Khóa luận Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium Occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng kỹ thuật Rapd và Aflp

sự xuất hiện một dòng điện. Do đó, việc đo nhiệt độ được chuyển thành đo điện. Trong thực tế, một cặp nhiệt điện là hai dây kim loại khác nhau được nối chung với nhau ở hai đầu. Do sự khác nhau giữa năng lượng liên kết của electron và các nguyên tử kim loại khác nhau, ta có một điện áp nhiệt. Điện áp nhiệt này có thể tạo nên một dòng điện khi hai đầu còn lại của kim loại được nối với nhau. Trong mạch điện khép kín này, ta có một dòng điện gây nên bởi hiệu ứng Seebeck. Do đầu nối thứ hai của cặp nhiệt điện một điện áp nhiệt cũng phát sinh. Nếu hai đầu có nhiệt độ giống nhau, dòng điện bằng 0. Như thế, một cặp nhiệt điện chỉ có thể cho ta một điện thế khi có sự chênh lệch về nhiệt độ. (Dương Minh trí, trang 61) 2.8. Cấu trúc và đặc tính của chip AT90S8535 Chip AT90S8535 của hãng ATMEL có những đặc điểm sau:  Điện áp nguồn nuôi: 4V- 6V.  Có 118 lệnh mạnh hầu hết được thực hiện trong 1 chu kỳ xung nhịp.  RAM flash 8 kbyte lập trình được trong hệ thống. Chịu được 100000 lần ghi/xóa.  Bộ nhớ EEPROM 512 byte. Chịu được 100000 lần ghi/xóa.  Bộ nhớ SRAM bên trong 512 byte.  Bộ biến đổi ADC 8 kênh, 10 bit.  32 đường vào/ra lập trình được.  32 thanh ghi đa năng.  Bộ định thời gian watchdog lập trình được với bộ dao động bên trong. 14 Hình 2.10 Sơ đồ chân của AT90S8535. Chức năng các chân:  VCC: điện áp nguồn nuôi  GND: đất  Cổng A (PA0 đến PA7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn dương bên trong. Cổng A cung cấp các đường địa chỉ dữ liệu vào ra theo kiểu hợp kênh khi dùng bộ nhớ ở bên ngoài.  Ngoài ra cổng A còn thêm chức năng chuyển đổi từ dạng tỷ biến sang dạng số.  Cổng B (PB0 đến PB7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn dương bên trong. Cổng B cung cấp các chức năng ứng với các tính năng đặc biệt của AT90S8535.  Cổng C (PC0 đến PC7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn dương bên trong. Cổng C cung cấp các địa chỉ lối ra khi dùng bộ nhớ ở bên ngoài.  Cổng D (PD0 đến PD7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn dương bên trong. Cổng D cung cấp các chức năng ứng với các tính năng đặc biệt của AT90S8535.  RESET: lối vào được đặt lại  XTAL1: lối vào bộ khuếch đại đảo và lối vào mạch tạo xung nhịp bên trong  XTAL2: lối vào bộ khuếch đại đảo  ICP: là chân vào cho chức năng bắt tính hiệu vào bộ định thời/đếm 1.  OC1B: là chân ra cho chức năng so sánh lối ra bộ định thời/đếm 1. 15  ALE: là chân tín hiệu cho phép chốt địa chỉ được dùng khi truy nhập bộ nhớ ngoài. (www.atmel.com) 2.9. Ngôn ngữ Bascom Ngôn ngữ Bascom được viết trên ngôn ngữ C++ của hãng Microsoft, có những ưu điểm vượt trội so với Assem, nó gần với ngôn ngữ người vì vậy dễ lập trình và kiểm soát lỗi, giúp cho chương trình viết đơn giản và dễ hiểu. Bascom còn có trợ giúp thêm chạy chương trình mô phỏng, trình biên dịch… 2.10. Mạch điện Mạch điện được thiết kế trên máy tính bởi phần mềm Orcad, mạch được thiết kế theo dạng board chức năng, mỗi board đảm nhận một chức năng riêng nên dễ kiểm tra, sửa chữa và nâng cấp. 2.11. Ứng dụng của PCR 2.11.1. PCR định lượng Việc áp dụng PCR số lượng luôn luôn đòi hỏi phải kèm theo một hồ sơ (protocol PCR) để giảm đến mức thấp nhất những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình và kích hoạt. PCR phải duy trì trong 20 vòng để tạo kích hoạt mạch thẳng ( www.ykhoa.net). 