Giáo trình Vi sinh vật công nghiệp

5cm và nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong buồng nuôi cấy có độ ẩm không khí là 90%. Phương pháp bề mặt thường thích hợp cho các quá trình nuôi nấm mốc, một số trường hợp là xạ khuẩn - những nhóm vi sinh vật sinh trưởng thành hệ sợi. Cũng có một vài trường hợp nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp này. Nuôi vi sinh vật trên bề mặt môi trường rắn hoặc bán rắn, cơ chất dinh dưỡng là cám có trộn các loại bột ngũ cốc, đậu tương và một số thành phần dinh dưỡng khác... Ngày nay phương pháp bề mặt vẫn dùng để sản xuất các loại sản phẩm này, có khác xưa là trình độ công nghệ hiện đại hơn và được trang bị các thiết bị đo lường để điều khiển được quá trình cho hiệu suất lên men cao. Song phương pháp nuôi cấy bề mặt vẫn có nhiều nhược điểm: Tốn nhiều diện tích mặt bằng. Khó cơ khí hoá và đặc biệt là rất khó tự động hoá được toàn bộ quá trình. Chi phí nhân công, điện nước... cho một đơn vị sản phẩm cao. Nguồn cacbon cho môi trường dinh dưỡng ở đây là các loại hạt như ngô, gạo, mì, bobo, đại mạch, đậu tương... được nghiền vỡ thành mảnh có kích thước khoảng 1 á 3mm, cùng với cám gạo, cám mì (hai loại cám này cũng đóng vai trò nguồn cacbon và nguồn các chất sinh trưởng ) và trấu. Cám trấu trong môi trường có tác dụng làm xốp để tăng độ hiếu khí cho vi sinh vật nuôi. Chuẩn bị môi trường bằng cách trộn các thành phần cho đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 á 60% và được hấp thanh trùng. Cấy giống vi sinh vật từ dịch nhân giống hoặc rắc các bào tử vào khối môi trường đã thanh trùng và để nguội, ủ thành đống vài giờ, sau đó tãi ra khay với chiều dầy khoảng 2 á 5cm ( càng mỏng càng tốt ). Khi vi sinh vật phát triển sẽ thải CO2, toả nhiệt ra xung quanh làm nóng và kho môi trường, hệ sợi làm cho môi trường kết thành tảng. Khi đó cần phải thông gió phun mù hoặc làm ẩm trực tiếp, lật khối môi trường nuôi cấy hoặc bẻ nhỏ. Buồng nuôi cấy có các giá kê khay, có bộ phận gia nhiệt và làm mát, bộ phận phun mù bằng nước để giữ độ ẩm tương đối của không khí là 90% để tránh làm khô môi trường. Lên men xitric nuôi mốc trên môi trường lỏng. Khi hệ sợi của mốc kết thành lớp dày nổi lên bề mặt cần chú ý không để vỡ và bị chìm. Dịch lên men tích tụ axit xitric được rút ra ở phía dưới và lại bổ sung môi trường mới rồi cho lên men tiếp tục. Nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn và xốp ngày nay được cải tiến nhiều trong quy trình: thay khay và buồng nuôi cấy bằng thùng quay có trục chéo hoặc thùng bể có thổi khí liên tục và điều chỉnh nhiệt độ, độ ẩm. Những cải tiến này làm tăng năng suất của quá trình lên rất nhiều. 5.2.2. Phương pháp nuôi cấy chìm. Phương pháp này dùng cho cả nuôi cấy vi sinh vật kị khí và vi sinh vật hiếu khí. Đối với nuôi vi sinh vật kị khí trong quá trình nuôi không cần sục khí chỉ thỉnh thoảng khuấy trộn còn với vi sinh vật hiếu khí phải sục khí liên tục. Đây là phương pháp nuôi cấy hiện đại đã được dùng trong nửa cuối của thế kỉ XX và cho kết quả rất lớn đối với công nghệ vi sinh. Nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu dùng môi trường dinh dưỡng lỏng (hay còn