Khóa luận Bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - Ấn trong quá trình nuôi cấy và bảo quản tế bào

ất giàu năng lượng khác nhau, các nucleotid, axitamin, enzym. Trong thời kỳ này tế bào chuẩn bị tăng gấp đôi các cấu trúc di truyền của nó. _ Giai đoạn S (Synthese = tổng hợp) xãy ra sự nhân đôi vật chất di truyền, sự tái sinh của các phân tử ADN. Các protein và ARN được tổng hợp mạnh mẽ. _ Giai đoạn G2 là giai đoạn sau tổng hợp, sự tổng hợp ARN vẫn tiếp tục các nhiễm sắc thể đã chứa hai bản sao của mình tức là các nhiễm sắc tử mang một phân tử ADN, hai sợi tế bào tích luỹ năng lượng và chuẩn bị cho sự phân chia tới, các nhiễm sắc thể xoắn lại và chia làm hai. Dưới kính hiển vi quang học không quan sát thấy nhiễm sắc thể trong gian kỳ, nhưng theo các dấu hiệu thu được khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử thì thấy đa số nhân trong gian kỳ vẫn có hình dạng nhiễm sắc thể, tuy nhiên các nhiễm sắc thể rất mảnh nên dưới kính hiển vi quang học không thấy dược toàn bộ cấu trúc và hình dạng của nhiễm sắc thể mà chỉ thấy được chỗ vặn xoắn của chúng tạo nên các khối chất nhiễm sắc. Các thời kỳ phân chia: Kỳ đầu (Prophase): ở kỳ đầu nhân xuất hiện các sợi lúc đầu mảnh và dài, càng về sau mảnh hơn và ngắn hơn. Trứơc kia người ta cho rằng từ các hạt chất nhiễm sắc tập hợp lại thành sợi dài, về sau sợi đó bị đứt đoạn tạo thành các nhiễm sắc thể, ngày nay người ta đã khẳng định rằng các sợi trong kỳ đầu ngắn hơn và dày hơn các nhiễm sắc thể ở gian kỳ. Vào cuối kỳ đầu, màng nhân và hạch nhân biến mất. Số trung thể tăng lên gấp đôi, mỗi nửa số trung thể di chuyển tới các cực đối lập của tế bào. Xung quanh trung thể xuất hiện các tia nên trông các trung thể giống như những ngôi sao. Từ nguyên liệu của bào tương hình thành nên các sợi của thoi vô sắc. Thoi gồm các sợi không bắt màu đi từ sao nọ sang sao kia. Thoi này có chứa protein giàu lưu huỳnh, ARN, lipoprotein và ATP. Kỳ giữa (Metaphase): Tại kỳ giữa nhiễm sắc thể có hình dạng đặc trưng xuất hiện các sợi thoi toả ra từ hai cực đối diện của tế bào dính với trung tử nằm ở hai cực. Các sợi thoi lần lượt dính với các tâm động của nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể tập trung ở mặt phẳng xích đạo của tế bào, mỗi cặp sợi nhiễm sắc. Nghĩa là mỗi nhiễm sắc thể con kết xoắn cực đại. Kỳ sau (Anaphase): ở kỳ sau các đôi nhiễm sắc thể tách ra thành các nhiễm sắc thể đơn thể quay ngược đầu rời xa đường xích đạo tiến về hai cực của tế bào, đó là vai của nhiễm sắc thể đơn. Thoi vô sắc biến đi, bào tương ở xung quanh dày và co thắt mạnh hơn. Càng về sau vai của nhiễm sắc thể càng mờ đi không thấy rõ nữa vì các sợi nhiễm sắc đã cởi xoắn. Kỳ cuối (Telophase): Sự vận chuyển của các nhiễm sắc thể con về hai cực của tế bào kết thúc. Như vậy 2 nhóm nhiễm sắc thể ở hai cực có số lượng và thành phần giống nhau. Màng nhân hình thành bao bọc bởi mỗi nhóm nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể dãn xoắn, hình thành nhân con. Các sợi thoi biến mất, tế bào chất được phân chia bao lấy nhân ở hai cực tế bào. Trong thời kỳ phân bào, các bào quan phân phối từng đôi đều cho các tế bào con. Ty thể thường phân ra thành các hạt bé hơn đôi khi lại