loãng là 1000 lần và ống thứ 3 có mức độ pha loãng là 2000 lần. Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt hỗn dịch ở ống thứ 3 cho lên phiến kính đã rửa sạch, sấy khô, dàn mỏng và nâng nhiệt độ lên 400C - 410C. đưa lên kính hiển vi, kiểm tra (A) ở mức độ phóng đại 160 lần trở lên. Nếu còn tinh trùng tiến thẳng, ta cho thêm 0,5ml dung dịch NaCl 1% vào ống thứ 3, sau đó kiểm tra (A). Nếu còn tinh trùng tiến thẳng ta lại tiếp tục cho vào 0,5ml dung dịch NaCl 1% vào ống thứ 3, tiếp tục kiểm tra (A). Cứ làm như vậy cho đến khi nào không còn tinh trùng tiến thẳng nữa thì ta dừng lại và cũng tính theo công thức tổng quát trên. Đối với tinh dịch trâu, bò, dê, cừu thì mỗi lần cho thêm 0,5ml dung dịch NaCl 1% thì sức kháng của tinh trùng sẽ tăng 2000 lần. Trâu, bò, dê, cừu thì sức kháng của tinh trùng thường phải đạt30.000 lần trở lên. Chú ý: - Sức kháng của tinh trùng cần được kiểm tra ngay sau khi lấy tinh ra khỏi cơ thể gia súc từ 5-10 phút, nếu để lâu do tác động của điều kiện ngoại cảnh sẽ không chính xác. 95 Hình 39. Phương pháp phiết tiêu bản - Do quá trình kiểm tra nhiều lần ở 1 con nên có thể bỏ qua một số lần của r0 để cho quá trình kiểm tra được tiến hành nhanh hơn và sức kháng của tinh trùng sẽ chính xác hơn. 2.3. Tỉ lệ sống của tinh trùng (Sg %) Phương pháp đánh giá tỉ lệ sống của tinh trùng dựa trên cơ sở: những tinh trùng còn sống, có hoạt động tiến thẳng thì không bị bắt màu khi gặp thuốc nhuộm. Còn những tinh trùng chết và những tinh trùng hoạt động yếu ớt, hoặc dao động thì dễ dàng bị bắt màu. Phương pháp tiến hành: dùng một phiến kính đã được rửa sạch, sấy khô, lấy một giọt tinh nhỏ lên phiến kính. Sau đó lấy một giọt thuốc nhuộm cozin (hoặc fuccin.xanh metylen) dung dịch 5% nhỏ bên cạnh giọt tinh dịch. Dùng đũa thủy tinh nhẹ nhành, nhanh chóng trộn đều trong vài giây. Dùng một phiến kính khác phiết thành tiêu bản. * Chú ý: Thao tác cần nhẹ nhàng, nhanh chóng để không làm tổn thương và chết các tinh trùng có khả năng tiến thẳng gây chết nhân tạo. Tiêu bản càng mỏng càng tốt. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi ở độ phóng đại 400 - 600 lần. Đếm 500 hoặc 300 tinh trùng để phân loại tinh trùng sống, chết (tinh trùng sống thì không bắt màu của thuốc nhuộm, tinh trùng chết thì bắt màu thuốc nhuộm) và tính theo công thức: Sg % = D. 100/500 (300) Trong đó: Sg % : Tỷ lệ tinh trùng sống D : Tổng số tinh trùng sống đếm được 500 (300) : Tổng số tinh trùng đếm Thường tỷ lệ tinh trùng sống ở các loài gia súc phải đạt như sau người ta mới sử dụng tinh dịch đó trong thụ tinh nhân tạo: lợn ≥70%, trâu bò ≥80%, cừu ≥90%. 96 2.4. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K) và hệ số bệnh lý của tinh trùng (B) a. Khái niệm Tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình dạng khác thường so với tinh trùng bình thường. Villiam (1921) đã cho thấy tinh trùng kỳ hình có ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ thụ thai. V.K. Milovanov cho thấy có hai thời kỳ có thể gây ra tình trạng kỳ hình của tinh trùng : - Ngay trong quá trình sinh tinh. Điều này xảy ra thường bắt nguồn từ những nguyên nhân liên quan đến