gọi là môi trường dịch thể). Chủng vi sinh vật được gieo cấy vào môi trường phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng. Đặc điểm này đòi hỏi trong suốt quá trình nuôi cấy phải khuấy và cung cấp oxy bằng cách sục khí liên tục. Chính yêu cầu này làm cho các trang thiết bị nuôi cấy chìm thêm phức tạp, vì phải đảm bảo sao cho vừa cấp đầy đủ oxy hoà tan cho nhu cầu sinh trưởng và tạo thành sản phẩm của chủng nuôi cấy, vừa khuấy trộn liên tục mà vẫn đảm bảo không bị tạp khuẩn xâm nhập, hơn nữa thiết bị làm việc trong điều kiện áp lực dư cao hơn bên ngoài. Ngày nay phương pháp nuôi cấy chìm được dùng phỏ biến trong công nghiệp vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào từ nấm men, các chế phẩm vi sinh làm phân bón cố định đạm, làm thuốc trừ sâu, các enzim, các axit amin, vitamin, các chất kháng sinh, các chất kích thích sinh học. V.v... Phương pháp nuôi cấy chìm có một số ưu điểm: Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền. Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp. Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn. Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá cho toàn bộ quá trình. Song phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau: - Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ. Vì vậy những thiết bị lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối. Trong nuôi cấy bề mặt có thể loại bỏ phần đã nhiễm trùng các phần khác vẫn còn dùng được. 5.3. Các phương pháp tuyển chọn và bảo quản nguồn giống vi sinh vật. 5.3.1. Phân lập giống vi sinh vật thuần chủng. Để chọn được giống vi sinh vật thuần chủng, bước đầu tiên là phải phân lập chúng từ các nguồn tự nhiên như: nước, không khí, đất, các mô động thực vật, các vật liệu hữu cơ vô cơ đã bị phân huỷ ít nhiều. Ví dụ:Từ quả dưa bở mốc xanh ở chợ Peoria đã chọn được chủng Penicillium notatum đầu tiên dùng trong công nghiệp sản xuất chất kháng sinh pinicillin. Từ những kỹ thuật vi sinh vật học cổ điển từ thời L. Pausteur và R.Koch đề ra nhiều phương pháp đặc biệt dùng để phân lập chủng giống vi sinh vật thuần khiết dùng cho công nghiệp đã được phát triển, nhất là trong việc tìm chủng sản xuất những chất kháng sinh mới. Từ những ổ sinh thái tự nhiên chúng ta phân lập được các chủng hoang dại. Các chủng này có một số hoạt tính enzim, tích tụ các chất trao đổi bậc 1, bậc 2 v.v... nhưng đồng thời chúng cho năng suất thấp. Theo kĩ thuật vi sinh vật cổ điển việc phân lập tuyển chọn các chủng thuần khiết mất nhiều công sức và thời gian. Ngày nay người ta dùng phương pháp “sàng lọc“ vừa nhanh vừa có hiệu quả. Nguyên lý của phương pháp này như sau: Trước hết người ta kiểm tra sơ bộ đặc điểm của một hỗn hợp các giống vi sinh vật lấy từ mẫu tự nhiên, như đất hoặc nước, cỏ cây chẳng hạn.. làm các huyền dịch mẫu pha loãng 1/10 đến 1/100 từ đất, rồi gieo trên mặt hộp peptri đựng môi trường thạch dinh dưỡng và đã cấy một chủng vi sinh vật kiểm định có tác dụng đối kháng. Chỉ có chủng nào trong đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định, nghĩa là có tính chất kháng sinh thì sau khi nuôi sẽ tạo ra vùng ức chế đặc hiệu trên đĩa thạch. Ta tách khuẩn lạc của chủng ấy và đem nuôi cấy thử chất sinh ra và xác định tiếp theo. Cũng có thể đơn giản đặt các mẫu đất lên các điểm khác nhau lên mặt thạch dinh dưỡng (nếu muốn tìm vi khuẩn ) hoặc của thạch khoai tây (nếu muốn tìm giả nấm men) đã có chủng kiểm định được gieo cấy từ trước. Giữ đĩa thạch ở 28 á 370C trong khoảng 2 ngày, quan sát vùng bị ức chế và quyết định công việc phân lập các chủng vi sinh vật có tác dụng tiếp theo. Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chóng xác định được tính kháng khuẩn, kháng nấm hoặc virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập. Phương pháp này thường dùng hai kiểu kĩ thuật: Lấy một mẫu thử để xác định khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định. Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với cùng một chủng kiểm định. Cấy những chủng đã được phân lập bằng những vạch trên mặt thạch dinh dưỡng trong hộp peptri. Sau đó cấy chủng kiểm định theo đường song song hoặc vuông góc với đường vạch của chủng nghiên cứu. Đặt hộp peptri vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp với chủng kiểm định. Tác dụng kháng sinh của mẫu thử được xác định ở vùng mặt thạch không bị mờ tại các giao điểm đường cấy của chủng kiểm định bị ức chế. Phương pháp “ sàng lọc ” chủ yếu được sử dụng trong việc tìm chủng sản các chất kháng sinh. Từ nguyên lí cơ bản phương pháp đã được cải tiến và ngày một phong phú để chọn các chủng sản các axit amin người ta sử dụng kiểu chọn lọc theo kĩ thuật penicillin. Trong phương pháp này các điều kiện được lựa chọn sao cho các tế bào hoang dại có thể phát triển trong môi trường dinh dưỡng thiếu một axit amin nào đó và bị giết chết bằng pinicillin. Chúng ta đã biết, penicillin chỉ có tác dụng lên các tế bào đang sinh trưởng. Các tế bào cần các axit amin (tự dưỡng axit amin ) không sinh trưởng được cho nên sống sót. Đối với vi khuẩn không mẫn cảm với pinicillin thì dùng chất kháng sinh khác, ví dụ như: canamycin hay xycloxerin. Đối với nấm men thì dùng nystatin là thích hợp. Để phân lập những chủng có tính chất đặc biệt, ví dụ như chuyển hoá steroit, người ta dùng hỗn hợp của nhiều chủng vi sinh vật đem nuôi cấy trong cùng một môi trường có chất mà ta muốn thực hiện sự biến đổi. Sau khi nuôi ta chiết xuất và tách sản phẩm phân tích theo phương pháp sắc kí. 5.3.2. Tạo giống vi sinh vật công nghiệp. Các chủng được phân lập thu được ở phần trên được gọi là chủng nguyên thuỷ, chủng hoang dại, hay là chủng tự nhiên. Các chủng này chưa hẳn đáp ứng đầy đủ các yêu cầu dùng cho sản xuất công nghiệp. Thông thường các chủng này còn được nghiên cứu tuyển chọn tiếp để xác định các đặc tính sinh lý, sinh hoá và các điều kiện thích hợp để sao cho có hoạt tính cao và thực hiện được một quá trình lên men có tính kinh tế. Những chủng vi sinh vật nguyên thuỷ đặc biệt là các chủng có hoạt tính siêu tổng hợp - tổng hợp thừa các sản phẩm trao đổi chất bậc 1 và bậc 2 ( các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp có đặc điểm là không bền vững, thường hay bị biến đổi các tính chất ban đầu). Khi nhân tế bào nhân đôi thì liên kết nối giữa các purin và pyrimidin của AND cắt ra. Hai nửa