kéo dài ra, bộ máy golgi cắt ra từng đoạn phân bào nguyên phân trải qua hai quá trình chia nhân và chia bào tương. Trong quá trình phân chia nhân mỗi nhiễm sắc thể tạo ra hai nhiễm sắc thể con từ gian kỳ song chúng chưa tách rời nhau. Đến cuối kỳ đầu hai nhiễm sắc thể con mới bắt đầu tách rời nhau. Như vậy số lượng nhiễm sắc thể là 2n đi về mỗi cực của tế bào cho nên kết thúc kỳ phân chia, mỗi tế bào con có đủ bộ lưỡng bội 2n giống tế bào mẹ về cả số lượng, hình thái, kích thước. Theo Ford (1973) khi nuôi cấy tế bào trong chu kỳ phân chia tế bào, thời kỳ G1 chiếm khoảng 12 - 24 giờ, thời kỳ S chiếm khoảng 7 giờ, thời kỳ G2 chiếm khoảng 4 - 6 giờ. Thời gian phân chia nguyên phân rất ngắn khoảng 1 giờ 30 phút trong đó: Kỳ đầu 30 phút Kỳ giữa15 phút Kỳ sau 15 phút Kỳ cuối 30 phút Nghiên cứu nhiễm sắc thể là dựa vào việc xác định rõ các giai đoạn phân chia của tế bào để có thể thu được kết quả tốt như kỳ giữa của quá trình nguyên phân. Tuy nhiên trong quá trình sinh sản và phát triển cá thể không phải lúc nào tế bào cũng duy trì được hoàn toàn chính xác về số lượng và hình dạng nhiễm sắc thể mà sẽ có những biến động. Những biến đổi của nhiễm sắc thể chia thành hai loại: _ Biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể _ Biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể 1.2 Những nghiên cứu nhiễm sắc thể trong điều kiện in vitro 1.2.1 Lược sử nghiên cứu chung về nhiễm sắc thể Nghiên cứu nhiễm sắc thể người và động vật đã được nhiều nhà khoa học chú ý tới, đặc biệt là vật nuôi. Nghiên cứu nhiễm sắc thể động vật nói chung và động vật nông nghiệp nói riêng được tiến hành từ đầu thế kỷ XIX. _ Năm 1665 Robert - Hooke nhà nghiên cứu người Anh đã tạo ra kính hiển vi quang học đầu tiên trên thế giới. Bằng chiếc kính hiển vi đơn giản ông đã có một số quan sát làm cho người ta hiểu rằng các mô, các cơ quan của cây cối và động vật đều có nền tảng và cấu trúc chung. _ Năm 1838 - 1839 nhà thực vật học Slayden và nhà động vật học Schwan ở Đức đã phát hiện ra cơ thể sinh vật đều được cấu tạo từ các tế bào, học thuyết tế bào ra đời. Theo Enghen đây là một trong ba phát minh vĩ đại nhất của khoa học tự nhiên ở thế kỹ 19. _ Năm 1831 Robert Braum tìm thấy thể nhiễm sắc trong nhân _ Từ năm 1862 - 1915 Beveri (Đức) và Wilsen (Mỹ) cho rằng nhiễm sắc thể khác nhau mang trong nó tính di truyền khác nhau. _ Năm 1869 lần đầu tiên nhà sinh vật học người Thuỵ Sỹ F.Misher đã phát hiện ra axit nucleic trong nhân tế bào. _ Từ năm 1887 - 1902 Beveri phát triển lý luận về nhiễm sắc thể. _ Năm 1927 Kalinte công bố số lượng nhiễm sắc thể ở bò là 2n = 60 _ Năm 1956 Tjo và Levan dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào của bào thai và dùng sốc nhược trương đã đếm chính xác số lượng nhiễm sắc thể của người là 2n = 46. Trong thời gian này với phương pháp nghiên cứu nhiễm sắc thể khác như: nuôi cấy bạch cầu máu ngoại vi, nuôi cấy tuỷ xương,...