Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym - Galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16

tử lượng cao khác thường dùng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel… Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH môi trường chỉ dùng đối với trường hợp của các enzym bền nhiệt hoặc bền axit. Dịch enzym được giữ ở 50 đến 700C hay ở pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác định sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa các protein ở một nồng độ muối (tính theo phần trăm nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzym. Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ. tuy nhiên phương pháp này chỉ dùng với những enzym ít bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ chọn dùng. Để giữ cho enzym khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (00C). Phương pháp hấp thụ chọn lọc được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym. Chất hấp thụ chủ yếu thường được dùng là hydroxyapatit cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao. Hấp thụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách là chất hấp thụ protein tạp hoặc hấp thụ enzym. Quá trình hấp thụ thường được tiến hành ở 00C. Enzym sau đó dược chiết bằng các dung môi thích hợp. Phương pháp sắc ký và trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hoặc dẫn xuất este của xelluloza. Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza (DEAE – xenlluloza) có ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còn có khả năng loại bỏ cả các tạp chất axit nucleic. Điều đó cho phép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixinsufat thường dùng trước đây. Sephadex là dẫn xuất của polysacarit dextran trong đó các phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang xuất hiện nhờ tác dụng của epiclohidrin tạo thành “sàng phân tử”. Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp một hỗn hợp gồm nhièu chất trên cột sephadex, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong cột, các phân tử có kích thước lớn không có khả năng đi vào sẽ được chiết ra khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của các chất trong hỗn hợp. Sự chênh lệch nhiều về phân tử lượng của các enzym (12.700 – 1.000.000 Da) cho phép tách và làm sạch enzym bằng phương pháp lọc gel sephadex là phương pháp có nhiều triển vọng [1]. Cho đến nay không có phương pháp tách và làm sạch chung cho mọi enzym. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzym nào đó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau. I.6. ỨNG DỤNG CỦA ENZYM b-GALACTOSIDAZA: I.6.1 Ứng dụng để thuỷ phân lactoza trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa: Enzym b-galactosidaza thuỷ phân các gốc b-galactosidaza tận cùng đều không khử của các b-D-galactosit thành các oligosaccarit bao gồm cả lactoza. Lactoza là disaccarrit bao gồm galactoza và glucoza, trong sữa bò nó chiếm khoảng 40% trọng lượng chất khô. Việc tách loại lactoza khỏi các sản phẩm thực phẩm là cần thiết đối với đại đa số người tiêu dùng - những người bị thiểu năng chuyển hoá lactoza với các triệu