phân tử này được làm khuôn để liên kết với hai phân nửa phân tử phụ khác gồm những purin, pirymidin, dezoxyriboza và photphat. Nếu có sự sai lệch xảy ra trong nửa mới đó của phân tử AND thì có thể tạo ra một nhân có thông tin di truyền sai lạc. Theo tính toán thống kê thì 1 triệu lần lặp lại có thể xảy ra một tế bào biến đổi có thể phát triển và tái sinh. Đó là một chủng mới - chủng biến đổi. Vì vậy trong công nghệ lên men, đặc biệt là lên men các sản phẩm siêu tổng hợp, không được dùng dịch ở một nồi đã lên men xong để làm giống cho một nồi khác.Vì lý do đó, mỗi mẻ lên men công nghiệp người ta tiến hành nhân giống từ các ống nghiệm với giống có hoạt lực cao, được lấy ra từ ống giống đông khô hoặc mới tiến hành chọn lại từ những mẻ lên men tốt gần trước đó. Bên cạnh những biến đổi này, những sai lệch di truyền quan trọng khác cũng có thể xảy ra trong tái sinh hữu tính. Những biến đổi tự nhiên xảy ra với tần số xấp xỉ 10-6 tạo ra những cá thể có đặc tính thực tế đáng chú ý hơn v.v...Vì thế việc gây ra đột biến để chọn lọc định hướng các chủng vi sinh vật công nghiệp thành vấn đề rất đáng quan tâm. Cần phải nhấn mạnh rằng, công việc phân lập các chủng vi sinh vật tự nhiên thường không đem lại kết quả như mong muốn, đặc biệt là các chủng sản sinh ra những sản phẩm trao đổi chất. Chỉ có khi nào các chủng phân lập được nghiên cứu làm đột biến một cách có hệ thống để nâng cao tần số đột biến, được chọn lọc trong phòng thí nghiệm về những khả năng nhất định thì mới có thể được những chủng có khả năng tổng hợp thừa với năng suất cao được dùng trong sản xuất công nghiệp. 5.3.3. Bảo quản giống vi sinh vật. Công tác bảo quản giống vi sinh vật có một ý nghĩa rất lớn trong mọi phòng nghiên cứu và trong công nghiệp vi sinh vật. Nó không chỉ đơn thuần giữ những chủng giống trên một vài môi trường dinh dưỡng thông thường và định kỳ cấy truyền, mà phải làm thế nào để giống sống sót và giữ được đặc tính ban đầu. Vì vậy công tác này tương đối phức tạp và khó khăn. Quá trình nghiên cứu đưa một chủng giống vi sinh vật có hoạt lực sinh tổng hợp cao vào sản xuất cần phải qua các bước như sau: phân lập và tuyển chọn giống, nghiên cứu ở điều kiện bán sản xuất và sản xuất công nghiệp. Ngay từ bước thứ nhất đã phải chú ý đến việc giữ giống sau khi phân lập được từ các mẫu đất, nước hoặc một cơ chất nào đó. Để tiến hành chọn giống cần đảm bảo hai yêu cầu: Giống có hoạt lực cao và ổn định với hoạt lực này trong một quy trình thích hợp. Ngay từ bước đầu tiên của quá trình lựa chọn đã phải giữ giống để phục vụ cho công tác nghiên cứu. Có thể nói rằng: công việc giữ giống liên quan tới mọi công tác nghiên cứu và trong mọi thời gian của các xí nghiệp dùng vi sinh vật. Nếu không giữ được những đặc điểm ban đầu của giống thì mọi thành quả thu được sẽ trở thành vô ích. Vì tầm quan trọng như vậy nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này có tầm cỡ quốc gia và đã thành lập các trung tâm, các chi nhánh giữ giống gọi là bảo tàng vi sinh vật. Nhiệm vụ của các bảo tàng vi sinh vật là: giữ được quần thể các tế bào giống sống sót với tỉ lệ cao và các tế bào này giữ được những đặc điểm ban đầu để