đã có nhiều tác giả công bố số lượng và hình thái nhiễm sắc thể ở gia súc và gia cầm. Dựa vào sự phân tích nhiễm sắc thể trong nguyên phân và phân tích nhiễm sắc thể khổng lồ ở loài Anopheles sundaicus, S. Sukowati và V. Baimai (1996) đã kết luận rằng: loài Anopheles sundaicus gồm ba dạng, ba dạng này đều có kiểu nhân trong nguyên phân là giống nhau là 2n = 6. Thành tựu đầu tiên về nghiên cứu nhiễm sắc thể người do Chrustchoft và Berlin dùng tế bào bạch cầu, tế bào máu ngoại vi nuôi cấy môi trường tổng hợp. Năm 1935 Chrustchoft và cộng sự đã công bố phương pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu đa nhân. Nghiên cứu nhiễm sắc thể trên người đã được phát triển sớm ở nhiều phòng thí nghiệm ở nhiều nước. Một số lượng lớn các mẫu đã được nghiên cứu, phân tích, sự phát hiện dị dạng nhiễm sắc thể và mối liên quan của nó tới quá trình sống đã giúp cho sự phát triển ngành tế bào học và di truyền người thu được những thành tựu đáng kể như ngày nay. Bên cạnh đó các nhà khoa học Nhật Bản và Tây Âu đặc biệt quan tâm nghiên cứu tới nhiễm sắc thể ở vật nuôi. Nuôi cấy tế bào trong môi trường thử nghiệm từ năm 1880 từ khi Roux giữ đĩa phôi gà trong nước muối sinh lý ấm vài ngày. Anold (1887) đã ghép một mảnh mô vào ếch, sau một thời gian có tế bào bạch cầu đa nhân vây quanh. Ông đã lấy mảnh mô và giữ trong đĩa nước muối sinh lý ấm rồi quan sát sự chuyển động và sống của nó trong thời gian ngắn. Năm 1903 Folly đã giữ tế bào bạch cầu bằng những giọt treo lơ lửng trong nước muối sinh lý ấm với thời gian một tháng. Becbe và Swing (1906) đã miêu tả việc cấy tế bào bạch cầu đơn nhân trong máu động vật có sức đề kháng và mẫn cảm. Năm 1907 Rossnarisian đã tách mảnh mô từ những ống vùng giữa rốn phôi và đám tế bào lympho ếch. Các mảnh mô này có thể sống vài tuần lễ và có nhiều sợi thần kinh xuất hiện ở các tế bào. Thời gian sau Carell đã phát hiện chất chiết xuất từ phôi thai có khả năng kích thích và tăng cường ảnh hưởng tới sự phát triển của một số tế bào nhất định. Waren và Leweis (1911 - 1912) đã bắt đầu tìm hiểu những nhân tố khi cho vào môi trường cần thiết cho sự sinh trưởng và quá trình sống của tế bào. Công việc này được Fisher tiếp tục nghiên cứu và trong những năm tiếp theo những nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu như: Sanhevtecly, Morgan, White, Waymouth và Eagle đã giúp cho sự phát triển những môi trường tổng hợp dùng để nuôi cấy tế bào ngày càng hoàn thiện (Paul, 1960). Có thể nói rằng tất cả các nghiên cứu nhiễm sắc thể người và động vật trước năm 1940 chỉ được tiến hành bằng việc cắt các mảnh mô. Nói chung là các mảnh mô này đựợc cố định trong dung dịch osurium hoặc chronium bao gồm cả dung dịch cố định, thuốc nhuộm với các chất kết tinh màu tím hoặc là thuốc nhuộm hematocylin. Makino (1944) đã dùng mô dịch hoàn để nghiên cứu nhiễm sắc thể bò trong môi trường hổn hợp Champy và Fleming. Hỗn dịch không có axit axetic đặc trong dung dịch cố định mẫu được tiến hành nhuộm trong Haidenhai- sắt- Hematocylin. Slizinsky (1945) đã thử nghiệm sử dụng thuốc nhuộm carmin axetic cố định để nghiên cứu nhiễm sắc thể ở tuỷ người. Nhưng tất cả các kết quả đều không mỹ mãn khi sử dụng những nguyên liệu này cho tới năm 1950 kỹ thuật nuôi cấy nhiễm sắc thể đã được tiến hành những năm 1950 như sau: Phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào trong môi trường tổng hợp dùng chất kích thích phân bào phytohaemaglutinin (PHA) có khả năng kích thích bạch cầu đơn nhân. _ Sử dụng