Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm trắng (Avicenni alba) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

n vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta [9]. 15 Đa dạng sinh học là một trong những nguồn tài nguyên không thể thay thế đƣợc, là cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và bền vững của loài ngƣời [22]. 2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái Đây là sự đa dạng bao trùm nhất của đa dạng sinh học. Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và có mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trƣờng. Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh. Các nhân tố hữu sinh gồm có nhóm sinh vật tự dƣỡng – vật sản xuất sơ cấp (thực vật quang hợp), những sinh vật tiêu thụ sơ cấp (động vật ăn cỏ), những vật tiêu thụ thứ cấp (các động vật ăn thịt), và sinh vật phân hủy các chất hữu cơ giải phóng các chất vô cơ cung cấp trở lại cho thực vật. Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau của các kiểu quần xã sinh vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình). Tóm lại, hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao. Điều kiện môi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng [9]. 2.3.3.2. Đa dạng loài Sự đa dạng loài bao gồm số loài có trên Trái đất. Sự đa dạng này đƣợc thể hiện bằng số lƣợng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định. Loài đƣợc xác định bởi một trong hai cách:  Phân loại theo cấu tạo hình thái của loài: xác định theo nhóm cá thể có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhóm khác. Cách phân loại này thƣờng đƣợc các nhà phân loại học, sinh học vận dụng để định loại, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới.  Phân loại sinh học loài: là nhóm cá thể có khả năng giao phối với nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm khác. Cách 16 này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hóa và khảo sát các mối quan hệ về gien [8]. Những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế thƣờng phức tạp hơn rất nhiều so với lý thuyết (Rojas, 1992; Stanley, 1992). Một loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt những sự khác nhau theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Ngƣợc lại, các phân loài đôi khi giống nhau đến mức tƣởng nhƣ chúng là các thành viên của cùng một loài. Trong thiên nhiên đôi khi cũng tồn tại các loài “đồng hình”, các loài này rất giống nhau về cấu tạo hình thái hay sinh lý nhƣng lại cách ly về mặt sinh học và không giao phối đƣợc với nhau [8], [22]. Qua đó, ta thấy những nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới đƣợc thu thập chƣa đƣợc biết đến tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết. 2.3.3.3. Đa dạng di truyền Là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài. Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thƣờng bị ảnh hƣởng bởi những tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối đƣợc với nhau tạo ra con lai hữu thụ. Trong loài có thể bao gồm một hay nhiều quần thể. Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gien khác nhau. Sự đa dạng về bộ gien này là do các cá thể có các gien khác nhau, dù chỉ là rất ít. Gien là đơn vị di truyền cùng với nhiễm sắc thể đặc trƣng cho những protein riêng biệt. Những hình thái khác nhau của gien đƣợc thể hiện bằng những alen và những khác biệt do sự đột biến. Những alen khác nhau của một gien có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau. Những sự khác biệt về gien trong di truyền học đƣợc tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gien và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các 17 gien trong quá trình sinh sản. Các gien trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái. Tổng các gien và alen trong một quẩn thể là vốn gien của quần thể và những tổ hợp của các alen mà mỗi cá thể có đƣợc gọi là kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện đặc trƣng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trƣờng nhất định. Số lƣợng khác biệt nhau về gien trong một quần thể đƣợc xác định bởi số gien trong vốn gien đó, thƣờng mỗi gien có nhiều hơn một alen (các gien đa hình) và số các alen cho mỗi một gien đa hình. Sự tồn tại của các gien đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gien dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận đƣợc những alen khác nhau từ các gien của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gien cho phép các loài thích ứng đƣợc với sự thay đổi của môi trƣờng [9], [22]. 