phục vụ cho nghiên cứu hoặc sản xuất. Nhiệm vụ thứ nhất cần phải đạt được nhưng không phải tất cả giống vi sinh vật có khả năng sống là có thể giữ được những tính chất ban đầu. Thông thường một chủng giữ lâu trên một môi trường dinh dưỡng và cấy chuyển nhiều lần có thể có những biến đổi. Như vậy cần phải chọn chủng như thế nào để bảo quản mà trong thời gian giữ lâu mà thế hệ con cháu của nó không sinh ra đột biến. Người ta thường lựa chọn những tế bào cùng loại, về nguyên tắc khó gặp những thể đột biến, nhưng cũng có thể gặp phải sự xuất hiện hoặc tập trung thể đột biến ở chủng ban đầu. Cách lựa chọn chủng để bảo quản giống ban đầu hoặc giữ giống đã giữ một thời gian lâu qua cấy chuyền nhiều lần cần phải chọn lại để thuần giống như sau: + Cấy trên môi trường đặc để giống mọc thành những khuẩn lạc riêng rẽ. Cấy tiếp những khuẩn lạc này cho phát triển để kiểm tra sự thuần khiết. Không nên chỉ chọn một khuẩn lạc, hoặc cũng không thể lấy tất cả, mà cần phải chọn một số điển hình sao cho đảm bảo được tính đại diện, để tránh sự chọn lọc bất kỳ nào đó mà giống ban đầu có đặc điểm xấu. Sau khi đã chọn được những chủng cần phải tiến hành bảo quản ngay. Ngày nay có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. Phần nhiều những phương pháp này là giữ chủng giống ở trạng thái tiềm sinh (anabios) và định kỳ cấy chuyền trên môi trường thích hợp. Trong trạng thái tiềm sinh hầu như không xảy ra các quá trình sống hoặc với mức độ thấp. Bảo quản ở trạng thái này cho phép giữ được những tính chất quý ban đầu và sự mất mát có thể nhỏ nhất. Việc lựa chọn phương pháp bảo quản phụ thuộc vào khả năng của từng phòng thí nghiệm, khả năng sống của từng giống và sự ổn định di truyền của nó. Việc định tính và phân loại một vi sinh vật là rất khó khăn bởi vì khi cấy chuyền liên tiếp theo những phương pháp của vi sinh vật học cổ điển thường bao giờ cũng dẫn đến những biến đổi ít nhiều về đặc tính ban đầu ( mất khả năng sinh sản, biến đổi về hình thái, xuất hiện hoặc biến mất một vài bộ phận). Tính chất đặc hiệu của vi sinh vật bị biến đổi hay biến dạng khi đem nuôi cấy nhiều lượt, gây khó khăn lớn trong công nghiệp. Vì thế trong công nghiệp vi sinh người ta đã bỏ không dùng cách cấy chuyền nhiều lần như phương pháp cổ điển mà phải tìm những phương pháp thích hợp, ổn định được những đặc điểm, đồng thời bảo tồn được sức sống của chủng. Ngoài phương pháp giữ chủng vi sinh vật trên môi trường thạch dinh dưỡng ở nhiệt độ thấp hay được dùng nhất, người ta còn dùng nhiều phương pháp khác như : đông khô, giữ giống bào tử hoặc với dầu khoáng... Nhưng không có phương pháp nào là vạn năng cả, chỉ có qua kinh nghiệm mới xác định phương pháp nào là thích hợp nhất đối với chủng cần bảo quản. 5.3.3.1. Giữ giống vi sinh vật trên thạch Phương pháp này được dùng hầu như ở tất cả các phòng thí nghiệm trong lĩnh vực này, mặc dù nó không phải là phương pháp tốt nhất và rẻ nhất. Với phương pháp này phải định kỳ cấy chuyền trên môi trường mới, mất nhiều công sức và có thể dẫn tới sự thoái hoá giống hoặc mất hẳn tính chất ban đầu. Để khắc phục hoặc làm chậm quá trình biến dị giống trong bảo quản, cần thiết phải chọn