2.11.2. PCR sản xuất đột biến (PCR mutagenesis) Có thể dùng kỹ thuật PCR để xóa đi hoặc cấy ghép một đột biến vào phân tử DNA mục tiêu. Kỹ thuật này giúp nghiên cứu cấu trúc chức năng tương lai trong các protein cuối cùng. Sự xóa đi có thể dùng primer nối với vòng cần phải xóa đi và tiến hành vị trí giới hạn trong quá trình tái tổ hợp với primer thứ hai. 2.11.3. PCR ứng dụng trong cloning tái tổ hợp (cloning of recombinant) Nếu trước đây, muốn đưa một đoạn gene vào plasmid để chuyển thể plasmid này vào một vi khuẩn thì công việc này đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức. Trước hết là phải có một số lượng tế bào đích để từ đó người ta ly trích toàn bộ bộ gene 16 (genomic DNA). Sau đó, dùng nhiều loại enzyme cắt giới hạn để cắt bộ gene thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau, điện di trên gel, dùng kỹ thuật Southern blotting và phát hiện đoạn gen muốn tìm bằng kỹ thuật lai với đoạn dò đặc hiệu. Từ kết quả đó, có thể định vị và trích được đoạn gen muốn tìm từ bản gel đã điện di để gắn vào plasmid rồi đưa vào vi khuẩn mang. Tuy nhiên, công việc như vậy cũng chưa đã hoàn tất, vì chưa chắc chúng ta đã gắn đúng đoạn gen mong muốn vào plasmid vì trên bản thạch chúng ta không thể chỉ lấy đúng đoạn gen đã định vị mà không lẫn các đoạn gene khác. Do vậy, phải chọn đúng vi khuẩn mang plasmid có gene mong muốn. Chúng ta gọi toàn bộ kỹ thuật này là clone tái tổ hợp, có khi phải thực hiện trong nhiều tháng, thậm chí nhiều năm, mà nhiều khi chưa chắc đã thành công. Ngày nay, các nhà nghiên cứu có thể dùng kỹ thuật PCR trong thí nghiệm này. Trước hết là từ một vài tế bào đích ban đầu (không cần phải có nhiều tế bào đích như kỹ thuật cũ), có thể sử dụng cặp mồi đặc hiệu để tổng hợp và khuếch đại đoạn gen muốn tìm thành hàng tỷ bản sao giống hệt nhau rồi đưa vào plasmid (không cần phải dùng một lượng lớn tế bào đích để ly trích được bộ gene và phân tích bằng restriction enzyme, rồi làm Southern blotting...). Lúc này plasmid mang đúng đoạn gen đích, không thể có lẫn lộn các đoạn gene khác. Vì vậy sau khi chuyển thể plasmid vào vi khuẩn mang, không cần phải làm kỹ thuật chọn dòng nữa. Như vậy, chúng ta thấy cũng cùng một mục đích, nhưng với PCR, công việc đã gọn lại rất nhiều ( www.ykhoa.net). 