các bệnh Hình 40. Tinh trùng kỳ hình tật, đặc biệt là các loại bệnh đường sinh dục. - Chế độ chăm sóc nuôi dưỡng như: thức ăn không đảm bảo đầy đủ và cân đối về chất, chế độ tắm chải không thường xuyên, chế độ sử dụng không hợp lý. 97 - Sau khi tinh trùng bài xuất ra ngoài. Điều này thường liên quan đến các yếu tố ngoại cảnh như: kỹ thuật lấy tinh, quá trình xử lý tinh dịch. - Người ta chia tinh trùng kỳ hình ra làm bốn loại: + Tinh trùng kỳ hình đầu. + Tinh trùng kỳ hình cổ. + Tinh trùng kỳ hình thân. + Tinh trùng kỳ hình đuôi. Để đánh giá tinh trùng kỳ hình, thường dùng phương pháp nhuộm màu tinh trùng bằng một số loại thuốc nhuộm như Xanh mêthlen, tím Violet, Giêm xa, đỏ Methyl. Hình 41. Tinh trùng kỳ hình đầu và cổ b. Cách tiến hành Đặt một giọt tinh lên một đầu phiến kính đã được rửa sạch, sấy khô và tẩy mỡ. Nếu tinh dịch đặc có thể pha loãng bằng vài giọt dung dịch Natricitrat 2,9% (hoặc nước sinh lý (0,85%). Dùng đầu đũa thủy tinh trộn đều hỗn hợp này. Dùng cạnh của một phiến kính khác phiết nhẹ thành tiêu bản (phiết một lần, càng mỏng càng tốt, không chà đi xát lại gây ra kỳ hình nhân tạo dẫn đến sự không chính xác). Để cho tiêu bản tự khô trong không khí (không hơ nóng bất kỳ hình thức nào). Sau khi tiêu bản đã khô, cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng thuốc nhuộm (được lọc kỹ, không có cặn), nhỏ đều trên tiêu bản. Đợi cho tiêu bản khô (mùa hè 5-10 phút, mùa đông khoảng 10-15 phút). Dùng nước cất rửa sạch tiêu bản. * Chú ý: không dội mạnh nước cất mà để nghiêng tiêu bản một góc 450, dùng pipet hoặc buret nhỏ từ từ trên phần phiến kính không có tiêu bản cho nước tràn qua phần có tiêu bản để rửa trôi thuốc nhuộm. Rửa đến khi tiêu bản vẫn còn màu xanh nhạt thì dừng lại (không rửa trắng tiêu bản). Đợi cho tiêu bản tự khô, đặt lên kính hiển vi có độ phóng đại 400-600 lần để kiểm tra. Đếm tổng số 300 hoặc 500 tinh trùng xem trong đó có bao nhiêu tinh trùng kỳ hình và tính tỷ lệ tinh trùng kỳ hình theo công thức sau: K = M.100/300 (500) Trong đó: K : tỷ lệ phần trăm tinh trùng kỳ hình M : tổng số tinh trùng kỳ hình đếm được 300 hoặc 500 là tổng số tinh trùng đếm Thông thường tinh dịch của các loài gia súc có tỷ lệ kỳ hình nhỏ hơn 20% là đạt yêu cầu. 2.5. Chỉ tiêu tổng hợp VAC Chỉ tiêu này giúp ta đánh giá một cách toàn diện về chất lượng tinh dịch của đực giống vì nó cho ta biết tổng số tinh trùng có khả năng thụ thai trong một lần xuất tinh. Đây là tích của các chỉ tiêu: thể tích tinh dịch, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng. Bảng 14. VAC của một số loài gia súc [4] Loài g. súc Ngựa Bò Cừu Lợn Thỏ Chó Mèo Gà Trâu VAC 9,0 6,0 3,0 4,5 0,03 1,5 0,1 1,8 4,0 Chỉ tiêu này ở các loài gia súc khác nhau thì khác nhau, nhưng nó tuân theo một quy tắc là chỉ tiêu này càng cao thì chất lượng tinh dịch càng tốt. Chỉ tiêu này tỷ lệ thuận với thời gian bảo tồn tinh dịch. VI. KỸ THUẬT PHA LOÃNG, BẢO TỒN, VẬN CHUYỂN VÀ PHÂN PHỐI TINH DỊCH 1. Môi trường pha loãng tinh dịch 1.1. Mục đích, yêu cầu 1.1.1. Mục đích - Tăng thêm khối lượng tinh dịch từ đó nâng cao hiệu quả sinh sản của đực giống. - Kéo dài thời gian sống của tinh trùng ở ng