chứng đau bụng, khó tiêu khi dùng lactoza. Tuy nhiên, các sản phẩm thủy phân của lactoza bao gồm glucoza và galactoza đều dễ hấp thụ qua đường tiêu hoá và dễ đồng hoá. Lactoza trong sữa cũng có thể gây ra một số khó khăn trong quá trình chế biến phomat. Quá trình sản xuất phomat tạo ra một lượng lớn dịch sữa “whey” dưới dạng sản phẩm phụ, dịch sữa này chứa lactoza có sẵn trong sữa tự nhiên. Dịch sữa này là nguồn cacbonhydrat tốt và có tiềm năng lớn đối với lĩnh vực thực phẩm cũng như thức ăn gia súc. Vấn đề là lactoza không hoà tan hoàn toàn và có xu hướng kết tinh từ dung dịch này. Điều này làm cho việc vận chuyển dich sữa là khó khăn, đồng thời làm hạn chế việc tái sử dụng dịch sữa này, do vậy mỗi năm người ta phải đổ đi một lượng lớn dịch sữa. Lactoza có thể được thuỷ phân bằng cách sử dụng axit, song việc thuỷ phân bằng axit gây ra màu và làm tắc nghẽn nhựa trao đổi ion trong quá trình chế biến. Cách tốt hơn là sử dụng enzym b-galactosidaza. Enzym này đã được tìm thấy trong nhiều hệ vi sinh vật. Tuy nhiên để sử dụng cho mục đích này thì nấm men, nấm mốc và vi khuẩn vẫn là những nguồn khai thác thương mại chính. Một quá trình khả thi về mặt kỹ thuật và công nghệ khi sử dụng enzym này để thuỷ phân lactoza cũng cho phép sử dụng dịch sau đông tụ sữa chua hoặc dịch permeate, đồng thời hạn chế một số khó khăn về công nghệ như hiện tượng “lên cát” ở kem, hoặc hiện tượng tái kết tinh các sản phẩm từ sữa như dịch sau đông tụ phomat. Một trong những tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ sinh học của enzym b-galactosidaza là khả năng thuỷ phân lactoza – thành phần chính phụ của ngành công nghiệp chế biến sữa. Đặc biệt các nghiên cứu về lâm sàng đã cho thấy những người bệnh bị thiểu năng chuyển hoá lactoza có thể sử dụng các sản phẩm sữa đã qua thuỷ phân này, đồng thời làm giảm triệu chứng bệnh. Vì vậy, người ta mong muốn sản xuất ra sữa có hàm lượng lactoza thấp sao cho mọi người đều có thể dụng các sản phẩm từ nó. Việc lựa chọn công nghệ cho quá trình thuỷ phân tuỳ thuộc chủ yếu vào đặc tính và các chi phí sản xuất, tàng trữ và tiếp thị sản phẩm. Quy trình công nghệ khả thi bao gồm bổ sung trực tiếp enzym hoà, tan, tái tuần hoàn enzym hoà tan bằng quy trình màng hoặc sử dụng enzym cố định. Mặt khác, ở những phân xưởng nhỏ sản xuất các sản phẩm từ sữa cũng có thể sử dụng các sản phẩm enzym ở dưới dạng canh trường nuôi cấy một cách đơn giản. Vấn đề khó nhất khi sử dụng b-galactosidaza là khó đạt được thuỷ phân hoàn toàn vì 2 lý do sau: Enzym này là sản phẩm bị ức chế bởi glucoza được tạo ra trong quá trình phản ứng. Enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hoá tổng hợp các đồng phân liên kết b 1-6 của lactoza và các chất khác ngoài lactoza. Đối với mục đích sử dụng thuỷ phân lactoza các hướng chính hiện nay là: Sử dụng enzym cố định Có rất nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về sử dụng enzym b-galactosidaza cố định nhưng cho đến nay áp dụng nó vào quy mô công nghiệp vẫn gặp nhiều khó khăn. Enzym này được cố định trên một loạt các chất mang vô cơ, Shepadex, DEAE-xenllulose, thuỷ tinh xốp hoặc bẫy vào