2.11.4. PCR nhân bản đoạn DNA mong muốn Với các kỹ thuật sinh học phân tử cổ điển, để có được một đoạn DNA mong muốn nào đó, nhà nghiên cứu phải có trong tay một số lượng lớn tế bào đích, để ly trích được bộ gene của tế bào. Sau đó từ bộ gene phức tạp này, ly trích đoạn DNA muốn tìm bằng hàng loạt các kỹ thuật sinh học phân tử phức tạp, tốn thời gian và công sức. Với kỹ thuật PCR, công việc được giải quyết một cách gọn gàng hơn nhiều. Chỉ cần một số lượng nhỏ bộ gene có trong mẫu thử, với một cặp mồi đặc hiệu, có thể tổng hợp và khuếch đại đoạn DNA đích trong bộ gen phức tạp thành hàng tỷ bản sao các đoạn DNA giống hệt nhau mà không cần phải làm động tác ly trích trở lại. Một trường hợp khác là nếu đoạn gen mong muốn đã nghiên cứu trước đó và đã được gắn vào một plasmid, chuyển thể vào một loại vi khuẩn mang. Nếu muốn có 17 đoạn gene để nghiên cứu thì phải xin tác giả của nó gởi cho mình vi khuẩn mang với plasmid có gắn đoạn gen trên. Tuy đơn giản hơn là phải ly trích ngay từ đầu đoạn gen trên, nhưng cũng tốn khá nhiều thời giờ chờ đợi. Với PCR thì công việc lại đơn giản hơn gấp nhiều lần. Chỉ cần có đoạn mồi cho gen mong muốn, rồi dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen này thành hàng tỷ bản copy giống hệt nhau. Có rất nhiều đoạn gen mong muốn, rất thuần khiết, để làm nghiên cứu mà không cần phải chờ đợi, phải xin phép tác giả,... Từ cấu trúc của protein với thứ tự các amino acid, có thể suy ra được cấu trúc của đoạn mồi cần tổng hợp để khuyếch đại được đoạn gene chịu trách nhiệm trong tổng hợp protein trên. Ngoài ra, nhờ kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transciptase PCR), có thể dễ dàng khuếch đại mRNA, nhờ vậy có thể nghiên cứu được sự biểu hiện gene mà không cần phải sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trước đây như ly trích mRNA từ một số lượng tế bào đích khá lớn rồi phát hiện nó bằng kỹ thuật Northern blotting. Phát hiện mRNA còn có một ứng dụng khác nữa là phát hiện xem vi sinh vật gây bệnh có kháng được với hóa trị liệu hay không, vì chỉ có vi khuẩn còn hoạt động mới tổng hợp được mRNA, nếu vi khuẩn đã chết thì khó phát hiện được mRNA vì cấu trúc này không bền dễ bị huỷ bởi các men RNase vốn dĩ rất bền và hiện diện sẵn trong môi trường ( www.ykhoa.net). 2.11.5. PCR dùng trong phát hiện các vi sinh vật gây bệnh Bằng cách khuếch đại đoạn nucleic acid đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm, thử nghiệm PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cực cao mà không có một thử nghiệm nào trước đây có thể so sánh được. Sở dĩ được như vậy vì chỉ cần dưới 1 vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là có hiện diện acid nucleic đích và được PCR khuếch đại. Trong các thử nghiệm huyết thanh hay miễn dịch học, chìa khoá chính của thử nghiệm là có được trong tay các kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu. Nếu không muốn mua sản phẩm thương mại, phải tự chế, đây là một công việc rất công phu và tốn thời gian. Trong khi đó với PCR, chìa khóa chính của thử nghiệm là vấn đề tìm cho được các đoạn mồi đặc hiệu. Nhờ có máy vi tính trợ giúp mà công việc này trở nên đơn giản: với một đĩa CD có đầy đủ các dữ liệu về thư viện DNA của các vi sinh vật 18 mà các nhà nghiên cứu trước đã nghiên cứu được và với một phần mềm chuyên dùng, có thể tự chọn những cặp mồi theo đúng trình tự đã chọn. Sau đó chỉ cần đặt hàng cho một hãng tổng hợp đoạn mồi theo đúng trình tự đã chọn. Sau khi tổng hợp, hãng sản xuất có thể gởi đến người sử dụng theo đường bưu điện mà không cần phải