Colchicin để cố định quá trình phân bào ở trung kỳ giai đoạn tốt nhất để đếm và quan sát hình dạng nhiễm sắc thể. _ Sử dụng dung dịch cố định lạnh axit axetic: methanol. _ Dùng dung dịch nhược trương trước khi tiến hành dùng dung dịch cố định Hsue và Pomerat (1953). Theo Levitsky (1924) nhiễm sắc thể có thể sắp xếp theo một trình tự nhất định thành bộ nhiễm sắc thể và khi nhuộm quan sát được thể hiện những đặc điểm của nhiễm sắc thể kỳ giữa trong quá trình phân chia nguyên nhiễm. Bởi vậy về hình dạng, số lượng của nó khá đặc trưng cho bộ nhiễm sắc thể của mỗi loài, nhiễm sắc thể đó đã thể hiện sự khác nhau về hình dạng, kích thước vị trí tâm động giữa các cặp nhiễm sắc thể. Biểu đồ thể hiện bộ nhiễm sắc thể gọi là nhiễm sắc thể đồ (Idiograme, Navashin, 1922). Tại hội nghị Denver (1960), một tiêu chuẩn phân loại nhiễm sắc thể người ở kỳ giữa được thống nhất. Các đôi nhiễm sắc thể kỳ giữa thường được sắp xếp theo thứ tự giảm dần về chiều dài của nhiễm sắc thể, phân biệt nhiễm sắc thể dựa vào các đặc điểm cấu trúc sau: _ Chiều dài của nhiễm sắc thể so với toàn bộ (Lr: chiều dài liên hệ tương đối) _ Tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và cánh ngắn tính theo độ tương đối: (q/p) _ Chỉ số tâm là tỉ lệ giữa chiều dài của cánh ngắn và chiều dài của nhiễm sắc thể: p/(p+q) Một điều thường xảy ra trong phân loại nhiễm sắc thể là việc xác định vị trí của tâm. Levan và cộng sự (1964) đã đề ra một tiêu chuẩn phân loại trong hội nghị nhằm xác định vị trí của tâm nhiễm sắc thể. Tuỳ theo vị trí của tâm mà nhiễm sắc thể được phân loại như sau: _ Nhiễm sắc thể tâm giữa gồm các nhiễm sắc thể có tâm động nằm giữa chia nhiễm sắc thể thành hai phần bằng nhau (hai vai nhiễm sắc thể bằng nhau) (Metacentric). _ Nhiễm sắc thể nằm gần giữa gồm các nhiễm sắc thể có tâm động nằm vùng gần giữa thân chia nhiễm sắc thể thành hai phần không bằng nhau, hai cánh nhiễm sắc thể có độ dài khác nhau, (Submetacentric). _ Loại nhiễm sắc thể tâm đỉnh hay cận tâm: đó là các nhiễm sắc thể có tâm động nằm gần đầu mút cho nhiễm sắc thể chỉ còn hai cánh dưới (Acrocentric) _ Nhiễm sắc thể có tâm mút (Telocentric) Nhờ hệ thống phân loại hình thái nhiễm sắc thể mà ta có thể lên được nhiễm sắc thể đồ và kiểu nhân (karyotype). Tại hội nghị Chicago (1966) đã thoả thuận về việc viết công thức nhiễm sắc thể: số lượng nhiễm sắc thể đầu tiên, sau đó là nhiễm sắc thể giới tính và cuối cùng bất kỳ dị dạng nào phát hiện được. Hội nghị quốc tế lần thứ tư (Paris, 1971), băng chuẩn được sử dụng để xác định các đôi nhiềm sắc thể đã được phát hiện. 1.2.2 Nghiên cứu tế bào in vitro và nhiễm sắc thể ở Việt Nam _ Năm 1969 lần đầu tiên bộ môn Tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng và hình thái nhiễm sắc thể. ở lợn, kết quả các giống lợn Móng cái, lợn ỉ Việt Nam có bộ nhiễm sắc thể 2n = 38. _ Năm 1970 - 1976 bộ môn giải phẫu và bộ môn tổ chức phôi thai-Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng nhiễm sắc thể trâu Việt Nam 2n = 48 _ Năm 1978 bộ môn giải phẫu và bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng nhiễm sắc thể bò Việt Nam 2n = 60 _ Năm 1983 - 1984, Phạm Văn Lập, Tạ Toàn, Tống Lệ Khanh - Khoa Sinh