trong gel polyacrylamit… Enzym cố định được sử dụng cả trong các thiết bị phản ứng liên tục và gián đoạn [9]. Sử dụng ở dạng liposom sấy khô có chứa b-galactosidaza để thuỷ phân lactoza trong sữa. Liposom bao gồm một màng kép lipit giống như màng sinh học có khả năng ứng dụng rộng rãi trong y học. Enzym b-galactosidaza được thêm vào giữa dưới dạng các liposom sấy khô có khả năng thuỷ phân lactoza trong sữa nhờ sự phân giải liposom với sự có mặt của các muối hoá trị 2 và được hoàn nguyên gần như hoàn toàn bằng cách hydrat hoá lại [10]. Sử dụng vi sinh vật chịu nhiệt để sinh tổng hợp nên enzym có tính bền nhiệt cao có thể sử dụng trong các quá trình chế biến đòi hỏi nhiệt độ cao. Hạn chế lớn nhất của các enzym này là để vô hoạt enzym sau quá trình chế biến cần phải gia nhiệt ở nhiệt độ cao, điều này đôi khi dẫn đến chất lượng sản phẩm thay đổi. Sử dụng vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp để sinh tổng hợp enzym có khả năng ở nhiệt độ thấp. Người ta mong muốn các enzym hoạt động ở nhiệt độ thấp này có phân tử linh động hơn, cho phép biến đổi thuận nghịch về cấu tạo nhằm tạo điều kiện cho hoạt động xúc tác. Tính linh động hơn về cấu trúc cũng khiến cho enzym này nhạy đối với sự phá huỷ bởi nhiệt và hóa chất. Các enzym này cũng góp phần đáng kể trong việc nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và sự ổn định của các phân tử protein. Khi sản xuất các enzym này thì công nghệ tách cần phải thực hiện trong các điều kiện nhẹ nhàng và giảm thiểu số bớt tinh chế nhằm hạn chế sự hao hụt enzym [8]. 1.6.2 Sử dụng phản ứng chuyển hoá galactozyl tạo ra các oligosacarit từ lactoza: Oligosaccharid còn được gọi là galactoligosacchatit (GO), là sản phẩm của chuyển hoá nội phân tử. Trong những thập kỷ qua người ta đã phát hiện ra GO có tác dụng tốt đối với sức khoẻ con người, GO có khả năng chống lại được chất gây ung thư, giảm lượng cholesterol và tốt cho đường ruột, GO còn được sử dụng làm chất tạo ngọt, chất hoà tan… Vì vậy nó được dùng làm nguyên liệu thực phẩm. Để có sản phẩm GO lactoza, rất nhiều thử nghiệm được nghiên cứu trên những vi sinh vật có khả năng sinh GO cao hoặc enzym b-galactosidaza có hoạt tính chuyển hoá galatozyl cao. Ngày nay, có rất nhiều loài vi sinh vật được tìm thấy có khả năng sinh enzym có thể chuyển hoá galatozyl cao như là Bacillus circulans, Steptococcus thermophuluss, Aspergillus oryzae. Những tế bào nấm men và vi khuẩn lactic cũng có thể sinh enzym chuyển hoá lactoza thành GO [12]. Vào những năm 1950 phát hiện oligosaccharid được hình thành trong quá trình thuỷ phân nhờ enzym b-galactosidaza. Có 12 loại oligosaccharid được tạo thành tuỳ thuộc vào nguồn enzym và cấu trúc của các oligosaccharid đó đã được các nhà khoa học phân tích. Nakanishi đã đưa giả thiết sự tổng hợp oligosaccharid nhờ phản ứng chuyển hoá glycozyl từ enzym b-galactosidaza của vi khuẩn Bacillus circulans, nhưng ông vẫn chưa đưa ra được cấu trúc của các oligosaccharid đó. Xa hơn, Usui et al. đã chỉ ra sự chuyển hoá đặc hiệu mối liên kết b-(1-4) galatozyl-disaccharit nhờ enzym b-galactosidaza từ Bacillus circulans. Có 11 