có điều kiện bảo quản chặt chẽ, vì các đoạn mồi sau khi tổng hợp xong, làm đông khô có thể giữ rất bền trong điều kiện bình thường. Công việc lúc này là thử nghiệm xem các đoạn mồi được chọn đặc hiệu như mong muốn hay không, nếu không thì lại chọn một cặp mồi khác. Do phản ứng PCR quá nhạy, nên khi áp dụng trong chẩn đoán, một vấn đề rất quan trọng cần phải lưu tâm, đó là hiện tượng dương tính giả, chủ yếu là do mẫu thử bị nhiễm bởi các sản phẩm PCR trước đó. Chỉ cần mẫu thử bị nhiễm một hoặc vài mảnh sản phẩm PCR thì các mảnh này sẽ được khuếch đại và mẫu cho kết quả dương tính nhưng là dương tính giả. Ðể có thể tránh được kết quả dương tính giả, PCR chẩn đoán phải được thực hiện trong một phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ, các giai đoạn thí nghiệm phải được thực hiện tại những khu vực riêng, với các đồ dùng thí nghiệm riêng, sử dụng nhiều vật liệu chỉ dùng một lần (đầu pipette, ống nghiệm phản ứng, ống nghiệm chuẩn bị bệnh phẩm). Ngoài ra còn phải áp dụng nhiều biện pháp để loại trừ ngoại nhiễm. Hiện nay, có lẽ hiệu quả nhất là sử dụng phương pháp nội tại loại trừ ngoại nhiễm: đó là trộn sẵn trong ống nghiệm làm phản ứng PCR men Uracil N Glycosylase (UNG) là men có khả năng phá hủy các sản phẩm PCR ngoại nhiễm trước khi phản ứng PCR xảy ra. Chính nhờ việc sử dụng UNG mà các thử nghiệm PCR chẩn đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh có thể thực hiện được tại bất cứ phòng thí nghiệm nào, không cần phải tại một thí nghiệm được thiết kế đặc biệt cho PCR chẩn đoán. Ngoài ra, PCR còn có một biến thể là kỹ thuật Nested - PCR có thể làm tăng thêm độ nhạy cảm của thử nghiệm một khi nucleic acid đích hiện diện khá ít trong mẫu thử. Với kỹ thuật RT-PCR, có thể khuếch đại nucleic đích là RNA, nhờ vậy có thể phát hiện tác nhân gây bệnh mà acid nucleic đích là RNA chứ không chỉ hạn chế với acid nucleic là DNA. Tuy nhiên, cần phải lưu ý rằng kỹ thuật RT-PCR cũng như Nested - PCR là những kỹ thuật không thể dùng UNG là yếu tố nội tại chống ngoại nhiễm, vì vậy chỉ có thể thực hiện được trong những phòng thí nghiệm có kiểm soát chặt chẽ. 19 Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn là PCR không những có thể phát hiện được tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có thể phân loại kiểu di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy được vi khuẩn. Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng. Ngoài ra, PCR còn có thể phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh, ví dụ phát hiện M. tuberculosis kháng rifampicin, một chìa khóa chủ yếu để bác sĩ điều trị có thể sử dụng phát đồ điều trị đúng cho bệnh nhân ( www.ykhoa.net). 