Học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã tiến hành nghiên cứu kiểu nhân của muỗi sốt rét Anospheles sinensis. _ Năm 1988 bộ môn giải phẫu và bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng, hình thái nhiễm sắc thể vịt ở Việt Nam 2n = 60 _ Năm 1992 bộ môn giải phẫu và bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 tiến hành nghiên cứu số lượng, hình thái nhiễm sắc thể một số giống vịt: vịt cỏ, vịt Kakicampell, Super Meat dòng ông và Super Meat dòng bà. Kết quả cho thấy 2n = 80 _ Năm 1993 bộ môn giải phẫu, bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 và viện chăn nuôi tiến hành nghiên cứu số lượng, hình thái nhiễm sắc thể một số giống dê. Kết quả 2n = 60 _ Năm 1994 bộ môn giải phẫu, bộ môn tổ chức phôi thai - Trường ĐHNN1 và viện chăn nuôi tiến hành nghiên cứu số lượng, hình thái nhiễm sắc thể một số giống gà ở Việt Nam. Kết quả gà ri 2n = 56. _ Năm 1996, Nguyễn Mộng Hùng, Nguyễn Lan Hương đã nghiên cứu kiểu nhân của lươn Monopterus albus sống ở hai miền Nam và Bắc Việt Nam. Kết quả cho thấy bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của lươn miền Bắc và miền Nam là 24. _ Nuôi tế bào động vật nhằm phục vụ cho việc cấy nhân tạo động vật nhân bản được tiến hành từ năm 1998 tại phòng Công Nghệ Phôi - Viện Công Nghệ Sinh Học , các tác giả đã nuôi thành công tế bào cận noãn (cumulus) của bò sữa cao sản, tế bào đệm (fibroblas) của Sao la, tế bào bò tót. Từ các nguồn tế bào này, các tác giả đã hình thành một ngân hàng tế bào các động vật cao sản để áp dụng vào sản xuất và tế bào các động vật hoang dã nhằm cấy nhân để phục hồi các động vật này. Chương 2 : Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1 đối tượng nghiên cứu của đề tài 2.1.1 Nguồn gốc tiến hoá của các giống bò Bò thuộc lớp Artiodaetyla Bộ phụ Ruminantia Họ Bovidae Chi Bovini Chi Bovini theo Bohlken (1958) có 3 loài: Bovina (bò) Bubalina (trâu Châu á) Syncerina (trâu Châu Phi) Nhóm Bovina gồm 4 dưới loài: Bos, Poephagus, Bibos, Bison _ Bos chỉ có một loài Bos primigenius, Bojanus là tổ tiên của bò nhà hiện nay đã tuyệt chủng _ Poephagus mutus, Przewalski là bò Tây Tạng hoang và con cháu đã thuần hoá của nó là bò Banteng của Đông nam châu á. Bò Bangteng của Đông nam châu á là Bibos javanicus hoặc Bibos bangteng (Wagner) và bò Gaur. ở Bắc ấn Độ và bán đảo Malaixia là Bibos geuirus, Smith. _ Hai loài của giống Bison là Bison châu Mỹ (Linnaeus) và Bison bonarus châu âu (Linaeus). Bò Hà - ấn là kết quả của quá trình lai giữa bò Hà Lan và bò lai Sind Sơ đồ lai: P : Bò vàng Việt Nam x Bò Sind ấn Độ F1 : Bò lai Sind x Bò Hà Lan F2 : Bò Hà - ấn Hình 1: ảnh Bò Hà - ấn cái 2.1.2 Đặc điểm một số giống bò 2.1.2.1 Bò Thanh Hoá Bò Thanh Hoá là một giống bò tốt hiện nay ở miền Bắc nước ta. Bò Thanh Hoá có tầm vóc loại trung, khối lượng có thể đạt: _ Bò cái bình quân 200 - 250 kg, bò cái tốt 280 - 290 kg. _ Bò đực bình quân 220 - 300 kg, bò đực tốt 300 - 340 kg. _ Bò cày bình quân 300 - 350 kg, bò tốt 360 - 370 kg. Sắc lông hầu hết có màu vàng tươi, cũng có con màu cánh gián; ở vùng bụng có yếm màu hơi nhạt hơn, da mỏng, mịn. Bò Thanh Hoá đẻ năm một, bê sơ sinh có khối lượng 16 - 21 kg, tăng trọng sau một tháng đến 15 - 19 kg. Năng suất thịt cao (trung bình đạt 50 - 52%), có khả năng cho sữa (bình quân 2 lít, con tốt 3 - 4 lít/ngày), tỷ lệ mỡ trong sữa 4,69%. 