oligosaccharit tạo ra nhờ enzym b-galactosidaza của vi khuẩn Bacillus circulans với cơ chất là lactoza đã được phát hiện và làm sáng tỏ. việc Việc điều tra nghiên cứu cấu trúc của các galatoligosaccharit nhờ phản ứng chuyển hoá glycozyl của enzym b-galactosidaza từ vi khuẩn Bacillus circulans sử dụng pNP-galactoza như là một chất cho galatozyl và glucoza như một chất nhận đã được nghiên cứu. I.6.3 Sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ nghệ protein: Enzym b-galactosidaza là enzym xúc tác cho quá trình thuỷ phân và chuyển hoá các gốc b-D-galactozyl. Các gen b-galactosidaza đã được tạo dòng và tách chiết từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Chúng có những cấu trúc bậc một, cáu trúc bậc bốn, khối lượng phân tử, tính đặc hiệu cơ chất và tính đặc hiệu xúc tác khác nhau rõ rệt. Chúng được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến do khả năng ứng dụng rộng rãi làm các gen thông báo trong nhiều hệ thống, chúng thường liên quan đến các bệnh di truyền của người như bệnh GMY-gangliosidosis và bệnh Morquio typ B. Kỹ nghệ Protein là một lĩnh vực cực kỳ phát triển nhằm tạo ra các protein đa chức năng, tạo ra các dạng đột biến của enzym với các đặc tính tốt và số lượng ngày một gia tăng. Enzym b-galactosidaza từ E.coli từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi làm các maker phân tử. Bằng cách cài cho phép xác định rõ vị trí dung nạp đối với sự điều tiết của các peptit chức năng lạ và sự biểu hiện của chúng trên bề mặt tiếp xúc với dung dịch của enzym có hoạt tính. Hơn nữa việc định vị peptit kháng thể từ virut trên vòng hoạt hoá của b-galactosidaza tạo ra một phân tử cảm biến nhằm phát hiện định tính các kháng thể đặc hiệu. Việc gắn kết của enzym này với huyết thanh hoặc kháng thể đơn dòng được cho là ngăn chặn sự cài gắn peptit. Hoạt tính được phục hồi này có thể được xác định một cách chính xác, nhanh chóng và dễ dàng bằng phương pháp so màu quang phổ. Vì các lý do trên, b-galactosidaza trước đây được gọi là phosphataza kiềm có thể trở thành nền tảng cho một thế hệ phân tử cảm ứng mới từ enzym . I.7. NGUỒN THU TỪ ENZYM CÔNG NGHIỆP TRONG TƯƠNG LAI: Mặc dù việc sản xuất và ứng dụng b-galactosidaza ngày một phát triển, người ta vẫn cố gắng giảm chi phí sản xuất, tối thiểu hoá lượng enzym cần sử dụng, nhưng nâng cao tốc độ và hiệu suất thuỷ phân. Nguồn enzym trong tương lai sẽ là enzym được sử dụng ở dạng vi năng, enzym được cải biến bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp di truyền đối với chủng vi sinh vật tổng hợp nên nó. I.8. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYM b-GALACTOSIDAZA TRONG TƯƠNG LAI: Do tầm quan trọng của enzym b-galactosidaza trong các quá trình sinh học, trong các ứng dụng trị liệu và chế biến thực phẩm nên việc đánh gia và tối ưu hoá phương pháp tổng hợp nhằm tạo ra phương pháp đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả là mục tiêu của các nhà sản xuất và nghiên cứu. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tổng hợp nên các oligosaccarit mới có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Các glicoprotein chứa duy nhất một loại gốc đường tham gia vào việc xác định loại nhóm máu, đóng vai trò trong các bệnh truyền nhiễm virut và nhiễm khuẩn, chịu trách nhiệm đối với các nhận biết tế bào – tế bào, nằm trên các vị trí thụ thể tế bào. Các galactozit có thể được sử dụng làm phụ gia thực phẩm với nhiều mục đích, chức năng khác nhau như làm chất tạo ngọt, chất ổn định, chất hoà tan… Trong tương lai, các ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm và y học tập trung vào các quá trình chuyển hoá galatozyl nhằm tổng hợp nên các hợp chất chức năng duy nhất bằng cách thêm vào các phần tử nhận. PHẦN II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 NGUYÊN LIỆU: II.1.1 Môi trường nuôi cấy, phân lập: II.1.1.1 Môi trường thạch dùng để phân lập (môi trường Lactoza-Broth): Thành phần: Cao thịt bò: 3g Pepton: 5g Lactoza: 5g Agar: 15 ¸ 20g Nước thêm đạt 1000 ml Thanh trùng ở 110oC/ 30 phút II.1.1.2 Môi trường nuôi cấy cơ bản (môi trường Lactoza): Lactoza: 20g Pepton: 3g NaCo3: 3g KCl: 0.5g MgSO4.7H2O: 0.5g KH2PO4: 0.1g FeSO4.7 H2O: 0.01g ZnSO4.7H2O: 0.01g CuSO4.5H2O: 0.005g Nước thêm đạt 1000 ml Thanh trùng ở 110oC/ 30 phút Môi trường thạch dùng để cấy chuyền và giữ giống còn có thêm Agar-Agar với hàm lượng 15 ¸ 20g/lít môi trường. II.2 HOÁ CHẤT: II.2.1 Nguồn Cacbon: - Nguồn cacbon sử dụng Lactoza, Glucoza, Saccaroza. II.2.2 Nguồn Nitơ: - Nguồn Nitơ vô cơ sử dụng: NaNO3, (NH4)2SO4. - Nguồn Nitơ hữu cơ sử dụng: Pepton, cao thịt bò. II.2.3 Các hoá chất khác: - Cơ chất ONPG (o-nitrophenil-b-D-galactopyranoside): sản phẩm của hãng Sigma Alrich-Germany. - Thuốc thử X-Gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-b-D-galactoside): sản phẩm của hãng USBTM- Italia. - Clorofrom tinh khiết. - Dung dịch SDS (sodium dodecyl sunfate): 0.1%. - Dung dịch Na2C03. 1M. - 2-mecaptoetanol. - Các hoá chất khác. Ghi chú: Tất cả các hoá chất phân tích đều là hoá chất tinh khiết. II.3 THIẾT BỊ: - Kính hiển vi Nikon eclipse E800, camera Fujix Digital HC-300Zi, Japan. - Thiết bị so màu quang phổ Ultrospecâ 2000, Amersham pharmacia biotech, Germany. - Máy ly tâm lạnh Allegra TM 64R Centrifuge-Beckman, Germany. - Máy ly tâm thường EBA 20 – Hettich zentrifugen, Germany. - Máy ly tâm eppendof IK15 – Sigma laborzentrifugen 1999, Germany. - Thiết bị siêu âm phá vỡ tế bào. - Tủ nuôi ổn nhiệt B12 Heracus-Kendo laboratory Products. - Thiết bị hấp tiệt trùng Medizinische Geratefabrik, Berlin. - Máy nuôi cấy ổn nhiệt Shaking incubator, Korea. - Máy đo pH MP 220 – Mettler Toledo. II.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ: II.4.1 Nhuộm gram: [2] Với phương pháp nhuộm này, người ta có thể phân biệt sự khác nhau giữa hai loại vi sinh vật giống nhau về hình thái và kích thước. Nguyên nhân của hiện tượng này là do cấu tạo hoá học của những vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có nhiều giả thiết về cơ chế nhuộm gram (giả thuyết về điểm đẳng điện, cấu tạo tế bào, thành phần hoá học… ). Nhưng cho đến nay, giả thuyết về cấu tạo hoá học vẫn được chấp nhận tuyệt đối hơn cả. Thuyết này cho rằng khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan tới