Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền cây đưng (Rhizophora mucronata Lamk.) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

nh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản, hiệu quả, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận. [5], [10] 2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, tạo ra các đột biến gene, chẩn đoán phát hiện bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật và kiểm nghiệm thực phẩm. [5] Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi thực hiện điện di trên gel, nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt. 19 2.5.3. Quy trình phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau [5]. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc  Bƣớc 1 (biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn trong vòng 30 – 60 giây.  Bƣớc 2 (lai, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.  Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm). 20 Andy Vierstraete, 1999. Hình 2.5 Phản ứng PCR. [20] 2.6. Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – World Wildlife Fund (WWF) (1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. Đa dạng sinh học đƣợc xem xét trên ba mức độ: đa dạng hệ sinh thái, đa dạng loài và đa dạng di truyền. [13] Tính đa dạng trong thiên nhiên là nguồn tài nguyên vô tận của nhân loại, là nguồn gốc của sự thịnh vƣợng, cung cấp cho chúng ta toàn bộ thức ăn, phần lớn các loại nguyên vật liệu, hàng hoá và dịch vụ, cung cấp nguyên liệu di truyền cần thiết cho 21 nông nghiệp, dƣợc học, công nghệ. Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội đồng thời làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. Vì vậy, việc duy trì đƣợc tính đa dạng sinh học sẽ giúp loài ngƣời bảo vệ môi trƣờng sống, hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại do thiên nhiên hay do con ngƣời gián tiếp tạo nên nhƣ hiệu ứng nhà kính, băng các vùng cực tan, môi trƣờng đất, môi trƣờng nƣớc bị nhiễm độc phóng xạ. Chính việc lạm dụng tài nguyên thiên nhiên trong quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa con ngƣời đã, đang và sẽ gây ra những tác động lớn đến môi trƣờng làm rối loạn các hệ sinh thái tự nhiên và suy giảm tính đa dạng về sự sống trên trái đất. Trƣớc thực tế nhƣ hiện nay, việc nghiên cứu và bảo tồn tính đa dạng sinh học là một vấn đề cấp bách nhằm bảo đảm cho sự phát triển bền vững. 2.7. Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là sự đa dạng di truyền. 2.8. Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên đồng thời cũng quan trọng đối với con ngƣời. Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời. 22 2.9. Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử Từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene cùng với việc Watson và Crick phát minh ra cấu trúc chuỗi DNA năm 1953, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và trở thành công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học với độ tin cậy cao hơn. Hiện nay, con ngƣời đã tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử khác nhau, có thể chia ra làm 2 nhóm sau [7]:  Dựa trên PCR: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…  Dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP. 2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) 2.9.1.1. Khái niệm Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này lai với những probe đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao. [7], [9] RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase. 23 Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm. 2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP a. Nghiên cứu lập bản đồ gene Mc. Couch và ctv (1988) thiết lập bản đồ di truyền nhờ marker phân tử (RFLP) trên cây lúa gồm 135 loci [9], [10]. Bản đồ gồm 12 nhiễm sắc thể (NST) với tổng cộng 1.389 cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (indica) và Bulu Dalam (Javanica). Ba năm sau, bản đồ thứ hai từ quần thể IRAT117 (Japonica) và Apura (indica) đƣợc công bố (Mc. Couch 1991, Tanksley và ctv 1991). Saito và ctv (1991) thiết lập một bản đồ khác dựa trên cặp lai Kasalath (indica) và Fl134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM với 347 loci. Để phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á, Takashige và cộng sự (1995) đã sử dụng 12 probe DNA để nghiên cứu và đã xác định đƣợc mối tƣơng quan di truyền giữa các giống lúa nói trên. Qifa Zhang và cộng sự (1992) đã xác định đƣợc sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng) và Japonia (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP. Yu và cộng sự (1995) cho thấy một số marker hình thái (17 marker, thí dụ nhƣ vỏ trấu màu tím, lá không có lông, hạt gạo nâu, dạng cây lùn) có mối liên kết với marker RFLP. 24 b. Một số ứng dụng khác  Lập bản đồ gene cho bệnh đạo ôn và các gene kháng bệnh bạc lá, rầy nâu, sâu đục thân.  