2.1.2.2 Bò Nghệ An Hình dáng bò Nghệ An trông thanh tú. Sắc lông màu nâu thẫm, có con đen hẳn. Mặt hơi lõm, u vai cao có ngấn. Trán số ít con phẳngcòn đa số là gồ ghề. Sừng dài hướng về phía trước, chóp sừng nhọn màu đen. Đùi thắt và ít nở nang. Đuôi dài. Chân ngắn và gân guốc. Chiều cao trung bình từ 1 - 1,1m. Khối lượng của bò cái trung bình 200 - 250 kg, bò đực 350 - 400 kg. Năng suất thịt 40 - 45%. Có khả năng cày bừa và kéo xe tốt. 2.1.2.3 Bò Lạng Sơn Bò thích ở những nơi nhiều cỏ và thoáng. Nhìn chung bò có tầm vòc nhỏ và không cân đối. Đa số có màu lông vàng, bò cái đa số trước thấp sau cao. So với thân hình thì đầu dài và không cân xứng. Mặt cong, lưng cong, bụng to và võng. Bề ngang hẹp và thấp. Khối lượng bò cái trung bình 180 - 200kg, bò đực 250 - 300kg. 2.1.2.4 Bò Sind Bò Sind là giống bò sữa ở nước Pakistan, thuộc vùng Karasi và Hiderabat. Từ năm 1920 - 1924 bò được nhập vào nước ta. Bò đã thích nghi với hoàn cảnh khí hậu nước ta, có khả năng chịu nóng tốt hơn trâu bò Việt Nam. Bò Sind sắc lông đỏ, có khi vá trắng. Phía u vai màu đỏ, có thể đỏ sẫm, cánh gián, vàng thẫm hoặc hung hung đỏ. Trán rộng và thường gồ lên. Mõm rộng, cổ ngắn và dày. Sừng to và ngắn. ức rộng, da mỏng, mông tròn. Đuôi dài và thẳng, có chòm lông đen ở cuối đuôi, chóp đuôi không có xương. Bầu vú đều đặn, núm vú thẳng, tai to và cụp xuống Bò cái hiền lành, vắt sữa dễ dàng. Khoảng cách 2 lứa đẻ là 13 tháng (Lai Sind 15 tháng). Sức tiết sữa trung bình 2000 kg trong một kỳ cho sữa. Có thể vắt sữa liên tục trong 10 tháng. Con tốt có thể vắt được 20 lít/ ngày. Bò cày dùng kéo xe rất tốt và chịu được điều kiện ăn uống kham khổ. 2.1.2.5 Bò Hà Lan Bò Hà Lan là giống bò chuyên sản xuất sữa được tạo ra ở vùng duyên hải nước Hà Lan. Bò được nhập nội vào nước ta từ Liên Xô và Trung Quốc. Sắc lông phần lớn màu loang đen trắng hoặc đen hẳn. Số ít có màu đỏ trắng. Đầu nhỏ, riêng bò đực đầu tương đối to, thô, ngắn. Hai mắt cách xa nhau, vành mắt có màu đen. Trán có đốm trắng. Sừng ngắn nhọn. Cổ dài, bò đực cổ to. Thân mình dài, phần sau thân rất nở nang. Mông dài, đùi to, bầu vú rất lớn. Con cái phần sau phát triển hơn phần trước, bò đực thì ngược lại. Bò đực cân nặng 750 - 1200kg, tỷ lệ thịt 55 - 58%. Bò cái nặng 450 - 750kg. Bê sơ sinh nặng 40 - 55kg. Sản lượng sữa trung bình đạt 5000kg trong 300 ngày, con kỷ lục trong 365 ngày vắt được 18875kg. Có con vắt đựợc tới 70 - 72kg/ngày. Bò cái hiền lành, bò đực dữ tợn. 2.2.Địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu Phòng Công Nghệ Phôi thuộc viện Công Nghệ Sinh Học - Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 11 - 2001 đến tháng 06 - 2002 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Mẫu vật nghiên cứu Tế bào da bò Hà - ấn được nuôi trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm được tiến hành trên các tế bào ở các lần chuyển khác nhau. 2.3.2 Vật liệu thí nghiệm _ Đá lạnh _ Máy ly tâm _ Kính hiển vi _ Cốc 100ml _ Bình tam giác 50ml _ Bình có màu 60ml _ Pipet paster _ ống ly tâm 15ml _ Bình nước cất _ Pipet man _ Lam(sấy, để ở -20 độC) _ Tủ nuôi _ Tủ sấy 2.3.3 Hoá chất _ Môi trường PBS(-) _ DMEM 10% FCS 5ml _ Hypotonic: KCl 0.075M 9ml Cách pha : Cân 5.59g KCl pha trong 1 lít nước cất, để trong tủ lạnh dùng dần _ Dung dịch cố định Công thức: etanol : axit acetic = tỉ lệ 3 : 1 _ Tripcin 400ml _ Đệm Photphat pH = 6.8 Cách pha : 0.453g KH2PO4 và 1.19g Na2HPO4 trong 100ml nước cất. _ Thuốc nhuộm Giemsa Cách pha : lấy 1g bột Giemsa hoà tan trong 54ml Glixerin ở 50o - 600C. Sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng rồi cho thêm 84ml metanol, khuấy đều, lọc qua bông. Thuốc nhuộm bảo quản trong tủ lạnh, dùng dần. 2.3.4 Nuôi và thu thập tế bào 2.3.4.1 Nuôi tế bào 2.3.4.1.1 Thu mẫu tế bào từ da tai của một con bò Hà - ấn cái: Vệ sinh vùng định thu mẫu, sát trùng bằng cồn 70%. Cắt bằng dụng cụ chuyên dụng. Mô da được thu vào môi trường PBS(-), đem về phòng thí nghiệm. Rửa sạch mẫu nhiều lần bằng PBS(-). Tách phần biểu bì, cắt nhỏ đến 0.1 x0.1 mm. Sắp xếp các miếng nhỏ vào đĩa, nuôi trong DMEM 10% FBS, nuôi ở 300C, 5% CO2, độ ẩm bão hoà. Sau 5 - 10 ngày các tế bào mọc ra từ miếng da. Dùng tripsin để cấy chuyển khi tế bào đã mọc đầy đĩa nuôi. 2.3.4.1.2 Nuôi tế bào sau các lần cấy chuyển: Sau khi cho tripsin các tế bào bong ra khỏi đĩa nuôi. Trung hoà tripsin còn thừa bằng DMEM 10% FBS. Ly tâm, loại bỏ môi trường, cho môi trường DMEM mới vào hoà tan cặn và gieo vào các đĩa nuôi trong 15 phút với mật độ 150.000 tế bào/ đĩa. Với mật độ này, thường sau ba ngày tế bào sẽ mọc đầy đĩa nuôi. Từ đó có thể cấy chuyển tiếp để duy trì hoặc làm nhiễm sắc thể để phân tích hoặc sử dụng cho các nghiên cứu khác. 2.3.4.2 Phương pháp tách tế bào khỏi giếng nuôi: _ Loại bỏ dung dịch nuôi _ Thêm 100ml trypsin cho mỗi giếng nuôi, trung hoà tripsin bằng DMEM 10%, để 10 phút. _ Đánh tan tế bào bằng pipet và cho vào ống nhựa 10ml. _ Thêm vào mỗi giếng nuôi 200ml dung dịch PBS(-), đánh kỹ và hút cho vào ống nhựa đó. Hình 2 : ảnh chụp tế bào bò Hà - ấn sau khi nuôi 2.3.5 Phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể. 2.3.5.1 Làm tiêu bản nhiễm sắc thể _ Sau khi tế bào được tách ra khỏi giếng nuôi, cho vào ống nhựa 10ml. Tiến hành ly tâm ngay với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút (tránh để lâu tế bào sẽ bị phân huỷ bởi tripsin). _ Hút bỏ phần nổi _ Thêm vào ống đã ly tâm 9ml dung dịch nhược trương _ Để 15 phút ở 370 C _ Sau 15 phút, thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch cố định _ Để 5 phút _ Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút _ Hút bỏ phần nổi _ Thêm vào 6ml dung dịch cố định mới _ Để 20 phút ở 40 C _ Sau 20 phút, ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút _ Hút bỏ phần nổi _ Thêm vào 2ml dung dịch cố định mới _ Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút _ Hút bỏ phần nổi _ Thêm vào 600ml dung dịch cố định mới _ Dùng pipet hoà đều tế bào với môi trường cố định _ Chuẩn bị các lam kính sạch _ Dùng pipet hoà đều tế bào với môi trường cố định _ Lam kính rửa sạch, dể trong tủ lạnh ở nhiệt độ 00C trong khoảng 30 phút _ Nhỏ từng giọt dung dịch chứa tế bào bằng pipet xuống lam kính sao cho khoảng cách giữa pipet đến lam kính khoảng 1 mét. Động tác này có tác dụng làm giọt mẫu rơi từ trên cao xuống sẽ được dàn mỏng và đều, tế bào sẽ vỡ tung nhiễm sắc thể. _ Để khô từ 12 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. 