muối magiê của axit ribonucleic. Khi nhuộm màu phức tạp (nhuộm gram) muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại triphenymetan (như gential violet, kristal violet hoặc metyl violet…) chịu được tác dụng của cồn, nghĩa là không mất màu dưới tác dụng của cồn. Những vi sinh vật có tính chất này gọi là vi sinh vật gram dương. Ngược lại những vi sinh vật không giữ màu khi xử lý bằng cồn là vi sinh vật gram âm. Đây là một trong những đặc điểm quan trọng trong việc phân loại vi sinh vật. Dựa vào khả năng nhuộm màu gram của vi sinh vật mà người ta chia chúng ra thành 2 nhóm: - Vi sinh vật gram dương (G+): gồm hầu hết các loại cầu khuẩn, trực khuẩn hiếu khí có nha bào; Vi sinh vật gram âm (G-): gồm vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn axetic. Hoá chất: + Dung dịch tím gential + Dung dịch lugol + Cồn 950 + Dung dịch fucsin + Dầu séc + Toluen Tiến hành: + Làm tiêu bản vi sinh vật, cố định vết bôi + Nhuộm bằng tím gential (gential violet): nhỏ tím gential lên vết bôi, giữ trong 1-2 phút rồi đổ hết thuốc nhuộm đi. + Nhuộm bằng dung dịch lugol: nhỏ lugol lên tiêu bản, để trong 1 phút rồi đổ thuốc nhuộm đi. + Rửa bằng cồn 950 trong 30 giây. + Rửa lại bằng nước rồi làm khô vết bôi bưàng sứa nóng đèn cồn. + Nhuộm bổ sung bằng fucsin trong 1 phúỏngồi rửa lại bằng nước, đợi khô sau đó đem quan sát. Tế bào vi sinh vật nhuộm gram dương bắt màu tím, còn gram âm bắt màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung [2]. II.4.2 Xác định tính enzym b-galactosidaza bằng chỉ thị X-Gal [15]: Sự có mặt của b-galactosidaza được xác định dựa trên nguyên tắc sau: b-galactosidaza thuỷ phân X-Gal hình thành nên kết tủa màu xanh Blue kiểu indigo. Vì vậy vi khuẩn dương tính với enzym này tạo khuẩn lạc màu xanh khi nuôi cấy với sự có mặt của chỉ thị X-Gal. X-Gal được hoà tan trong dimethylformamide ở nồng độ 20 mg/ml. Dung dịch gốc này phải được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 40C. Môi trường thạch dùng để cấy hoặc phân lập bình thường được hấp vô trùng và làm nguội đến nhiệt độ khoảng 550C, sau đó thêm chỉ thị X-Gal vào đến nồng độ cuối là 4 mg/ml (dung dịch gốc pha loãng 500 lần). Cần chú ý không thêm chỉ thị X-Gal vào khi nhiệt độ môi trường lớn hơn 550C do tại nhiệt độ lớn hơn 550C chỉ thị này không bền và sẽ bị phân huỷ. Đĩa thạch chỉ thị này được dùng để nuôi vi khuẩn. Sau một thời gian nuôi cấy (tùy thuộc vào đặc tính của mỗi chủng riêng biệt), các chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có màu xanh trên đĩa chỉ thị là chủng có khả năng sinh tổng hợp enzym b-galactosidaza. Cần chú ý là các đĩa thạch sau khi đã thêm chất chỉ thị phải được bảo quản trong tối ở 4oC và chỉ dùng được trong khoảng thời gian là 1 tháng. II.4.3 Xác định hoạt độ enzym b-galactosidaza nội bào [9]: Hoá chất: - Dung dịch đệm Z (pha cho 1 lít, bảo quản ở 40C vô hạn định), thành phần trong dung dịch đệm Z là như sau: + Na2HPO4 0,06M (ở dạng ngậm 12H2O, phân tử lượng là 358,14) + NaH2PO4 0,04M (ở dạng ngậm 2H2O, phân tử lượng là 156.01) + KCL 0,01M + MgSO4 0.001M Dung dịch đệm Z được pha trong nước, trước khi sử dụng thêm 