chủng giữ giống thuần nhất kể cả tính di truyền và dùng các môi trường chọn lọc thích hợp có bổ sung các chất kích thích, giảm bớt các chất có tác dụng kìm hãm đến hoạt lực sinh tổng hợp của giống. Dùng chủng nuôi cấy ban đầu thuần khiết về tính di truyền sẽ giảm sự sai khác các quần thể của chủng và làm tăng tính ổn định. Với mục đích này người ta dùng phương pháp chọn những khuẩn lạc vi sinh vật đồng nhất có hoạt động sống cũng như hoạt lực sinh tổng hợp cao, ngoài ra còn có thể dùng những bào tử chủng đông nhất có tính di truyền trội như các khuẩn ty sinh dưỡng trẻ của xạ khuẩn, nấm mốc vào mục đích giữ giống và cấy chuyền. Dùng môi trường chọn lọc tạo điều kiện cho các dạng có hoạt lực cao phát triển, đồng thời ức chế sinh trưởng các dạng hoạt lực thấp. Một điều rất đơn giản nhưng cần phải nhấn mạnh: chính chất lượng thạch có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật. Nừu chỉ chú ý đến thành phần dinh dưỡng khác mà không chú ý đến chất lượng thạch thì chưa đủ và như vậy có thể giống phát triển kém, dẫn tới giảm hoạt lực. Trong quá trình bảo quản, đặc biệt là cấy chuyền nhiều lần trên các môi trường thạch giầu các chất hữu cơ (thạch - cao ngô; thạch - thịt - pepton; thạch - pepton - cao ngô; Thạch - cao nấm men v.v...) có thể bị nhiễm thực thể (phage) của chủng giống nhiễm thực khuẩn thể giống bị giảm hoặc bị mất hoạt lực, khả năng sinh trưởng kém, hoặc có thể bị phá huỷ hoàn toàn nếu không tìm được biện pháp thích hợp có thể đưa đến tình trạng mất giống. Để loại trừ thực khuẩn thể người ta cấy chủng giống trên những môi trường tổng hợp sau đó có thể cấy chuyền lại trên những môi trường giầu dinh dưỡng đặc trưng. 5.3.3.2. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng Kỹ thuật dùng dầu khoáng parafin do Lumiere và Chevrotier tìm ra năm 1914, ứng dụng cho các chủng dễ hỏng, như số lớn các vi khuẩn và nấm men cũng như tảo và nguyên sinh động vật. Lúc đầu chỉ dùng với các chủng gây bệnh, ngày nay phương pháp này được dùng trong kỹ thuật vi sinh. Giống trên môi trường thạch nghiêng thường được bảo quản ở 4 á 50C, ở điều kiện này vẫn xảy ra hiện tượng mất nước của môi trường làm cho môi trường khô dần và giống có thể bị chết. Để khắc phục hiện tượng khô môi trường ta làm cách mặt thạch với không khí bằng một lớp dầu khoáng (parafin hoặc các chất keo y học). Phương pháp này thực hiện như sau: chọn lọc trên môi trường đặc hoặc lỏng có pha dung dịch đệm để tránh bị axit hoá, sau đó nuôi cấy vi sinh vật trong những điều kiện tối ưu về nhiệt độ để thu được những vi sinh vật đang ở giai đoạn phát triển logarit hoặc thu được nhiều nha bào đã đạt tới thời kỳ chín, đối với loài sinh nha bào. Những môi trường thu được như thế được phủ một lớp dầu parafin dầy khoảng 10mm. Lớp dầu này làm cho nước không bay hơi nên nồng độ chất hoà tan không thay đổi, do đó áp suất thẩm thấu cũng không thay đổi nên không gây nguy hại đến đời sống của vi sinh vật. Mặt khác, lớp dầu chỉ cho phép oxy của không khí thấm rất chậm vào môi trường và việc cấy lại chủng không kéo theo sự phá huỷ chủng giống nguyên thuỷ. Những chủng được xử lý như trên, sau đó được giữ trong tủ lạnh ở 50C