2.3.5.2 Nhuộm nhiễm sắc thể bằng thuốc nhuộm Giemsa _ Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Giemsa 6% trong đệm photphat trong 10 phút. _ Rửa tiêu bản bằng nước cất _ Để khô 2.3.6. Đọc tiêu bản Tiêu bản sau khi nhuộm đã để khô, chúng tôi quan sát dưới kính hiển vi Olympus Trước tiên quan sát chung ở vật kính 10, xác định vị trí của nhiễm sắc thể trên vi trường. Sau đó quan sát ở vật kính 40. Nhiễm sắc thể bắt màu tím đậm. Quan sát hình thái, đếm số lượng nhiễm sắc thể, ghi lại toạ độ vi trường và chọn vi trường rõ nét nhất để chụp ảnh bộ nhiễm sắc thể. 2.3.7. Xử lý số liệu Các công thức toán học dùng trong tính toán và xử lý số liệu 2.3.7.1 Tính giá trị trung bình = i= 1,2,....n : số nhiễm sắc thể trung bình X: số nhiễm sắc thể của mỗi lần quan sát được n: số lần quan sát 2.3.7.2 Tỉ lệ % fi fi : tỉ lệ % Mi : số lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể lần chuyển thứ i Ni : số lượng phiến kỳ giữa của lần chuyển thứ i 2.3.7.3 Giá trị tính toán: Ti = Ti : gía trị tính toán A : tổng lượng phiến kỳ giữa có 60 nhiễm sắc thể ở các lần chuyển Ni : tổng lượng phiến kỳ giữa của lần chuyển thứ i C : tổng lượng phiến kỳ giữa của các lần chuyển 2.3.7.4 So sánh nhiều tỉ lệ bằng tiêu chuẩn X2 X2 = Oi : giá trị quan sát Ti : giá trị tính toán 2.3.8 Bố trí thí nghiệm Bò Hà ấn Thu tế bào da Tế Bào Nuôi tế bào Cấy chuyển 1 4 Lần chuyển 4 Phân tích Nhuộm Làm NST Cấy chuyển 4 6 Làm NST Nhuộm Phân tích Lần chuyển 6 Cấy chuyển 6 8 Phân tích Nhuộm Làm NST Lần chuyển 8 Cấy chuyển 8 10 Nhuộm Phân tích Làm NST Lần chuyển 10 Cấy chuyển 10 14 Phân tích Nhuộm Làm NST Lần chuyển 14 Cấy chuyển 14 18 Phân tích Nhuộm Làm NST Lần chuyển 18 Chương3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái trong nuôi in vitro Quá trình làm tiêu bản tế bào bò Hà - ấn trong nuôi invitro đạt kết quả tốt hay không tốt phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có những yếu tố quan trọng như thời gian lấy tế bào ở mỗi lần chuyển, thời gian xử lý hoá chất, nồng độ hoá chất, kỹ thuật làm tiêu bản nhiễm sắc thể .. Trong khuôn khổ khoá luận tốt nghiệp này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn qua các lần chuyển thứ 4, 6, 8, 10, 14, 18. Mới gần đây Chikara Kubota và cs (2000) đã tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào fibroblast của bò trong nuôi in vitro ở lần chuyển thứ 5, 10, 15. Kết quả cho thấy 70- 80% có bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh (2n = 60) và coi đó bộ nhiễm sắc thể không thay đổi. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi cũng thu được kết quả 70 - 77% có bộ nhiễm sắc thể hoàn chỉnh. Như vậy, chúng ta có thể sơ bộ kết luận rằng bộ nhiễm sắc thể của tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi in vitro là không thay đổi. Điều đó có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng tế bào nuôi. 3.1.1 Kết quả nghiên cứu ở lần chuyển thứ 4 Bảng 1: Số lượng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn cái ở lần chuyển thứ 4 Số lượng nhiễm sắc thể Số lượng phiến kỳ giữa Tỉ lệ(%) > 60 3