2.11.6. PCR với tiến hóa và khảo cổ học Từ năm 1963, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu nghiên cứu về tiến hóa dựa trên cấu trúc phân tử của protein (cytochrome c, hemoglobin, ribonuclease). Sau đó, bắt đầu nghiên cứu tập trung vào trình tự chuỗi 16S RNA của ribosome trên vi khuẩn hay bộ gene của ty thể và lục lạp của thực vật. Ngày nay, PCR đã góp phần làm công việc nghiên cứu về tiến hóa phân tử học trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn. Người ta có thể so sánh các loài với nhau bằng cách dùng các mồi đặc hiệu cho những vùng có tính ổn định cao trong bộ gen, nhờ đó khuếch đại các vùng biến đổi, rồi so sánh với nhau. Ưu điểm vượt trội nhất của PCR trong lĩnh vực này là chỉ cần một số lượng rất nhỏ mẫu vật là đủ để có thể tiến hành phân tích. Trong lĩnh vực khảo cổ học, nhờ DNA là một loại phân tử khá bền vững, có những mảnh DNA có thể tồn tại nguyên vẹn trong thời gian khá dài. Có rất nhiều trường hợp những mảnh DNA cổ đại đã được PCR khuếch đại thành công: người ta có thể khuếch đại DNA ty thể từ một người Châu Mỹ sống cách đây 7000 năm hay từ các mảnh xương của cọp răng chồn sống cách đây 14.000 năm ( www.ykhoa.net). 2.11.7. PCR với phát hiện các khiếm khuyết gene Khiếm khuyết gene gây các bệnh di truyền hay ung thư là do bị đột biến đoạn hay đột biến điểm. Phát hiện các đột biến bằng phương pháp PCR, khi đoạn DNA đặc hiệu đuợc khuếch đại lên có kích thước khác bình thường (do thêm hay mất đoạn). Với các trường hợp đột biến điểm, PCR hiện nay đã chiếm độc quyền trong lãnh vực này vì khả năng thực hiện các thí nghiệm tương đối đơn giản và ít tốn thời gian so với các thử 20 nghiệm sinh học phân tử không dùng PCR. Dùng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn DNA có chứa đột biến điểm rồi phân tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử khác; hay dùng cặp primer chỉ khuếch đại đuợc đoạn DNA có đột biến điểm mà không khuếch đại đoạn gene bình thường ( www.ykhoa.net). 2.11.8. PCR và việc định loại các mô Các mô được định loại (type) khác nhau dựa vào sự khác nhau về các kháng nguyên của phức hợp phù hợp tổ chức chính (MHC), ở người gọi là kháng nguyên HLA. Ðịnh type các mô là một việc hết sức cần thiết trong ngân hàng dữ liệu mô ghép và trước khi thực hiện phẫu thuật ghép mô hay cơ quan. Hiện nay, định type các mô được dựa vào các phương pháp miễn dịch học. Tuy nhiên, PCR cũng là một triển vọng đầy hứa hẹn trong lĩnh vực này, vì định type các mô dựa vào PCR cho được nhiều thông tin hơn là các phương pháp miễn dịch học ( www.ykhoa.net). 2.11.9. PCR và việc xác định các dấu ấn di truyền Dấu ấn di truyền được nói ở đây là những dấu ấn giúp phân biệt các cá thể trong cùng loài, xem có liên hệ với nhau hay không. Các dấu ấn này hoàn toàn không có ý nghĩa gì trong việc biểu hiện kiểu hình thông qua tổng hợp protein. Trước đây, để phát hiện các dấu ấn di truyền phải ly trích được bộ gene từ một khối lượng khá nhiều tế bào của cá thể cần khảo sát (mô, máu,..) sau đó cắt đoạn bộ gene này bằng các restriction enzyme, điện di trên thạch, làm Southern blotting, rồi dùng các đoạn dò đặc hiệu được đánh dấu để phát hiện. Kết quả là mỗi cá thể sẽ có một hình ảnh đặc trưng bằng các vạch được đánh dấu bằng các đoạn dò khi lai ghép trên Southern blotting. Người ta gọi kỹ thuật này là kỹ thuật phân tích sự đa hình về chiều dài của các mảnh DNA bị cắt đoạn, RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorphism). Với PCR, công việc trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Có