và có thể bảo quản trong nhiều năm. Chủng bảo quản được cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp rồi để chúng trong tủ ấm cho chúng phát triển rồi đổ vào các ống nghiệm giữ giống một lớp dầu khoáng vô trùng dầy 1 á 2cm. Gắn kín nút bông bằng parafin đặc. Giữ ở nhiệt độ trong phòng hoặc ở nhịêt độ 4 á 70C. Dưới lớp dầu khoáng chủng giống vẫn duy trì sự sống và các chủng hiếu khí vẫn sinh trưởng với tốc độ chậm, vì oxy không khí vẫn khuyếch tán vào môi trường. Vì vậy trong quá trình bảo quản vẫn có thể lấy giống để cấy chuyền hoặc sử dụng giống bằng cách dùng que cấy cắm qua lớp dầu và cấy chuyền giống vào môi trường mới mà không làm hỏng hiện trạng giống bảo quản. Cần phải giữ giống sao cho duy trì sự sống được tốt mà không tạo nên ưu thế sinh sản. Đối với từng chủng cần phải thử và chọn những môi trường giữ giống thích hợp. Nếu trong khi bảo quản hiện tượng sinh trưởng chậm môi trường dinh dưỡng cần có những chất dinh dưỡng dự trữ và không để tích tụ các axit mạnh. Như vậy có thể chọn những môi trường giầu chất protein với nồng độ tối thiểu. Phương pháp giữ giống với dầu khoáng tương đối thuận tiện và cho kết quả tốt. Giống dưới lớp dầu khoáng sau 12 tháng vẫn giữ được hình dáng bề ngoài bình thường. Phương pháp này được áp dụng rộng rãi để giữ nhiều loại vi sinh vật: 73% chủng nấm mốc, 100% chủng xạ khuẩn, 80% chủng nấm men, 74% chủng vi khuẩn. 5.3.3.3. Phương pháp lạnh đông và đông khô Phương pháp này dựa tren cơ sở ức chế vi sinh vật và được dùng rộng rãi để giữ chủng giống trong thời gian lâu dài. Trong trường hợp giữ giống ở nhiệt độ 4 á 60C bình thường thì không tránh khỏi sự phân chia tế bào. Sự phân chia tế bào chỉ dừng lại ở trường hợp lạnh đông hoặc lạnh đông kết hợp với sấy khô. Phương pháp lạnh đông tiến hành làm lạnh các môi trường có giống phát triển và giữ ở nhiệt độ lạnh sâu -15 á -200C; -20 á -300C; -30 á -400C... trong quá trình lạnh sâu các tế bào vi sinh vật có thể bị chết. Để khắc phục người ta phải tiến hành nhũ hoá môi trường và chú ý tốc độ làm lạnh. Trong quá trình lạnh đông ta cần phải chú ý những điểm sau: + Trước khi làm lạnh ta cần phải nhũ hoá vi sinh vật. Để tăng khả năng sống sót của chủng cần thêm những chất nhũ hoá, chất keo để bảo vệ hỗn hợp dịch, như: sữa, huyết thanh, lòng trắng trứng, pepton, muxin hay các loại đường. Chất làm nhũ hoá là dung dịch glyxerin 15% trong nước, huyết thanh ngựa bình thường không có chất bảo quản, dung dịch saccaroza 10% với gelatin1% có pH = 6,8 á7,0 hoặc các dung dịch chứa glucoza, lactoza có 10 á 30% sữa. v.v.... + Cho 1 á 2% nhũ dịch giống vào mỗi ống nghiệm để đảm bảo lạnh đều. + Khi làm lạnh tới -20, -250C hoặc thấp hơn phải giữ tốc độ làm lạnh không lớn hơn 1 á 20C/phút. Giữ các chủng giống lạnh đông cần phải quy định thời gian cấy chuyền: ở nhiệt độ -15 á -200C trong 6 tháng, ở nhiệt độ -300C trong 6 á 9 tháng, ở nhiệt độ -400C trong 1năm, ở nhiệt độ -50 á -600C trong 3 năm, ở nhiệt độ -70 á 800C trên dưới 10 năm. Khi làm tan băng để phục hồi giống cần phải rất nhanh bằng cách đặt ống lạnh đông trong nồi cách thuỷ 370C. Không nên làm đông lạnh và làm tan băng nhiều lần, như vậy sẽ làm giảm khả năng sống của chủng bảo quản. Làm đông khô, tức là nhanh chóng hạ tới -200C nhiệt độ của một thể tích hỗn hợp dịch chủng vi sinh vật đựng trong một ống thuỷ tinh có tiết diện nhỏ và làm khô nó trong chân không tới 1/20mmHg, đồng thời giữ hơi nước lại trong một “bẫy” không khí lỏng hay tuyết cacbonic. ống thuỷ tinh sau khi đã làm đông khô, được hàn kín trong chân không và bảo quản trong tủ lạnh từ 1 á 20 năm. Phương pháp này có nhiều thuận lợi. Sự phân huỷ các protein và các enzim của vi sinh vật được giảm tới mức tối thiểu nhờ sấy nhanh và tránh được nồng độ cao của các chất hoà tan trong dung dịch nhờ làm lạnh đột ngột. Sau cùng nhờ dùng chân không cao nên trong ống không còn oxy. Để tăng khả năng sống sót của chủng trong quá trình thao tác, người ta cho thêm những keo để bảo vệ vào hỗn dịch như: sữa, huyết thanh, lòng trắng trứng, pepton, muxin hay các loại đường. Thật vậy, trong quá trình làm đông khô một số lớn vi sinh vật bị chết, nhưng tỷ lệ của những vi sinh vật sống sót còn 5 đến 30%, khi cho nước vô khuẩn vào phẩm vật đã đông khô, thì phục hồi được môi trường chứa vi sinh vật, giữ nguyên vẹn được toàn bộ khả năng phát triển và những đặc tính trao đổi chất của vi sinh vật. Điều tai hại là những thao tác này đã huỷ mất chủng nguyên thuỷ. Phương pháp đông khô làm thăng hoa phần nước có trong môi trường nhũ hoá trong điều kiện chân không từ những nguyên liệu lạnh đông. Giống đông khô dễ dàng dùng cấy chuyển trong quá trình bảo quản. Sự biến tính protein của tế bào vi sinh vật. Trong đó kể cả sự phá huỷ của hệ thống enzim có thể coi là rất ít, ở mức thấp nhất, vì rằng quá trình đông khô rất nhanh. Nồng độ các muối và các chất hoà tan khác đã được nhũ hoá và sơ bộ làm đông lạnh, còn oxy thì hoàn toàn bị loại hoặc còn rất ít trong điều kiện chân không cao trong quá trình chuẩn bị giống và bảo quản. Những chất nhũ hoá giống trước khi làm đông khô cần phải có các yêu cầu sau: Đảm bảo cho môi trường giống sau khi đông khô là một khối đặc. Có chất bảo vệ giống cho khỏi bị khô quá mức ( dưới 1%). Có chất trung hoà nhóm cacbonyl. Chất nhũ hoá có thể dùng môi trường Mist-Desscans huyết thanh ngựa, hoặc dung dịch 10% sacaroza + 1% gelatin, hoặc các môi trường có pepton, sữa huyết thanh, axitamin, dextran, polyvinyl, pyrolidon, v.v... Cũng như các chất bảo vệ khỏi khô quá mức (sacaroza, glucoza, glutamat natri, v.v... ). Chủng làm đông khô là các chủng trưởng thành nhưng không già. Tốc độ làm lạnh lúc đầu ( từ -100C đến -200C) khoảng 1 á 30C/phút, sau đó có thể nâng lên 100C hoặc lớn hơn/phút. Khi làm khô lúc đầu giữ nhiệt nguyên liệu không quá -230C đến -250C và cuối cùng không cao hơn -300C á -450C. Không để làm tan băng khi sấy khô. Độ ẩm dư của giống đông khô khoảng 1 á 6%. 5.3.4. Các sản phẩm chính hình thành trong công nghiệp vi sinh vật. 5.3.4.1. Sinh khối. Quá trình nuôi cấy chủ yếu là sinh sản, phát triển các tế bào của giống vi sinh vật, các chất dinh dưỡng được chuyển hoá thành vật chất tế bào. Cơ chất Tế bào. Các dạng sản phẩm này có thể là: protein đơn bào ở dạng nấm men (nấm men chăn nuôi-các tế bào chết), nấm men bánh mỳ ( các tế bào sống), các tế b