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam Việt Nam là một trong mƣời nƣớc có hệ sinh thái phong phú nhất trên thế giới. Việt Nam có khoảng 10 % số loài sinh vật của thế giới. Song sự đa dạng này đang bị đe dọa vì môi trƣờng sống bị hủy hoại bởi tình hình tăng dân số, việc xây dựng đập nƣớc và đƣờng xá cũng nhƣ việc mở rộng các hoạt động công nghiệp. Tình trạng tăng dân số và đô thị hoá đang gây sức ép đối với năng lực bảo vệ môi trƣờng. Mặc dù diện tích che phủ của rừng đã tăng lên, song mối quan tâm thực sự là vấn đề chất lƣợng. Một nửa số rừng nguyên sinh đã bị mất. Hiện có 700 loài sinh vật nằm trong danh sách các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Mức độ ô nhiễm thƣờng xuyên vƣợt quá mức độ cho phép, và riêng mức độ bụi ở các khu đô thị ít nhất cũng cao gấp đôi so với tiêu chuẩn tối đa. Vì vậy mà các loài sinh vật bị tiêu diệt dần và một số loài có nguy cơ tuyệt chủng, làm ảnh hƣởng xấu đến đa dạng sinh học [8]. 18 2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật DNA thực vật là nguyên liệu quan trọng trong những nghiên cứu đa dạng sinh học [6]. Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997). Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Mục đích cuối cùng là để thu đƣợc DNA tinh khiết cho những phân tích tiếp theo [2], [12], [14]. Quy trình chiết tách gồm 3 bƣớc cơ bản sau:  Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Mô đƣợc nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl, CTAB) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.  Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nƣớc). Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform và phenol, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein mà không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.  Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu.Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. 19 2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.5.1. Khái niệm Kỹ thuật PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq DNA polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu [8]. 2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR DNA mẫu: Đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mô lá, DNA động vật đƣợc ly trích từ máu, lông, mô. Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 10 – 50 ng DNA thuần khiết [1]. Nồng độ DNA có thể xác định đƣợc dựa vào chỉ số đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260 nm và 280 nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức : DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Trong đó:  OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm  OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm  n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100) Primer (mồi): Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác [2]. 20 Cặp primer là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F – primer (mồi xuôi) và R – Primer (mồi ngƣợc). dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP): Gồm dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau. Dung dịch buffer: Tạo môi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động. Taq DNA polymerase: Là một loại enzyme polymerase bền với nhiệt, cô lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nƣớc nóng, có vai trò kéo dài đoạn DNA cần khuếch đại. Ion kim loại Mg++: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động. 2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 40 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài 21 Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 30 - 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: biến tính DNA, bắt cặp, kéo dài [7]. Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép đƣợc tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 - 96 0 C). Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ này phụ thuộc vào primer nhƣng thƣờng là 50 - 560 C). Kéo dài: Kéo dài dây mới nhờ primer dƣới sự thực hiện của Taq DNA polymerase (72 0 C). Sau 30 - 40 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 4oC trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR. 2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp và trong nhiều lĩnh vực khác. Trong nghiên cứu genomic: multiplex PCR. Trong nghiên cứu y học: Phát hiện, chẩn đoán đƣợc nhiều loại bệnh do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng gây ra. Trong nông nghiệp: Chọn lọc giống cây trồng nhờ chỉ thị DNA (MAS), kiểm tra kết quả chuyển gien [8]. 2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR Ưu điểm của kỹ thuật PCR  Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện.  Độ nhạy rất cao.  Thao tác đơn giản.  Thời gian thực hiện nhanh.  Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.  Lƣợng mẫu cần ít. 22 Nhược điểm của kỹ thuật PCR [1], [7]  Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính.  Kích thƣớc của đoạn khuếch đại bị giới hạn. Phản ứng PCR chỉ cho kết quả tốt khi thực hiện với những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 1,5 kb. Với những đoạn có kích thƣớc trên 3kb, phản ứng PCR tỏ ra vô hiệu.  Sự sao chép bởi Taq DNA polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (đến 10-4, nghĩa là cứ khoảng 10000 nucleotid thì enzyme có thể gắn sai một nucleotid) 2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền Nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở thực vật nói riêng và ở sinh vật nói chung nằm ở thứ tự các bộ ba trên phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của chúng. Hiếm có các cá thể trong cùng một loài hoặc cùng một giống có thứ tự các bộ ba trên DNA trong bộ gien giống hệt nhau. Việc xác định tính đa dạng sinh học cực kì quan trọng trong chọn giống vì các vật liệu di truyền dùng để lai tạo thƣờng đƣợc đòi hỏi có tính đa dạng càng lớn càng tốt [8]. Để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các cá thể, quần thể về căn bản ngƣời ta thƣờng dựa trên các chỉ thị DNA. Chỉ thị DNA có thể đƣợc chia làm hai nhóm:  Nhóm không dựa trên PCR (non PCR-based): RFLP  Nhóm dựa trên PCR (PCR-based): SSCP, SSR, RAPD, AFLP Các phƣơng pháp này đều sử dụng sản phẩm DNA đã đƣợc chiết tách, tinh sạch từ khâu ly trích. 2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Là phƣơng pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn. Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy 23 các băng DNA hoàn toàn giống nhau về số lƣợng và kích thƣớc. Ngƣợc lại nếu có sự khác nhau về trình tự DNA (khác giống hoặc do đột biến) thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA. Phƣơng pháp tiến hành: DNA sau khi tách chiết đƣợc phân cắt bằng một enzyme nhất định, rồi chạy điện di, lúc này các đoạn DNA tách riêng ra với nhau tùy theo kích thƣớc của nó chạy trên gel agarose. Những đoạn DNA này đƣợc chuyển từ gel sang một thể rắn (tấm lọc nitrocellulose hoặc màng lọc bằng nylon), nơi nó bị cố định. Sau giai đoạn trƣớc khi lai DNA, ngƣời ta cố định các vị trí trên màng, nơi quá trình lai DNA sẽ xảy ra. Các DNA (gien liên kết với marker) sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (probe, hay RFLP marker) đƣợc đánh dấu bằng phóng xạ. Quá trình lai giữa DNA và probe nhƣ vậy đƣợc gọi là lai DNA. Sau khi lai, tấm lọc hay màng lọc đƣợc rửa để loại bỏ các probe không gắn, hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu. Tiếp sau đó, DNA lai với probe tự ghi trên biểu đồ phát xạ. Sau khi điện di, gel đƣợc chụp dƣới tia cực tím. Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục. DNA lai với probe sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X – quang. Các sọc có tính đa hình (polymorphism) có thể đƣợc quan sát để đánh giá [10]. RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase [3], [4], [11]. 2.6.2. Nhóm dựa trên PCR 2.6.2.1 SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) Ngƣời ta đã tìm thấy có sự chuyển dịch của đoạn DNA dạng dây đơn, ngắn, trong điều kiện chƣa qua quá trình biến tính DNA thành dây đơn . Ngƣời ta giả định rằng: sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA là do sự thay đổi ngoại hình của dây đơn (single – strand conformation). Sự thay đổi này làm cho DNA chuyển dịch trên gel, tạo ra thể đa hình [1], [4]. 