Marker phân tử trong di truyền và chọn giống.  Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.  Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể. 2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) 2.9.2.1. Khái niệm Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra. Sau đó đƣợc Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt bằng RE từ bộ gene của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 bp. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao. [1], [3], [15], [16] Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bƣớc cơ bản [24]  Bƣớc 1: Tách chiết DNA. AFLP đòi hỏi DNA phải có độ tinh sạch cao.  Bƣớc 2: Cắt giới hạn và gắn adapter. Bƣớc này gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn nhờ 2 enzyme cắt. Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ sung với những đoạn DNA vừa đƣợc cắt, để trong 2 phản ứng PCR sau ngƣời ta sử dụng những primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn. Để các đoạn DNA vừa cắt không bắt cặp với nhau, giai đoạn cắt giới hạn và gắn adapter đƣợc xem nhƣ một. 25 Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP. [36]  Bƣớc 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification). Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ bƣớc 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bƣớc 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở đầu 3’. Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI + 1 nucleotide (thƣờng là C). Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter EcoRI + 1 nucleotide (thƣờng là A). 26 Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp những đoạn DNA đƣợc cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lƣợng của những đoạn có thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn lọc). Việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt đƣợc nhiều đoạn bổ sung với adapter. Bƣớc này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %.  Bƣớc 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification). Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có trình tự tƣơng tự nhƣ primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở đầu 3’. Mục đích chính của bƣớc này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã đƣợc cắt giới hạn và gắn adapter đã đƣợc nhân bản ở bƣớc 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ sung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả. Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI + 2 hay 3 nucleotide. Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản phẩm khi điện di).  Bƣớc 5: Điện di và phân tích kết quả. Kết quả AFLP có thể đƣợc điện di trên máy giải trình tự gene hay điện di trên gel polyacrylamide. 2.9.2.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật AFLP a. Nghiên cứu đa dạng di truyền Sử dụng AFLP để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các giống điều (Anacardium occidentale L.) đang đƣợc trồng ở Đông Nam Bộ (Hồ Bích Liên và ctv., 2006) đã thu đƣợc một số kết quả [7]: Xác định đƣợc 7 / 64 tổ hợp mồi cho sản phẩm khuếch đại có mức đa hình cao. Tổ hợp primer AM – CTG / E – AGC cho tính đa hình cao nhất (139 / 141 sản phẩm 27 khuếch đại đa hình) trong tổng số 7 tổ hợp primer đƣợc chọn. Qua phân tích thấy rằng quần thể điều ở 3 tỉnh Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Đồng Nai có hệ số đồng dạng cao. Phát hiện đƣợc 17 chỉ thị phân tử có thể cho phép nhận dạng đối với 17 mẫu điều trong số 26 mẫu phân tích và có 21 chỉ thị có liên quan chặt với 10 tính trạng. Đặc biệt, có 4 chỉ thị (kích thƣớc 310 bp, 265 bp, 222 bp,111 bp) liên quan đến màu sắc của hoa và lá. b. Một số ứng dụng khác  Phân nhóm di truyền: phân nhóm di truyền gene khoai lang (Liu, 1999).  Bản đồ gene cloning.  Kỹ thuật “finger printing”. [7], [10] 2.9.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 2.9.3.1. Khái niệm Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. [1], [3], [7], [15] Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RAPD  Bƣớc 1: Tách chiết DNA. DNA đƣợc tách chiết có chất lƣợng tốt, tƣơng đối sạch và không bị gãy (smear) nhiều. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. Có RNA trong mẫu DNA. Có polysaccharide trong mẫu DNA. 28 WSSP/StudentScholars/project/archives/onions/rapd1.gif Hình 2.8 Nguyên lý kỹ thuật RAPD. [78] 1, 2, 3, 4, 5, 6: mồi. (A) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 2 và 5. (B) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 3 và 6. Có polyphenol trong mẫu DNA. Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác.  Bƣớc 2: Điện di phát hiện. Kết quả PCR – RAPD đƣợc điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.  Bƣớc 3: Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram), các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng có kích thƣớc dƣới 1.000 bp. Đó là lý do đoạn DNA đƣợc giới hạn giữa 2 mồi 1 và 4 không đƣợc khuếch đại. Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR:  Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên bảng gel điện di. Nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.  Nồng độ Mg++: nếu nồng độ Mg++ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau. 29  Taq - polymerase đƣợc cung cấp từ các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau. Vì vậy, nồng độ và thời gian sử dụng tối ƣu của mỗi loại Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm.  Kết quả không ổn định: cùng 1 mẫu DNA, cùng 1 thành phần hóa chất nhƣng mỗi lần thực hiện khác nhau có thể cho kết quả khác nhau. 2.9.3.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD  Về mặt kỹ thuật: RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lƣợng DNA mẫu không cần độ tinh sạch cao, lƣợng DNA cần ít, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao. [9]  Về mặt kinh tế: chi phí thực hiện thấp, kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao, tạo sự đa hình nhanh. [9] 2.9.3.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD cho kết quả không ổn định, mức độ giống nhau giữa các lần lặp lại thấp. [4], [9] 2.9.3.4. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RAPD Do tính hiệu quả nên RAPD nhanh chóng có vị trí xứng đáng trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền ở một số giống cây trồng một và hai lá mầm nhƣ lúa, chuối, khoai tây, bắp, dứa, bông cải, đậu nành, cà chua, dâu tây, cacao, cúc lai, cà phê. RAPD đƣợc xem là một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh. [4], [9]  Thái Kỳ Tài và cộng sự (2004) đã phân tích đƣợc tính đa hình 8 giống cà chua (KBT4, giống số 12, SG2.1, SG2.2, F21, F4, M21, M4), đồng thời cũng phân tích sự đa dạng di truyền các locus, sự tƣơng đồng gene và khoảng cách gene.  Hoàng Thị Bích Thủy và cộng sự (2004) đã khảo sát tối ƣu phản ứng RAPD và nghiên cứu tính đa hình DNA thông qua việc sử dụng 9 loại mồi (N1 – N6, P5 – P7) 30 trên 7 giống (dòng) dứa (Thái Lan có gai, Thái Lan, Lâm Đồng, Trung Quốc 220, Trung Quốc 250, Bình Phƣớc, Đắc Lắc).  Xu L.X và cộng sự (1994) ghi nhận sự đa dạng di truyền của 13 giống lúa nƣớc và lúa cạn qua sử dụng 42 cặp mồi ngẫu nhiên giàu G và C. 2.9.4. So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố, cụ thể nhƣ những ƣu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể đƣợc so sánh một cách tƣơng đối [16] theo những tiêu chí sau: Bảng 2.1: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử Các yếu tố chính RFLP AFLP RAPD SSR Allozyme Số lƣợng thông tin Khả năng đáng tin cậy Độ phân giải Cách tiến hành Thời gian tiến hành Thấp Cao Cao Khó Dài Cao Cao Cao Vừa phải Ngắn Cao Biến đổi Vừa phải Dễ Ngắn Cao Cao Cao Khó Dài Thấp Cao Vừa phải Dễ Ngắn 31 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ 7 tháng 5 năm 2007 đến 31 tháng 8 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm thực hiện Thu thập mẫu tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Phân tích di truyền tại trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 36 mẫu lá Đƣng đƣợc thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 3.2.1. Nguyên tắc thu thập mẫu  Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).  Thu thập lá của cây Đƣng (lá già, lá non, lá trƣởng thành).  Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác nhau nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh. 3.2.2. Cách ký hiệu mẫu Mẫu đƣợc đặt tên xx.yy với xx là tiểu khu, yy là thứ tự của mẫu. Ví dụ: 7.12 là mẫu thứ 12 thu thập ở tiểu khu 7, 2B.14 là mẫu thứ 14 thu thập ở tiểu khu 2B, hay 27 là mẫu thứ 27 thu thập đƣợc ở tiểu khu 10. 