2- mercaptoetanol với hàm lượng 0,27 ml 2- mercaptoetanol/100ml dung dịch đệm. - Dung dịch Na2CO3 1M (bảo quản vô hạn định ở nhiệt độ phòng) - Dung dịch cơ chất ONPG. - Dung dịch đệm phosphat 0,1M, pH = 7,0 có thành phần như sau: Na2HPO4.7H2O 0,06M NaH2PO4.H2O 0,04M Điều chỉnh đến pH 7,0 bằng NaOH hoặc H3PO4. Dung dịch này ổn định ở nhiệt độ phòng và không cần phải pha mới hàng ngày. Dung dịch cơ chất nồng độ 4 mg/ml được pha trong đệm photphat 0,1M, pH 7,0 nêu trên, được lọc và bảo quản ở 40C cho đến khi bắt đầu ngả sang màu vàng. tốt hơn là dung dịch cơ chất này được pha mới hàng ngày. - Dung dịch SDS 0.1% - Dung dịch clorofom tinh khiết. Thiết bị và dụng cụ: - Thiết bị li tâm - Thiết bị so màu quang phổ - Thiết bị ổn nhiệt - Các dụng cụ khác Tiến hành: - Chuẩn bị sinh khối vi sinh vật: + Ly tâm ít nhất 2ml dịch nuôi cấy vi sinh vật, quá trình ly tâm ở 40C với tốc độ 6000 vòng/phút. + Loại bỏ phần dịch trong, phần cặn bã được tái tạo huyền phù bằng cùng một thể tích dung dịch đệm Z đã làm lạnh. - Đo độ hấp thụ OD tại 600nm với mẫu trắng lá dung dịch đệm Z. - Pha loãng dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật bằng dung dịch đệm Z, tuỳ thuộc vào hoạt độ của enzym trong mẫu dịch nuôi cấy vi sinh vật mà cần pha loãng ở các tỷ lệ nhất định. - Làm tăng tính thấm của các tế bào vi sinh vật đã pha loãng này bằng cách thêm 100 ml Cloroform và 50 ml dung dịch SDS 0,1% vào 1ml huyền phù đã pha loãng ở trên. - Lắc đều và để ổn định ở 280C trong 5 phút. Phân tích: - Bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 0,2 ml dung dịch cơ chất ONPG ở trên vào mẫu thí nghiệm. - Giữ mẫu ở 280C cho đến khi thấy xuất hiện màu vàng tương tự như màu của màu dịch chiết bò thì dừng phản ứng enzym và đọc thời gian phản ứng tính từ lúc thêm dung dịch cơ chất. - Dừng phản ứng enzym bằng cách thêm vào 0,5 ml dung dịch Na2CO3 1M. - Đọc mật độ quang tại 420 nm và 550 nm vỡi mẫu trắng có thành phần giống như mẫu phân tích nhưng thứ tự thêm cơ chất và thêm chất dừng phản ứng là ngược nhau, nghĩa là ban đầu thêm chất dừng phản ứng, thêm tiếp cơ chất rồi mới ủ ở 280C. Tính kết quả: Tính toán số đơn vị hoạt độ có trong 1 ml dịch nuôi cấy theo công thức sau: 1000 (OD420 – 1,75.OD550) E = V.T.OD600 Trong đó: E: Hoạt độ enzym (MU/ml) V: thể tích của mẫu đem phản ứng (ml) T: thời gian phản ứng (phút) OD420 và OD550: giá trị đo mật độ quang của dung dịch mẫu mẫu sau phản ứng ở các bước sóng 420 nm và 550 nm so với mẫu trắng. OD600: giá trị mật độ quang của dịch mẫu ở bước sóng 600 nm với mẫu trắng là dung dịch đệm Z. II.4.4 Xác định hoạt độ enzym b-galactosidaza ngoại bào [9 ] Xác định hoạt độ enzym b-galactosidaza ngoại bào trong mẫu dịch lên men bằng phương pháp tương tự như trên, chỉ khác ở những điểm sau: Chuẩn bị mẫu: - Mẫu dùng xác định là dịch lên men đem ly tâm ở nhiệt độ 40C, tốc độ 8000 vóng/phút để thu lấy dịch trong. - Pha loãng mẫu bằng dung dịch đệm Z (không cần bước tăng tính thấm của thành tế bào bằng Cloroform và SDS). - Lắc đều và để ổn định ở 280C trong 5 phút. Phân tích: - Các bước phân tích tương tự như trên, chỉ khác là không cần