Khóa luận Bước đầu khảo sát quy trình chuyển gen chịu hạn GmNAC vào giống đậu tương ĐVN9 thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

MỤC LỤC

Trang

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2. Mục tiêu của đề tài 2

1.3. Yêu cầu của đề tài 2

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Nguồn gốc, vai trò và vị trí của cây đậu tương trong hệ thống cây trồng 3

2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 3

2.1.2. Tầm quan trọng của cây đậu tương 4

2.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 5

2.1.3.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 5

2.1.3.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 6

2.1.4. Giống đậu tương ĐVN9 7

2.1.5. Khái quát tình hình chịu hạn ở thực vật và ở cây đậu tương 7

2.1.5.1. Khái niệm về hạn 7

2.1.5.2. Đặc tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương 7

2.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 8

2.2.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 9

2.2.2. Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA 10

2.2.3. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 10

2.2.4. Biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 11

2.2.4.1. Hệ thống chuyển gen in vitro 11

2.2.4.2. Hệ thống chuyển gen in vivo 12

2.3. Hệ thống vectơ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 13

2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua A. tumefaciens 15

2.5. Tình hình về nuôi cấy mô và chuyển gen ở đậu tương 17

2.5.1. Một số nghiên cứu môi trường tái sinh ở thực vật và cây đậu tương 17

2.5.2. Một số nghiên cứu về chuyển gen ở đậu tương 19

2.6. Một số đặc tính đã được cải thiện ở cây đậu tương bằng kỹ thuật di truyền 20

2.7. Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen trên thế giới và trong nước. 22

2.7.1. Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen trên thế giới. 22

2.7.2. Tình hình sản xuất đậu tương chuyển gen ở Việt Nam. 23

2.8. Những nghiên cứu về gen GmNAC 24

2.9. Gen gus 26

2.10. Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vectơ biến nạp 27

Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 29

3.1.1. Vật liệu thực vật 29

3.1.2. Vật liệu vi khuẩn 29

3.1.3. Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm 30

3.1.3.1. Hoá chất 30

3.1.3.2. Máy móc và thiết bị 30

3.1.4. Phạm vi nghiên cứu 30

3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 30

3.2.1. Địa điểm 30

3.2.2. Thời gian tiến hành 30

3.3. Nội dung nghiên cứu 31

3.4. Phương pháp nghiên cứu 31

3.4.1. Thí nghiệm 1: Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào ĐVN9 31

3.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600nm) lên khả năng biến nạp gen vào đậu tương thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus vào ĐVN9 31

3.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng chất dẫn dụ Acetosyringone (AS) lên khả năng biến nạp vào đậu tương thông qua biểu hiện tạm thời của gen gus trên ĐVN9 31

3.4. 4. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen vào đậu tương thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus trên ĐVN9 32

3.4.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐVN9 32

3.4.6. Thí nghiệm 6: Chuyển gen chịu hạn GmNAC vào đậu tương ĐVN9 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 34

3.4.7. Thí nghiệm 7: Phân tích các cây đậu tương chuyển gen sau tái sinh bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen Hpt (kháng hygromycin) 35

3.5. Các chỉ tiêu đánh giá 37

3.6. Các phương pháp đánh giá 37

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

4.1. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen vào giống đậu tương ĐVN9 thông qua biêu hiện tạm thời của gen gus 38

4.2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600nm) lên tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 40

4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lên tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 42

4.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen vào đậu tương ĐVN9 thông qua tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus 43

4.5. Ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt là mầm trên giống ĐVN9 đến sự biểu hiện tạm thời của gen gus 45

4.6. Kết quả chuyển gen GmNAC giống đậu tương ĐVN9 sử dụng Agrobacterium tumefaciens 47

4.7. Kết quả phân tích, đánh giá các cây đậu tương sau khi chuyển gen chịu hạn GmNAC 48

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1. Kết luận 51

5.2. Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52