hai kiểu PCR phát hiện dấu ấn di truyền hiện đang được dùng. Kiểu thứ nhất là dùng PCR với các đoạn mồi nằm trước và sau các microsatellite, là các cấu trúc CACACA lặp đi lặp lại khoảng 100000 lần trong bộ gene của động vật có vú và khuếch đại các microsatellite này. Vì các cá thể khác nhau có sự khác nhau về số lượng các cấu trúc CA tạo thành các 21 microsatellite nên sau khi khuếch đại bằng PCR và phân tích các vạch trên thạch điện di, sẽ thấy các kiểu mẫu vạch khác nhau tùy từng cá thể được phân tích. Kiểu thứ hai gọi là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên các DNA đa hình (Random Amplified polymorphic DNA - RAPD) là dùng các đoạn mồi ngẫu nhiên, thường ngắn khoảng 10 nucleotide, cho bắt cặp với nucleic acid đích trong điều kiện bắt cặp không chặt chẽ, ở nhiệt độ khoảng 30 – 40oC chẳng hạn. Nhờ vậy khi thực hiện PCR, sẽ có sản phẩm PCR là những đoạn DNA dài ngắn khác nhau do các đoạn mồi bắt cặp ngẫu nhiên trên DNA đích (ngẫu nhiên nhưng là tất nhiên, vì đoạn mồi sẽ bắt cặp trên chuỗi đích nào tương đối bổ sung nhất với nó) và các kích thước của những đoạn này sẽ được phát hiện trên thạch điện di. Sự giống và khác nhau về hình ảnh trên thạch điện di sẽ cho biết các cá thể đuợc phân tích có giống hay khác nhau, hay có liên hệ với nhau như thế nào. Kỹ thuật PCR phát hiện dấu ấn di truyền đã có những đóng góp rất lớn trong khoa học hình sự. Chỉ cần tội phạm để lại trên hiện trường rất ít mẫu vật: một vài giọt máu khô, vết tinh dịch, vài sợi lông hay tóc, hay thậm chí mẫu tàn thuốc có dính lại vài tế bào niêm mạc miệng, là có thể truy tìm được dấu ấn di truyền và phát hiện được ngay đúng tội phạm mà không thể nào chối cãi được. (www.ykhoa.net) 2.11.10. PCR và kỹ thuật phát hiện trình tự chuỗi của một đoạn DNA (DNA sequencing) Trước đây, để làm DNA sequencing, người ta phải dùng kỹ thuật Maxam và Gilbert, kỹ thuật này tương đối phức tạp. Hiện nay làm DNA sequencing bằng kỹ thuật PCR đơn giản hơn nhiều, kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật Sanger. Được rất được nhiều phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện nay sử dụng. Giá trị sử dụng Phương pháp PCR có ý nghĩa lớn vì nhiều lí do : Thời gian thực hiện cực nhanh : Chỉ cần mất 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA được quan tâm, so với phương pháp tạo dòng của kĩ thuật tái tổ hợp DNA phải mất cả tuần hoặc lâu hơn. Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời. Trong khi đó, phương pháp tạo dòng 22 điển hình cần các vật liệu đắt tiền như màng, nucleotide triphosphate mang dấu phóng xạ và việc thực hiện cần thao tác khéo léo đặc biệt. Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleotide thô. Ví dụ mẫu máu hay dấu vết trong phân tích pháp y. Điều này ngược với kĩ thuật tái tổ hợp DNA, đoạn gen hoặc vector đều cần tương đối tinh khiết. Nhờ ưu thế trên, PCR đã hấp dẫn các nhà nghiên cứu ngay từ lúc ra đời trong việc khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu và chẩn đoán phân tử. Giới hạn duy nhất đối với phương pháp này là phải biết trình tự nucleotide (hoặc ít nhất