xác định giá trị mật độ quang tại các bước sóng 550 và 600 nm do dịch mẫu phân tích là dịch trong hoàn toàn. Tính toán kết quả: Tính kết quả như sau (đơn vị: MU/ml): 1000. OD420 E = V.T Trong đó: E: Hoạt độ enzym (MU/ml) OD420: Giá trị mật độ quang tại bước sóng 420 nm V: Thể tích thực của mẫu đem phản ứng (ml) T: Thời gian phản ứng (phút) PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1 VÀI NÉT VỀ CHỦNG VI KHUẨN SỬ DỤNG: Nguồn gốc: Đây là chủng vi khuẩn được phân lập từ nguồn sữa chua tại trường Đại học Bách khoa Hà Nội, mang ký hiệu BK16. Tên khoa học: Sphingomonas paucimobilis BK16. Đặc điểm tế bào: Gram âm, kích thước khuẩn lạc 2 mm. Hình 3: Chủng S. paucimobilis BK16 (độ phóng đại 1000 lần) Hình 4: Hình thái khuẩn lạc S. paucimobilis BK16 khi nuôi trên mô hình thạch III.2. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỒNG HOÁ CÁC NGUỒN CACBON KHÁC NHAU: Tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chủng BK16 trên các nguồn cacbon: lactoza, glucoza và saccroza với hàm lượng 20g/l. Các thành phần khác của môi trường nuôi cấy giống như môi trường cơ bản. Kết quả được thể hiện ở bảng sau: Bảng 2: Sự thay đổi mật độ tế bào khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 OD 600 nm Lactoza 0.434 0.922 1.441 1.640 1.627 1.604 1.574 Glucoza 0.336 0.492 0.894 1.007 1.003 0.940 0.747 Saccaroza 0.346 0.680 1.108 1.054 1.002 0.892 0.874 Hình 5: Sự thay đổi mật độ tế bào khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Nhận xét: - Trên tất cả các nguồn cacbon, pha logarit đều nằm trong khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 36. - Mật độ tế bào bắt đầu giảm từ giờ thứ 60 sau khi cấy giống. - Chủng BK16 có khả năng phát triển mạnh với nguồn cacbon là lactoza. Trên nguồn cacbon là glucoza chủng này kém phát triển. Bảng 3: Sự thay đổi hoạt độ enzym khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 Hoạt độ enzym (mU/ml) Lactoza 15.12 235.8 343.85 393.39 383.76 257.79 153.45 Glucoza 0 5.78 12.95 30.42 23.31 12.57 0 Saccaroza 0 4.02 20.85 37.99 71.40 48.54 15.57 Hình 6: Sự thay đổi hoạt độ enzym khi nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Nhận xét: - Chủng BK16 có khả năng sinh tổng hợp enzym b-Galactosidaza cao nhất trên nguồn cacbon lactoza, khả năng sinh tổng hợp enzym trên các nguồn cacbon còn lại là thấp đặc biệt là trên nguồn cacbon glucoza. Vì vậy chúng tôi chọn nguồn cacbon lactoza làm môi trường để nuôi sinh tổng hợp enzym b-Galactosidaza. III.3 KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI PH, MẬT ĐỘ TẾ BÀO, HOẠT ĐỘ ENYM CỦA CHỦNG S.PAUCIMOBILIS BK16 TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN: Nguồn cacbon: lactoza. Giống trước khi cấy được hoạt hoá trong ống nghiệm chứa 10ml dịch có thành phần giống như môi trường lên men ở 300C trong 24 giờ. Nhiệt độ nuôi cấy 300C. Tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau mỗi khoảng thời gian 12 giờ lấy mẫu một lần, đem xác định giá trị pH, mật độ tế bào, hoạt độ enzym nội bào. Bảng 4: Sự thay đổi pH của chủng S.paucimobilis BK16 trong quá trình lên men: Thời gian (h) 6 12 24 36 48 60 72 pH 4.83 4