24 Trong phân tích SSCP, phản ứng chuẩn PCR đã hoàn thành. Sản phẩm của PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa và ngâm vào trong nƣớc đá. Khi đó hiện tƣợng snap – back sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp. Để tránh hiện tƣợng đứt gãy cấu trúc thứ cấp, các mẫu phải đƣợc xử lý trong điều kiện lạnh. Nếu P32 đƣợc dùng trong PCR, thì phim chụp X – quang sẽ thể hiện vị trí của DNA trên gel. Nếu không, ngƣời ta sẽ dùng bạc để nhuộm gel. DNA khi nhuộm bằng bạc sẽ nhạy cảm gấp trăm lần nhuộm Ethidium bromide [11]. SSCP marker là công cụ rất mạnh và nhanh, nhƣng nó chỉ áp dụng cho việc tìm kiếm thể đa hình của những đoạn phân tử DNA tƣơng đối ngắn. SSCP có thể xác định tính chất dị hợp tử của những đoạn phân tử DNA (có cùng trọng lƣợng phân tử), và nó có thể phân biệt đƣợc sự thay đổi của một vài nucleotide nào đó. Ngƣời ta cho nó là công cụ hữu dụng trong xét nghiệm bệnh di truyền ở ngƣời. Trong thực vật, SSCP chƣa đƣợc phát triển nhiều. Ngƣời ta hi vọng, SSCP marker sẽ giúp cho việc phân nhóm di truyền ở con lai trở nên dễ dàng hơn, khi chúng ta có primer thích hợp đối với tính trạng quan trọng nào đó [11]. 2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) SSR là các trình tự hai nucleotide ((AC)n, (AG)n, (AT)n) hoặc ba nucleotide ((TAT)n, (TCT)n, (CAG)n) lặp lại. Do vậy nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa trên sự khuếch đại các trình tự lặp lại trên bộ gien bằng các primer đặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai đầu của locus microsatellite. Sản phẩm PCR là các đoạn DNA có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về độ dài đƣợc tách ra trên gel polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA. Do số lần lặp lại cao của microsatellite ở các cá thể nên sự đa hình cao hơn ở các trƣờng hợp khác nhƣ RFLP, RAPD và sự đa hình ở các cá thể khác nhau tất nhiên là khác nhau. Chiều dài các đoạn DNA qua điện di thƣờng có kích thƣớc 100 – 200 bp. Tuy nhiên, SSR thƣờng đƣợc phân tích trên DNA hệ gien nhỏ mang trình tự lặp lại và kích thƣớc của chúng đƣợc nhận biết sau khi điện di trên gel [4], [11]. SSR đƣợc thực hiện theo bốn bƣớc:  Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu. 25  Thực hiện phản ứng khuếch đại qua PCR với các primer đặc trƣng cho các đoạn lặp đơn giản.  Điện di kết quả trên gel polyacrylamid và tính toán số liệu, xác định mức độ giống và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA.  Xử lý số liệu bằng các phần mềm nhƣ Map Marker Program, SYSTAT, NTSYSpc lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại. 2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) AFLP, đa hình chiều dài các đoạn DNA đƣợc khuếch đại chọn lọc, do Vos và cộng sự phát minh 1975, là kỹ thuật đƣợc áp dụng để phân tích tính đa dạng của sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã đƣợc khuếch đại đồng thời nhờ phản ứng PCR [13], [18], [20]. Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản:  Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adapter đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trƣng cho các primer đã chọn trƣớc. Adapter là một đoạn oligonucleotide đôi, đƣợc tổng hợp nhân tạo và có trình tự tƣơng ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA đƣợc phân cắt bởi một loại enzyme nhất định.  Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại primer khác nhau.  Các thành phần tham gia trong phản ứng AFLP: Các enzyme: Để cắt DNA của bộ gien, 2 enzyme cắt hạn chế đƣợc sử dụng:  MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 4 base  EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 6 base Sau phản ứng cắt, có ba loại đoạn DNA thu nhận đƣợc: một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu kết thúc, một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở một đầu kết thúc này và MseI ở đầu kết thúc khác, và một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi MseI ở cả hai đầu kết thúc [13]. 26 Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI. Adapter: Adapters là trình tự sợi đôi chuyên biệt cho cả vị trí của EcoRI và vị trí của MseI. Sự gắn kết của adapter đối với DNA đã đƣợc cắt thay đổi vị trí cắt để ngăn chặn sự phân cắt thứ hai xảy ra sau khi đã gắn kết [13]. Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. Các primer: Có hai loại primer đƣợc sử dụng: Primer dùng trong khuếch đại tiền chọn lọc:  EcoRI A 5’-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3’  MseI C 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’ Primer này đƣợc thiết kế tƣơng ứng với adapter đã sử dụng, đồng thời có gắn thêm một nucleotide ở đầu 3’ để chọn lọc những đoạn DNA cần khuếch đại, cụ thể là EcoRI gắn thêm nucleotide A và MseI gắn thêm nucleotide C ở đầu 3’. Kết quả chủ yếu của việc chọn trƣớc PCR là các đoạn DNA đó có một vị trí cắt của MseI và EcoRI, và cũng có nucleotide quan tâm. Bƣớc khuếch đại tiền chọn lọc sẽ làm giảm đi sự phức tạp trong việc thu nhận những đoạn DNA [13]. 27 Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. Primer dùng trong khuếch đại chọn lọc: Là các primer khuếch đại tiền chọn lọc đƣợc thêm vào từ 1 đến 2 nucleotide ở đầu 3’. Ví dụ: EcoRI A gắn thêm CT và MseI C gắn thêm AG vào đầu 3’. Kết quả là so với primer đƣợc thiết kế tƣơng ứng với adapter thì primer khuếch đại chọn lọc có thêm ba nucleotide ở đầu 3’. Điều này giúp cho việc lựa chọn các đoạn DNA chặt chẻ hơn, giảm sự phức tạp khi đọc kết quả các đoạn DNA trên gel. Sau khi đƣợc khuếch đại PCR với các primer này, kết quả của mỗi mẫu đƣợc phân tích trên máy giải trình tự DNA. Việc chọn lựa sự khuếch đại với hai primer EcoRI và MseI là khuếch đại chủ yếu các đoạn DNA đƣợc gắn hai primer EcoRI-MseI. Các đoạn DNA EcoRI-EcoRI không đƣợc khuếch đại. Các đoạn DNA MseI-MseI không đƣợc nhận biết trong quá trình khuếch đại do không chứa chất phát huỳnh quang. Chỉ có những sợi chứa EcoRI đƣợc nhận biết [1], [13].  EcoRI 5’FAM-GACTGCGTACCAATTC ACT-3’  MseI 5’-GATGAGTCCTGAGTAA CAG-3’ 28 Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. Trên cơ sở đó quy trình thực hiện AFLP có thể gồm bốn bƣớc cơ bản:  Tách chiết và tinh sạch DNA.  Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng các cặp enzyme giới hạn chọn lọc có bổ sung adapter tƣơng ứng.  Tiến hành PCR hai giai đoạn với hai loại primer đặc hiệu, primer 1 + 1 nucleotide và primer 2 + 2 nucleotide.  Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập cây phát sinh chủng loại để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu. Ta có thể tóm tắt kỹ thuật AFLP nhƣ sau: 29 Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP.  Kỹ thuật AFLP có các ƣu điểm:  Lƣợng DNA cần cho phản ứng rất ít.  Cho kết quả nhanh, ổn định và các lần lặp lại có độ tin cậy cao do kỹ thuật AFLP có các điều kiện nghiêm ngặt của phản ứng PCR.  Kỹ thuật AFLP thực hiện trên nhiều đối tƣợng sinh vật khác nhau.  Không cần biết trật tự nucleotide của hệ gien.  Tạo nhiều băng khuếch đại – khả năng tạo đa hình cao, chỉ thị phân tử cho lƣợng thông tin cao.  AFLP đƣợc ứng dụng trong việc xây dựng bản đồ gien thực vật bao gồm:  Thiết lặp nhóm gien liên kết nhau trong một thể nhiễm sắc trong quá trình cho tạp giao.  Làm bão hòa các vùng có gien lạ đƣa vào.  Ƣớc lƣợng mức độ có quan hệ giữa các giống. 30 2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật này cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, mạch đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR [4]. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di [11]. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu [7]. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD nhƣ sau: 3’ 1 2 3 5’ DNA mẫu 5’ 4 5 6 3’ Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR.  Chú giải: Các mũi tên biểu thị cho các primer (các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 tƣợng trƣng cho các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào; các primer bắt cặp vào các vị trí 1, 2, 3 trên mạch đơn DNA mẫu 3’- 5’, các primer bắt cặp vào các vị trí 4, 5, 6 trên mạch đơn DNA mẫu 5’ - 3’. Trong trƣờng hợp này, có 2 sản phẩm PCR đƣợc tạo thành: Sản phẩm B Sản phẩm A 31  Sản phẩm A: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5.  Sản phẩm B: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 3 và 6.  Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại.  Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hƣớng vào nhau.  Kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc cơ bản:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR  Điện di