32 3.2.3. Cách lấy mẫu Chọn những lá tƣơi tốt, thu thập lá non, lá trƣởng thành và lá già. Mỗi mẫu lấy khoảng 2 - 3 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá. Đồng thời ghi những thông tin về cây: tọa độ, chiều cao thân cây, đƣờng kính thân, cây có nhiều sâu hay xanh tốt, cây mọc tự nhiên hay trồng. Mẫu đƣợc thu thập trên đƣờng thủy (26 mẫu: từ mẫu thứ 1 đến 26 thuộc các tiểu khu 1, 2, 7, 11, 12) và đƣờng bộ (10 mẫu: từ mẫu thứ 27 đến 36, thuộc tiểu khu 10). Khoảng cách trung bình giữa 2 mẫu thu thập là 500 m. 3.2.4. Cách bảo quản mẫu Mẫu lá tƣơi sau khi thu thập sẽ đƣợc đem về phòng thí nghiệm và bảo quản ở 40C. 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1. Quy trình ly trích DNA 3.3.1.1. Vật liệu dùng trong ly trích DNA a. Thiết bị và dụng cụ Chày và cối (Đức). Pippet các loại (Nichiry - Nhật Bản). Lò Viba (Electrolux). Eppendorf 1,5 ml (Pháp). Đầu típ các loại (Đức). Tủ lạnh 4oC và -20oC (Sanyo - Nhật Bản). Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức). Máy Vortex (IKA – Thụy Điển). Máy điện di (Biorad - Thụy Điển). Tủ hút (Việt Nam). Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ). Tủ cấy vô trùng (Anh). Tủ sấy (Jencons - Anh). Bồn ủ nhiệt (Memmert - Anh). Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản). Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad - Thụy Điển). b. Hóa chất ly trích EB. Sodium acetate. Chloroform : Isoamylalcohol. Ethanol 70 %, 100 %. Isopropanol TE 1X. 33 3.3.1.2. Quy trình ly trích DNA a. Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) gồm 11 bƣớc (đã bỏ qua bƣớc thêm RNase)  Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ (14.000 vòng / phút). Ủ ở 650 C trong 45 phút.  Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Thu 350 l dịch nổi.  Bƣớc 3: Lặp lại bƣớc 2. Thu 250 l dịch nổi.  Bƣớc 4: Thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bƣớc 5: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 1h.  Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều và để – 20 0C trong 30 phút.  Bƣớc 8: Ly tâm 10 phút 14.000 vòng ở 10 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng ở 10 0C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.  Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở - 20 0C. b. Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến thứ nhất gồm 12 bƣớc  Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Thêm 1,8 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút). Ủ ở 65oC trong 1h.  Bƣớc 2: Ly tâm 10.000 vòng trong 30 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.  Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 9.800 vòng trong 10 phút ở 4 0C. Thu 500 l dịch nổi. 34  Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.  Bƣớc 5: Thêm 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm.  Bƣớc 6: Ly tâm 9.800 vòng trong 10 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.  Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1h.  Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều. Ủ – 20 0C trong 1 h.  Bƣớc 9: Ly tâm 5.000 vòng trong 20 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 5.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1 h.  Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu ở - 20 0C. c. Quy trình 3: Quy trình ly trích cải tiến thứ 2 gồm 12 bƣớc  Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Nghiền trong nitơ lỏng. Thêm 1,2 ml dịch trích EB (có thêm PVP – Polyvinyl pyrrolidone, trong 100 ml EB sử dụng 2 g PVP), vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút) đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ ở 65 0 C trong 1h.  Bƣớc 2: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.  Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 500 l dịch nổi.  Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.  Bƣớc 5: Thêm 200 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm.  Bƣớc 6: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.  Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X. Ủ ở 37 0C trong 1h. 35  Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều. Ủ – 20 0C trong 1 h.  Bƣớc 9: Ly tâm 11.000 vòng trong 25 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 12.000 vòng trong 3 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1 h.  Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở - 20 0C. 3.3.1.3. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Dựng đƣờng chuẩn bằng dung dịch TE 1X theo hƣớng dẫn ghi trên máy đo hấp thu