Khóa luận Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái cây hoa huệ hương (Polianthes tuberose L.) in vitro

n loại đất hơi kiềm (pH = 6 - 7), có cấu trúc mịn, giữ ẩm tốt. Tuy vậy, cây hoa Huệ Hương không thích hợp ở nơi quá trũng, chua. Cây hoa Huệ Hương có thể trồng trên các loại đất có thành phần cơ giới sau: - Đất cát pha có độ tơi xốp cao, độ hổng lớn, thoáng khí, ngấm nước tốt nhưng có độ phì kém. Do đó, khi trồng hoa Huệ Hương trên loại đất này cần phải bón nhiều phân hữu cơ để bổ sung dinh dưỡng cho cây. - Đất thịt nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng là loại đất trồng thích hợp đối với cây hoa Huệ Hương. Nếu đất quá ẩm, rễ rất dễ bị thối, vì thế vào mùa mưa cần chống úng, tháo nước kịp thời không để ruộng bị ngập úng. Mặc khác hoa Huệ Hương cũng là cây rất mẫn cảm với các loại muối kim loại nặng. Đặc biệt là loại đất có hàm lượng chì cao, rễ cây sinh trưởng kém, cây phát triển chậm và khả năng ra hoa kém. Chính vì vậy trước khi trồng hoa huệ cần chú ý đến các biện pháp canh tác đất. 1.8.5. Kỹ thuật trồng và chăm sóc 1.8.5.1. Chuẩn bị giống Theo phương pháp canh tác truyền thống, cây huệ trồng bằng củ, vì vậy khi cây có nhiều lá úa vàng thì bới củ, tách nhẹ nhàng từng củ, chọn những củ có kích thước đạt tiêu chuẩn sau đó cắt bỏ lá và rễ tiến hành phơi nắng 2 - 3 ngày cho lá héo rồi đem bảo quản nơi thoáng mát, cao ráo, sau 2 - 3 tháng có thể đem trồng trở lại. Trong thời gian bảo quản nên thường xuyên kiểm tra tránh hiện tượng củ bị thối. Trong những năm gần đây, xuất hiện bệnh chai bông trên diện rộng, vì vậy để phòng trừ bệnh chai bông trên cây hoa Huệ Hương cần tiến hành các bước sau: - Không sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc lấy củ từ những ruộng đã bị nhiễm bệnh trước đó làm củ giống. - Phơi củ trong vòng 1 - 1,5 tháng trước khi đem ra trồng. - Nên thay đổi chân đất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây hoa Huệ Hương với một loại cây trồng khác. - Khi phát hiện thấy có triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi ruộng, phơi khô và đốt bỏ. Khi không có củ giống sạch bệnh, có thể chọn củ ở cây không có triệu chứng bệnh và tiến hành phơi nắng kĩ từ 1-1,5 tháng, sau đó xử lý củ với nước nóng khoảng 56 - 57oC. Quy trình xử lý củ Huệ Hương bằng nước nóng để phòng trừ bệnh chai bông gồm các bước sau: - Bước 1: Chuẩn bị củ Huệ Hương để xử lý. Sau khi thu hoạch, đem phơi củ trong 1 - 1,5 tháng, chọn những củ có đường kính từ 3 cm trở lên để xử lý. - Bước 2: Xử lý củ Huệ Hương bằng nước nóng. Đổ nước nóng và nước lạnh vào trong một thùng nhựa với tỷ lệ 6:5, rồi điều chỉnh để nhiệt độ nước trong thùng khoảng 56 - 57oC thì bắt đầu cho củ vào nước. Lượng nước xử lý cần gấp 6 - 7 lần lượng củ xử lý. Sau đó đậy nắp thùng khoảng 15 phút và lại chỉnh cho nước trở lại nhiệt độ 56 - 57oC bằng cách đổ thêm một ít nước sôi từ từ khuấy đều, và ngâm củ trong thùng đậy kín trong 15 phút nữa. - Bước 3: Sau khi xử lý xong, củ được rải đều và phơi khô trong 2 ngày sau rồi đem trồng ra ruộng. 1.8.5.2. Chuẩn bị đất Nên chọn nơi trảng nắng, luống trồng liên tiếp rộng khoảng 1,2 m và sâu 0,5m để có thể giữ nước tốt. Luống đất nên bố trí dọc theo hướng mặt trời để cây nhận ánh sáng tốt và đồng đều. Trước khi trồng nên bón phân lót và phun xịt các loại thuốc diệt nấm và mầm bệnh. 1.8.5.3. Chăm sóc Trong canh tác cây hoa Huệ Hương yếu cầu về nước rất là quan trọng, phải thường xuyên tưới nước đồng thời phải xớt đất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát triển tốt. Phân bón thường sử dụng để bón cho cây là hỗn hợp (Ure, lân và Kali), sau khi trồng được khoảng 2 - 3 năm cây hoa Huệ Hương bắt đầu bị thoái hóa: sinh trưởng chậm, cho hoa ít và chất lượng kém. Do đó phải nhổ lên phân loại củ và trồng lại trên một diện tích khác. Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới đất, bón phân, tưới nước, phun thuốc…, thường xuyên để tránh lây lam nguồn sâu bệnh hại. Khi trừ cỏ phải tiến hành theo nguyên tắc trừ sớm, trừ khi cỏ còn non và trừ sạch, có thể trừ cỏ bằng tay hoặc bằng thuốc. Trong quá trình trồng, nên bón phân với số lượng ít và chia thành nhiều đợt như bón lót, bón thúc. Ngoài cách bón vào đất còn có thể phun lên lá để bổ sung dinh dưỡng, hỗ trợ cho quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa. Trong thời kì phân hóa mầm hoa cần bón thêm phân đạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bón thêm lân và kali. 1.8.6. Vấn đề sâu bệnh trên cây hoa Huệ Hương Trên cây hoa Huệ Hương, sâu thường gặp là rệp sáp, nhện đỏ và nhất là tuyến trùng. Bệnh gây hại trên cây hoa Huệ Hương được chia thành hai nhóm: - Nhóm bệnh không truyền nhiễm, do ngoại cảnh không phù hợp thường gặp nhất là thối xám, thối gốc, đốm lá, gỉ sắt… có thể phòng trị bằng các loại thuốc hóa học. - Nhóm bệnh truyền nhiễm chủ yếu là do vi sinh vật ký sinh gây ra bao gồm : vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus,… thường rất khó trị, nhất là bệnh do virus gây ra rất dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm trọng và truyền từ đời này sang đời khác, đặc biệt là ở nhóm cây nhân giống vô sinh (bằng củ) như cây huệ. Virus không thể phòng chống hay tiêu diệt bằng hóa chất như vi khuẩn, nấm,, sâu bệnh, cách duy nhất để loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khỏe mạnh. Vì vậy, biện pháp làm sạch virus phải luôn được kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh. Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa Huệ Hương thường bị nhện đỏ phá hại nặng trên lá, từ 3 - 4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể phòng trị bằng các loại thuốc sau : Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H. Khoảng tháng 9 - 10, khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì có thể khắc phục hiện tượng này bằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol… 1.8.7. Giá trị kinh tế Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt đới như ở nước ta đồng thời yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên Huệ Hương được trồng khá phổ biến và đem lại thu nhập rất cao cho người dân. Trong những năm gần đây, cây hoa Huệ Hương đem lại thu nhập cao cho người dân các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Đồng Tháp… Đặc biệt, tại các tỉnh Nam Trung Bộ như Bình Định, Khánh Hòa, từ khu người dân mở rộng diện tích và nâng cao kỹ thuật canh tác, cây hoa huệ đã trở thành cây trồng chính, đem lại thu nhập cao và trở thành cây xóa đói giảm nghèo. Hiện nay, thu nhập từ cây hoa Huệ Hương ở đồng bằng song Cửu Long bình quân từ 150 - 200 triệu/ha và ở Nam Trung Bộ là 80 - 150 triệu/ha. Ngoài giá trị sử dụng thông thường như trên, gần đây người ta còn sử dụng một số bộ phận của cây làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm. Hiện nay, một số nghiên cứu về loài hoa này đã tìm ra một số thành phần hóa học có liên quan đến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý… được chiết xuất từ các bộ phận như hoa, sáp hoa… trong đó loại tinh dầu tuyệt đối thu được khi chiết xuất từ hoa như alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metal (4,5%), antranilat metal (8,0%), metilisoeugenol (10%), benzoate benzil (24%). Ngoài ra, n-alkan chiếm tỷ lệ không nhỏ tới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hóa học quan trọng trong việc chế xuất các loại nước hoa, dầu thơm. Bên cạnh đó, cây hoa Huệ Hương còn có công dụng trong y học, bộ phận được sử dụng là củ. Trong tinh dầu củ huệ có chứa thành phần sapogenin, sapogenin bao gồm hecogenin, tigogenin là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế ra một số loại thuốc quý. Từ lâu trong nhân gian người dân đã biết sử dụng cây hoa Huệ Hương để làm thuốc chữa một số bệnh đơn giản. Ở Ấn Độ người ta đã dùng củ phơi khô, tán thành bột để làm thuốc trị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi đây đã dùng củ để chữa bệnh sốt rét. Ở một số nơi, dân gian còn dùng củ để chữa bệnh hóc xương bằng cách đem giã nát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hóc xương sau 1 - 2 phút sẽ khỏi. 1.9. Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước Du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước, nhưng cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến hơn cả ở miền Nam và Nam Trung Bộ. Trong những năm gần đây, diện tích canh tác cây hoa Huệ Hương ngày càng được mở rộng và đem lại thu nhập cao cho người trồng. Theo thống kê hiện nay, trên địa bàn các tỉnh Đồng bằng song Cửu Long có diện tích trồng huệ lớn hơn cả. Trung bình các tỉnh có khoảng 500 - 1000 ha canh tác cây hoa Huệ Hương, khi thu hoạch có thể thu nhập từ 150 - 200 triệu/ha. Do cây này dễ trồng, chi phí đầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thời tiết và đặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong điều kiện thuận lợi thường cho thu nhập cao. Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam Trung Bộ bắt đầu đẩy mạnh canh tác cây hoa Huệ Hương, đặc biệt là ở Bình Định và Khánh Hòa. Ở Bình Định, cây hoa Huệ Hương dần trở thành cây trồng chính. Theo đánh giá của người dân nơi đây, trong điều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80 - 120 triệu đồng. Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ đang gặp nhiều khó khăn, do bị sâu bệnh hại phá hoại nhiều, trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Hiện nay bệnh phá hoại rất mạnh, có thể làm giảm đến 60% năng suất cây trồng. Chính vì vậy, năng suất hoa Huệ Hương trên nhiều vùng có xu hướng không ổn định và chất lượng hoa thì giảm đáng kể. Hiện nay, bệnh chai bông đang là nguyên nhân chính làm cho giảm năng suất và phẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, đặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ. Triệu chứng bệnh thể hiện: - Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện các đường gân sọc màu nâu đỏ kéo dài từ bẹ lá đến chóp lá, lá có thể bị xoắn. - Trên bông: nếu bị nhiễm nặng, bông sẽ bị cai không trỗ được hoặc bông bị đen thui và khô, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu đỏ. - Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân có những chai sần dày đặc. Theo phương pháp nhân giống truyền thống, đối với hoa Huệ Hương, nguồn vật liệu ban đầu để sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống đóng vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của hoa sau này. Củ tái sinh theo phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung là ở phía trong các nách lá có một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành chồi bên. Nhìn chung, phương pháp này đơn giản, dễ làm và chi phí đầu tư không cao nhưng có rất nhiều nhược điểm: hệ số nhân thấp, thường làm thoái hóa giống, gâu bệnh hàng loạt ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng hoa. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm thực hiện đề tài - Phòng Công nghệ Sinh học thuộc Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tiến bộ khoa học Công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định. 2.2. Đối tượng nghiên cứu - Phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. Hình 2.1. Hoa Huệ Hương Hình 2.2. Củ hoa Huệ Hương 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy được chọn là phần đỉnh của các mắt ngủ được lấy từ củ Huệ Hương. Các củ Huệ Hương có chứa mắt ngủ được thu hoạch, sau đó được làm sạch bề mặt mẫu vật bằng vòi nước chảy mạnh trong 15 phút để loại bỏ những nơi có bám đất cát. Củ Huệ Hương được ngâm trong bột giặt 30 phút rồi rửa lại dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Sau đó tiến hành cắt củ thành lát mỏng có chứa các mắt ngủ. Sau đó rửa lại bằng nước cất và đem vào buồng cấy để khử trùng. Khử trùng mẫu trong buồng cấy bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi rửa lại bằng cồn 70% trong 15 - 20 giây rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng lần 1. Sau đó tiến hành khử trùng mẫu theo các thí nghiệm để tìm ra chế độ khử trùng tốt. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy khởi động Các mẫu sau khi khử trùng được cắt bằng dao chỉ lấy phần đỉnh mắt ngủ có kích thước từ 1 - 2mm. Sau đó được cấy vào môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng tùy từng thí nghiệm. 2.3.3. Phương pháp nhân nhanh Chồi bất định hình thành có chiều cao khoảng 2 - 3cm cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. Các protocorm hình thành trong quá trình nuôi cấy khởi động mẫu và nhân nhanh chồi được tách ra rồi cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. 2.3.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4 - 5cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS có bổ sung các chất thuộc nhóm auxin và than hoạt tính. 2.3.5. Phương pháp ươm cây Các cây hoa Huệ Hương hoàn chỉnh trong bình được rửa sạch agar rồi trồng trên các giá thể khác nhau. Theo dõi các tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây. 2.4. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại từ 30 - 50 bình, mỗi bình cấy 1 - 3 mẫu tùy từng thí nghiệm. Thí nghiệm ngoài vườn ươm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 cây. - Môi trường nuôi cấy + Môi trường MS cơ bản (Murashige and Skoog, 1962) + Môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, than hoạt tính với các nồng độ khác nhau tùy từng thí nghiệm. + Giá trị pH môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử trùng: 5,8 - 6,0. + Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,1 atm trong 25 phút. - Điều kiện nuôi cấy + Các dụng cụ được sử dụng trong nuôi cấy: dao, kéo, banh được vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn. + Tủ cấy được vô trùng bằng đèn tử ngoại 20 - 30 phút. + Nhiệt độ phòng nuôi: 25oC ± 2 + Cường độ ánh sáng: 2000 lux + Độ ẩm: 70% + Thời gian chiếu sáng: 14h sáng/10h tối. Thí nghiệm 1. Xác định phương pháp khử trùng đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. - Môi trường cơ bản: MS + 30g/l saccharose + 9g/l agar + 2 mg/l BA. Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) A0 7 A1 10 A2 12 A3 15 A4 17 A5 20 Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Nghiệm thức Ca(OCl)2 15% (phút) HgCl2 0,1% (phút) A0 0 15 A1 10 A2 20 A3 30 A4 40 Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nghiệm thức Nồng độ kinetin (mg/l) A0 0 A1 1 A2 2 A3 3 A4 4 A5 5 Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) A0 0 A1 1 A2 2 A3 3 A4 4 A5 5 Sau khi thực hiện xong thí nghiệm 2.2 chúng tôi nhận ở nghiệm thức A4 (4mg/l BA) là tối ưu nhất đối với quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy, nên sử dụng BA ở nồng độ này để tiến hành khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác. Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nghiệm thức Nồng độ auxin (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) A0 0 4 A1 0,25 α-NAA A2 0,25 IAA A3 0,25 IBA A4 0,25 2,4D 2.5. Các chỉ tiêu theo dõi - Tỷ lệ mẫu bị nhiễm - Tỷ lệ mẫu sống sót - Tỷ lệ mẫu cảm ứng với môi trường - Tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái 2.6. Thu thập và xử lý số liệu Các số liệu phân tích được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel 2003 và phần mêm IRRISTAT 4.0 (2003). CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, phương pháp khử trùng mẫu cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt khuẩn như: calcium hypochloride (Ca(OCl)2 ), HgCl2, H2O2… Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, khả năng thâm nhập của chúng vào các kẽ, ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy và khả năng đẩy hết các bọt khí trên bề mặt mô nuôi cấy ra ngoài. Đối với cây hoa Huệ Hương, vật liệu đưa vào nuôi cấy là các mắt ngủ nằm dưới đất, nguồn nấm bệnh và vi khuẩn rất nhiều. Chính vì thế, tỷ lệ nhiễm vào mẫu rất cao. Xác định phương pháp khử trùng tối ưu nhất đối với mẫu nuôi cấy của cây hoa Huệ Hương là vấn đề quan trọng. Thí nghiệm 1. Xác định phương pháp khử trùng đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. HgCl2 là hóa chất có tác dụng khử trùng mạnh, hiệu quả và đã được sử dụng phổ biến với hầu hết các mẫu trong nhân giống in vitro. Nếu sử dụng trong thời gian ngắn, tỷ lệ mẫu nhiễm cao, nếu kéo dài thời gian sử dụng dễ làm mẫu tổn thương và chết. Việc tìm ra thời gian khử trùng phù hợp cho đối tượng này quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Chính vì thế chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả khử trùng của HgCl2 ở các mức thời gian khác nhau. Sau 4 tuần theo dõi, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1. Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) A0 7 84,17 15,83 A1 10 76,67 23,33 A2 12 72,50 27,50 A3 15 54,17 45,83 A4 17 71,67 28,33 A5 20 83,34 16,67 Từ bảng số liệu 3.1, chúng tôi nhận thấy: Sử dụng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau cho hiệu quả khử trùng khác nhau. Do đặc thù của mắt ngủ của hoa Huệ Hương có độ sạch không cao nên thời gian khử trùng 7 phút (là thời gian tương đối dài với các đối tượng cây trồng khác) nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm vẫn rất cao 84,17%, tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 15,83%, thấp nhất trong các nghiệm thức thí nghiệm. Khi tăng thời gian khử trùng từ 7 phút lên 15 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm từ 84,17% (nghiệm thức A0) xuống còn 54,17% (nghiệm thức A3) đồng thời tỷ lệ mẫu sống tăng dần. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 17 và 20 phút, lúc này tỷ lệ mẫu nhiễm ít tuy nhiên do thời gian khử trùng lâu, mẫu cấy bị tổn thương hóa nâu rồi chết, tăng từ 54,17% (nghiệm thức A3) tới 71,67% (nghiệm thức A4) và 83,34% (nghiệm thức A5), đồng thời tỷ lệ mẫu sống giảm dần từ 45,83% (nghiệm thức A3) xuống còn 28,33% (nghiệm thức A4) và 16,67% (nghiệm thức A5). Trong các nghiệm thức thí nghiệm, nghiệm thức A3 khử trùng trong 15 phút có tỷ lệ mẫu nhiễm tương đối thấp so với các nghiệm thức còn lại và tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 45,83%. Đây là nghiệm thức có hiệu quả tốt nhất trong các nghiệm thức thí nghiệm. Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Sau khi tiến hành thí nghiệm 1.1, chúng tôi nhận thấy HgCl2 0,1% có tác dụng tốt nhất khi khử trùng ở thời gian là 15 phút. Để nâng cao hiệu quả khử trùng, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15%. Ca(OCl)2 là một hóa chất có tác dụng khử trùng tốt và thường được dùng để khử trùng mẫu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng chúng tôi thu được kết quả sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức HgCl2 0,1% (phút) Ca(OCl)2 (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) A0 15 0 53,34 46,67 A1 15 10 50,83 49,17 A2 15 20 41,67 58,33 A3 15 30 57,50 42,50 A4 15 40 79,17 20,83 Qua bảng số liệu 3.2, chúng tôi thấy: Khi khử trùng kết hợp với Ca(OCl)2 15% (nghiệm thức A1 đến A4) thì hiệu quả khử trùng tăng lên rõ rệt và tỷ lệ mẫu nhiễm giảm đáng kể so với trường hợp chỉ khử trùng bằng HgCl2 0,1% (nghiệm thức A0). Điều đó chứng tỏ Ca(OCl)2 cũng có hiệu quả cao khi khử trùng mẫu cấy củ hoa Huệ Hương. Ở nghiệm thức A0, tỷ lệ mẫu nhiễm là 53,34%, khi kết hợp với Ca(OCl)2 15% trong thời gian 20 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm xuống còn 41,67% (nghiệm thức A2). Khi tăng thời gian khử trùng Ca(OCl)2 15% tỷ lệ mẫu nhiễm giảm thấp nhưng tỷ lệ mẫu hóa nâu và chết tăng cao. Điều đó cho thấy Ca(OCl)2 15% có tác dụng tốt đến hiệu quả khử trùng, tuy vậy nếu sử dụng trong thời gian dài dễ làm mẫu tổn thương và chết nhiều. Khi xử lý Ca(OCl)2 15% trong 40 phút thì tỷ lệ mẫu chết cao 79,17% (nghiệm thức A4) vì vậy tỷ lệ mẫu sống thấp 20,82%. Trong các nghiệm thức thí nghiệm, nghiệm thức A2 xử lý Ca(OCl)2 15% trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm 41,67%, tỷ lệ mẫu sống 58,33%. Đây là nghiệm thức có tỷ lệ mẫu sống sót cao nhất. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, để điều khiển sự phát sinh hình thái thực vật việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò đặc biệt quan trọng. Trong các chất điều tiết sinh trưởng, có hai nhóm chất được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô là cytokynin và auxin. Tỷ lệ và hàm lượng hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng này có vai trò quan trọng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy theo hướng phát sinh cơ quan, phát sinh phôi soma hay tạo callus. Các chất thuộc nhóm auxin thì tác dụng kích thích tạo rễ và callus mạnh, còn các chất thuộc nhóm cytokynin thì có tác dụng kích thích tạo chồi. Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở nước ta. Hiện nay chỉ có một vài nghiên cứu bước đầu trên đối tượng này. Theo đó, các chất cytokinin: BA, kinetin... và các auxin: α-NAA, 2,4D, IAA... có hiệu quả kích thích sự phát sinh chồi từ phân sinh mô chồi cây hoa Huệ Hương. Trong thí nghiệm này chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ BA và kinetin, đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Kinetin là một cytokinin tổng hợp được sử dụng chủ yếu trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Ngoài tác dụng kích thích sự hình thành chồi, kinetin còn có tác dụng cải thiện chất lượng chồi trong quá trình nuôi cấy. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của kinetin đến khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Sau 8 tuần theo dõi, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 dưới đây. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ kinetin (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 0 0,00 0,00 0,00 - A1 1 30,83 25,83 5,00 Phần lớn chồi tạo thành xanh, có chiều cao thấp. Protocorm nhỏ, màu xanh, hơi vàng A2 2 63,33 55,83 7,50 A3 3 54,17 46,67 7,50 A4 4 51,67 45,00 6,67 A5 5 47,50 39,17 8,33 Ghi chú : (-) không có Qua bảng số liệu 3.3 trên chúng tôi nhận thấy: Ở nghiệm thức A0 (nghiệm thức đối chứng) tất cả mẫu nuôi cấy đều không phát sinh hình thái, sau 8 tuần theo dõi, các mẫu đều chết. Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy, có tác dụng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Tất cả các nghiệm thức bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái. Khi bổ sung vào môi trường từ 1 - 5 mg/l kinetin, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái khi cho 1 - 2 mg/l kinetin tăng lên từ 30,83 - 63,33% và khi cho 3 - 5 mg/l kinetin thì tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái giảm dần. Trong đó, nghiệm thức A2 (bổ sung 2mg/l kinetin) cho tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất là 63,33%. Quan sát sự phát sinh hình thái của mẫu cấy, chúng tôi nhận thấy mẫu phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi và tạo protocorm. Tất cả các mẫu tạo chồi đều có protocorm, một số ít mẫu chỉ có protocorm. Khi quan sát tỷ lệ mẫu vừa tạo chồi vừa tạo protocorm, chúng tôi nhận thấy kinetin có hiệu quả tốt trong việc kích thích mẫu tạo chồi khi bổ sung ở nồng độ thấp. Tỷ lệ tạo chồi cao nhất khi bổ sung kinetin 2 mg/l, đạt 55,83%. Khi lần lượt tăng nồng độ kinetin lên 5 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi càng giảm, chỉ còn 39,17% ở nghiệm thức A5. Các chồi tạo thành hầu hết xanh, mập, chiều cao thấp. Cùng với hướng vừa tạo chồi và protocorm, có một số mẫu phát sinh theo hướng chỉ tạo protocorm. Các nghiệm thức bổ sung kinetin, tỷ lệ mẫu phát sinh tạo protocorm dao động từ 5 - 8,33%. Protocorm tạo thành có màu xanh vàng, nhỏ, đường kính từ 1 - 1,5mm. Với mục tiêu nhân giống in vitro, chúng tôi chỉ quan tâm đến mục tiêu phát sinh tạo chồi của mô cấy. Trong thí nghiệm này, nghiệm thức A2 với nồng độ kinetin bổ sung 2 mg/l là công thức tối ưu nhất, với tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nhất (55,83%). Hình 3.1. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 2mg/l kinetin Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Sau khi tiến hành thí nghiệm 2.1, chúng tôi nhận thấy kine