một phần) của đoạn DNA cần khuếch đại. Nó không thay thế kĩ thuật tái tổ hợp DNA mà góp phần đáng kể bổ sung kĩ thuật này. Như vậy, từ khi ra đời đến nay, PCR đã có vai trò cách mạng hóa trong nghiên cứu cấu trúc và chức năng gene. Nó được hoàn thiện không ngừng và có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như xác định trình tự nucleotide của gene, gây đột biến điểm định hướng,…Có thể thực hiện PCR in situ (ngay trong tế bào) với cả DNA, RNA. Nó được sử dụng trong pháp y để phân tích di truyền vệt máu khô, chẩn đoán các bệnh di truyền và lây nhiễm, dự báo các sai hỏng di truyền. PCR có thể dùng để nghiên cứu DNA cổ xưa từ mẫu khảo cổ. PCR kết hợp với các kĩ thuật khác của tạo dòng phân tử giúp sinh học xâm nhập vào nhiều lĩnh vực mà trước đây khó với tới (www.ykhoa.net). 2.12. Thành phần hóa học của DNA Deoxyribonucleic acid là một hợp chất polymer cấu tạo bởi các đơn phân nucleotide. Nó được tạo nên do sự nối liền nhiều đơn phân cùng kiểu là các nucleotide. Kết quả phân tích hóa học DNA của những sinh vật khác nhau cho thấy sự giống nhau đặc biệt giữa các đơn chất hợp thành DNA. Thành phần hóa học của DNA gồm có gốc acid phosphoric, đường 5-desoxyribose và các base nitrogenous. base nitrogenuos ở DNA gồm có hai purine là adenine (A) và guanine (G) và hai pyrimidine là cytosine (C) và thymine (T); ở RNA còn có uracil (U) thay cho thymine (T). Đường pentose (5C) desoxyribose gắn với nitrogenous base ở vị trí C1 sẽ tạo nên nucleoside. Nucleoside được gắn thêm nhóm phosphate vào C5 của đường pentose thành 23 nucleotide. Tính đặc hiệu của nucleotide do base, nên khi nói đến acid nucleic, base thường được sử dụng thay cho nucleotide. Cách gọi thường dùng là cặp base, kí hiệu bp hay kb (Phạm Thành Hổ, 2000, trang 140 - 141). Hình 2.11 Cấu tạo hóa học của acid nucleic 24 Phần 3. Vật liệu và cách thức tiến hành 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành  Quá trình chế tạo bắt đầu từ 3 / 2005 đến 8 / 2005.  Tiến hành chế tạo tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM.  Quá trình chế tạo tại Bộ môn Điều Khiển Tự Động trực thuộc khoa Cơ Khí.  Chạy mẫu kiểm tra và so sánh kết quả tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Linh kiện cho bộ khuếch đại tín hiệu từ cảm biến  Nhiệt điện trở Platine Pt100 (sản xuất tại Đức)  Sensor cảm ứng nhiệt Lm35 (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 1000 µF , 100 µF ,10 µF, 1 µF, 104 pF (sản xuất tại Đài Loan)  Điện trở sai số 1% không thay đổi theo nhiệt độ (sản xuất tại Singapore)  Biến trở vi chỉnh (sản xuất tại Đài Loan)  Điốt cầu 3A (sản xuất tại Trung Quốc)  Op07 (sản xuất tại Đài Loan)  Ổn áp 7805, 7905 (sản xuất tại Đài Loan) 3.2.2. Linh kiện cho mạch vi xử lý  Tụ 1000 µF,100 µF (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 33 pF,1000 µF, 100 µF (sản xuất tại Đài Loan)  Điốt cầu 3A  Vi xử lý AT90S8535 (sản xuất tại Đài Loan)  Thạch anh 4M  LM358 (sản xuất tại Đài Loan)  LCD 20 x 4 (Sản xuất tại Trung Quốc)  Ổn áp 7805  Phím 4x4  Optodiac P521 (sản xuất tại Đài Loan) 25 3.2.3. Linh kiện cho mạch khuyếch đại công suất  Điôt 10A, N4007 (sản xuất tại Nga và Trung Quốc)  Tụ : 2200 µF, 10000 µF  IRF 2807 (sản xuất tại Đài Loan)  Điện trở 1 MΩ 3.2.4. Linh kiện và thiết bị cho bộ nguồn  Biến áp các nguồn ra 9V(3A), 9-0-9(3A), 24V(15A) (sản xuất tại Việt Nam)  Điôt cầu 50A (sản xuất tại Đài Loan)  Tụ 10000µF,4700 µF  Ổn áp 7805, 7809, 7812, 7818, 7824  Transitor C3998 (sản xuất tại Đài Loan) 3.2.5. Linh kiện cho bộ luân nhiệt và nắp chống ngưng  TE 7000/127/085BS (sản xuất tại Singapore)  Dây điện trở cung cấp nhiệt  Nhôm tản nhiệt 10 x 21 x 3 mm  Quạt 10 cm x10 cm, DC 12V, 0,6A (sản xuất tại Nhật)  Mỡ Silicon  Keo chịu nhiệt (sản xuất tại Mỹ)  Fip 5 mm  Cao su silicon  Dây dẫn chịu nhiệt (sản xuất tại Nhật)  Giấy cách điện dẫn nhiệt 3.2.6. Vật liệu làm khung và vỏ máy  Inox 5 dem  Sắt V 2  Giấy cách điện  Thép chống từ  Máy bào kim loại 26  Máy khoan kim loại  Máy hàn  Máy cắt  Que hàn 5 mm  Máy đánh bóng 3.2.7. Hoá chất chạy PCR và dụng cụ điện di  DNA khuôn mẫu  dNTP  Taq polymerase  Primer  Dung dịch đệm thích hợp và MgCl2 3.3. Cách thức tiến hành 3.3.1. Thiết kế 3.3.1.1. Thiết kế khung và vỏ máy a. Bộ phận bên ngoài của máy Nắp chống ngưng tụ hơi nước được bố trí bên trên tiện sử dụng, phía trên nắp được thiết kế thêm nút điều khiển dễ sử dụng và chế tạo. Nút điều khiển điều khiển vị trí chống ngưng tụ hơi nước có hai chế độ: điều chỉnh theo ý muốn và điều chỉnh tự động nhờ lực đàn hồi của lò xo. Khóa cố định giữ nắp chống ngưng áp sát vào ống eppendorff trong suốt quá trình chạy mẫu. Khoá được thiết kế đơn giản và dễ chế tạo. Bàn phím nhập số liệu và LCD thiết kế nghiêng góc 480 so với đáy, thuận tiện cho thao tác và quan sát hiển thị trên LCD. b. Bộ phận bên trong Gồm biến áp, bộ khuếch đại, nhôm tản nhiệt, mạch vi xử lý, bộ chỉnh lưu điện xoay chiều thành điện một chiều. Biến áp và bộ khuếch đại được bố trí xa với mạch điều khiển nhằm hạn chế nhiễu. 27 Hình 3.1 Vỏ máy 28 3.3.1.2. Thiết kế bộ phận truyền tải nhiệt cho ống plastic (eppendorff) Dựa vào kích thước của ống eppendorff và tính năng của giếng, giếng thiết kế với chất liệu nhôm kích thước: 41 x 41 x 12 mm, mặt trên khoang 25 giếng, đường kính mỗi giếng 6 mm, sâu 11 mm và khoang thêm 16 lỗ phụ có vai trò làm giảm khối lượng. Tai ở đáy dày 1 mm, rộng 2 mm có vai trò cố định vào khối luân nhiệt. 3.3.1.3. Thiết kế tấm cố định Tấm cố định có vai trò giữ giếng đặt ống nghiệm (eppendorff), thermoelectric và tản nhiệt khít với nhau. Tấm cao su silicon có vai trò chống ẩm cho thermoelectric trong quá trình hoạt động. 93 9 3 53 5 3 Hình 3.3 Tấm cố định Hình 3.2 Giếng đặt ống eppendorff 1 1 2 1 1 2 41 3,5 61 29 93 9 3 53 5 3 Hình 3.4 Cao su silicon 3.3.1.4. Thiết kế nắp chống ngưng Nắp chống ngưng thiết kế gồm 2 lớp: lớp ngoài inox, lớp trong là fip cách nhiệt Thông số của nắp chống ngưng : Điện áp:16V Dòng điện: 3A Kích thước: 90 x 90 x 60 mm Tốc độ làm nóng :1,5oC/s ± 0,3 3.3.2. Chế tạo 3.3.2.1. Gia công bộ phận truyền tải nhiệt cho ống plastic (eppendorff) Nhôm được gia công có bề dày 12 mm. Giếng khoan trên chất liệu nhôm, dễ khoan và dẫn nhiệt tốt, thay đổi nhiệt độ n