Khóa luận Bước đầu nghiên cứu sản xuất bột cacao bằng phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật

ình thổi sạch bụi khỏi hạt cacao. Hao hụt qua hệ thống làm sạch ước chừng 1 – 1,3% tính theo khối lượng. 2.2.2.2 Xử lý nhiệt Nếu hạt cacao không qua xử lý nhiệt sơ bộ mà đi thẳng vào giai đoạn rang, thì sẽ phát sinh nhược điểm sau: ¾ Hạt cacao có kích thước rất khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc loài (Forastero, Criollo hay Trinitario) do đó rất khó đảm bảo các hạt rang có độ chín đồng đều; các hạt nhỏ bị rang quá nhiệt trong khi các hạt lớn thì rang chưa tới. ¾ Hạt nguyên có kích thước khá lớn, nên bên trong và bên ngoài hạt có độ chín rất khác nhau ¾ Khi rang ở nhiệt độ cao khoảng 120 oC, dầu cacao rất linh động, dễ dàng bị vỏ hạt ca cao vốn có hàm lượng dầu thấp sẽ hấp thụ dầu cao cao mạnh, tổn thất dầu ca cao trong quá trình tách vỏ khoảng 5 – 6 %. Do đó, cần quá trình xử lý nhiệt sơ bộ để khắc phục các nhược điểm trên. Người ta cần nâng nhiệt độ trên bề mặt hạt cacao lên 90 – 100 oC để phần vỏ hạt mất nước và dễ tách rời khỏi lõi hạt ca cao. Nhờ vậy, tổn thất dầu ca cao trong quá trình thổi tách vỏ chỉ còn khoảng 1 %. 2.2.2.3 Rang Rang là một trong những công đoạn cần thiết trong kỹ nghệ chế biến ca cao và chocolate. Vai trò của quá trình rang có tác dụng nhiều mặt: ¾ Làm nảy nở chất thơm để tạo cho thành phẩm ca cao một hương và vị đặc biệt. Đây là vai trò chính yếu nhất của khâu rang ¾ Tách nhân (mảnh hạt) và vỏ, nhưng chỉ ở mức độ làm lỏng lớp vỏ hạt ¾ Loại một phần độ chua acetic của ca cao 15 ¾ Hạ thêm độ ẩm của hạt xuống đến 2.5 – 5 % để sấy khô phần nhân ca cao ¾ Phát triển màu sắc đặc thù chocolate ¾ Góp phần vô hoạt Salmonella và các vi sinh vật có hại khác. Những biến đổi trong quá trình rang i. Sự biến đổi về độ ẩm Hàm ẩm trước khi rang là 6 – 8 %. Sau khi rang còn 2 – 3 %. Độ ẩm thích hợp cho các quá trình như nghiền, ép dầu là 2 %. Nếu độ ẩm lớn hơn 3 %, độ nhớt khối chocolate tăng mạnh, việc sản xuất gặp nhiều khó khăn. Nếu độ ẩm nhỏ hơn 1 % mức độ nghiền và sản lượng ép dầu giảm; ảnh hưởng nhiều đến năng suất. ii. Sự thay đổi hàm lượng acid và các chất dễ bay hơi Trong quá trình hong khô ca cao trước đó đã tạo ra các amino acid tự do trong hạt ca cao. Các amino acid đó là một trong những tiền chất quan trọng để tao ra mùi hương chocolate, nhưng trong quá trình rang chúng sẽ bị phân huỷ một số. Có tám nhóm amino acid được phân lập ra và thấy rằng tất cả đều bị phân huỷ một phần, nhưng với các tốc độ khác nhau. Một điểm lưu ý là thành phần nitrogen tổng số trong hệ thống không hề bị mất mát, có lẽ là do sự kết hợp của các phức chất nitrogen với các đường khử. Akabori, 1932 đã cho rằng các đường khử có khả năng phân huỷ các amino acid, và sau đó hai ông Rohan và Steward tiếp tục công trình nghiên cứu trên hạt ca cao, đã chỉ ra rằng trong quá trình rang các đường khử đã bị huỷ hoại gần như toàn bộ. Qua sự biểu diễn trên đồ thị sử giảm dần của các amino acid tự do theo hàm lượng đường khử và giả thiết rằng cả hai nhóm chức này tương tác với nhau để sinh ra các sản phẩm bay hơi, có thể nói rằng nguyên nhân của sự phân huỷ một phần của các amino acids là do sự thiếu hụt các đường khử trong hạt ca cao. Các chất dễ bay hơi làm hạt ca cao có mùi khó chịu. Sau khi rang, hàm lượng của chúng giảm: hàm lượng acid dễ bay hơi từ 0.4 % (tính theo acid acetic) giảm xuống còn 0.3 %, lượng chất khô tổn thất trong quá trình rang khoảng 0.1 – 0.2 %. iii. Sự thay đổi hàm lượng chất chát Chất chát trong ca cao làm cho chocolate và bột cacao có vị chát và đắng đặc trưng. Chất chát gồm 2 loại: ¾ Chất chát thuỷ phân: là hợp chất mà các nhân phenol liên kết với nhau thông qua nguyên tử oxi. Chất chát thuỷ phân quan trọng là tanin 16 ¾ Chất chát ngưng tụ: là hợp chất mà các nhân phenol liên kết với nhau thông qua nguyên tử carbon. Chất chát ngưng tụ với nhau thì có tính chát. Trong hạt ca cao tươi chưa lên men có 0.6 –1 % catesin nhưng sau khi lên men chúng chuyển thành chất chát ngưng tụ L – epicatesin. Trong hạt ca cao khô đã lên men, lượng chất chát từ 3 – 6 %. Sau khi rang còn lại 2 – 3 % iv. Sự thay đổi chất màu Trong quá trình rang, L –epicatesin bị oxy hoá chuyển thành flobaphen có màu nâu đỏ đặc trưng của chocolate. Ngoài ra còn phải kể tới phản ứng Maillard giữa đường khử và acid amin, phản ứng caramel hoá. Tất cả những phản ứng này giúp tạo màu và quan trọng nhất là tạo mùi chocolate Các phương pháp rang hạt ca cao i. Rang gián đoạn Thường rang trong thùng quay: tác nhân truyền nhiệt là không khí nóng 250 – 300 oC được thổi vào thùng quay. Nhiệt độ ra của không khí 160 – 170 oC. Nhiệt độ hạt ca cao 120 – 125 oC. Thời gian rang từ 12 – 15 phút. Sau đó hạt được làm nguội nhanh xuống 30 – 40 oC nếu dùng phương pháp rang trước tách vỏ sau, nhằm ngăn chặn tinh dầu dịch chuyển từ lõi ra vỏ hạt. Tổn thất chất khô trong quá trình rang 0.2 – 0.3 %. ii. Rang liên tục Thiết bị rang liên tục nhằm kiểm soát chặt chẽ hơn các thông số trong quá trình rang, nhờ vậy mà chất lượng hạt rang tốt hơn nhiều. Thiết bị rang liên tục thường dùng là thùng quay dạng ống được cấp nhiệt trực tiếp hay gián tiếp, trao đổi nhiệt cùng chiều hay ngược chiều. Trong qui trình sản xuất của nhà máy, bột ca cao được rang trực tiếp bằng sản phẩm cháy của khí hoá lỏng propan – butan. Tuy loại nhiên liệu này đắt tiền nhưng rất sạch, caloriphe nhỏ gọn và quan trọng hơn là dễ dàng kiểm soát thông số trong quá trình rang. 2.2.2.4 Nghiền thô và phân ly Hạt nguội thì chuyển qua công đoạn nghiền thô và phân ly. Công đoạn này nhằm đề tách hoàn toàn vỏ ra khỏi mảnh nhân. Nghiền thô là tiến trình nghiền sơ bộ hạt ca cao rang nhằm làm vỡ lớp vỏ hạt. Trong khi nghiền thô cố gắng giữ sao cho các phần 17 tử vỡ ra của vỏ và mảnh nhân càng lớn càng tốt (85 – 90 % các phân tử nên có kích thước lớn hơn 3 mm) để tránh tạo ra các mảnh hạt quá vụn và bụi bặm. Nguyên lý của việc phân ly dựa trên sự khác nhau về khối lượng riêng của mảnh nhân và vỏ hạt. Máy ứng dụng các nguyên lý phân ly như phân ly cơ học dùng sàng, và phân ly động dùng quạt. Mục đích của việc phân ly là thu được hai cấu tử cơ bản: phần mảnh nhân có chứa một ít vỏ và mầm, và phần vỏ hạt chứa không đáng kể mảnh nhân. Thành phần có giá trị nhất của hạt ca cao chính là mảnh nhân, còn vỏ hạt xem như là phần bỏ đi. 2.2.2.5 Kiềm hoá Kiềm hoá nhằm làm gia tăng hương vị thơm ngon của chocolate và bột ca cao. Quá trình kiềm hoá phụ thuộc vào nồng độ và lượng chất kiềm, thời gian và nhiệt độ kiềm hoá. Trong quá trình này hàng loạt các tác động khác nhau: ¾ Sự hấp thu của nước dẫn đến sự trương nở của thành tế bào, protein, tinh bột và các chất sợi, tạo thuận lợi cho các phản ứng hoá học. ¾ Trung hoà các acid tự do như acid acetic, citric, tartric…, làm độ chua của chocolate giảm rõ rệt ¾ Hydrate hoá các ester để tạo thành các hợp chất có mùi thơm ¾ Làm giảm hàm lượng các hợp chất tanin và sản phẩm ít chát hơn ¾ Phá huỷ cấu trúc của protein, tạo thành các acid amin, hợp chất amin, amoniac tự do, các hợp chất globulin hay các protein thứ cấp khác ¾ Phản ứng Maillard giữa đường khử và acid amin tự do làm tăng cảm quan về màu sắc và mùi vị ¾ Sự phân huỷ các hợp chất glucid góp phần tạo sản phẩm một mùi vị giống như của vanille, tạo các sản phẩm đặc trưng của phản ứng caramel hoá ¾ Trung hoà các acid béo tự do, tạo thành các sản phẩm của phản ứng xà phòng hoá ¾ Phá huỷ một phần lecithin có trong ca cao, một chất bảo quản và chất nhũ tương tự nhiên của ca cao. Hai tác động cuối gây bất lợi đối với chất lượng bột ca cao. Do đó cần chú ý tác dụng tiêu cực này Việc kiềm hoá thực hiện bằng cách tẩm dung dịch kiềm 3 – 8 % (K2CO3, Na2CO- 3, KOH hay NaOH) vào bột ca cao và ủ trộn trong thùng quay ở nhiệt độ 70 – 80 oC trong 30 – 45 phút. Lượng kiềm cho vào vừa đủ để nâng pH của bột ca cao từ 4.5 – 5 18 lên 6.8 – 7. Tuỳ theo yêu cầu chất lượng của chocolate và bột ca cao mà các thông số trên có thể thay đổi rất khác nhau. 2.2.2.6 Sấy bột kiềm Mảnh nhân sau khi kiềm hoá ẩm được sấy ở 90 – 100 oC để đạt độ ẩm sau cùng là 1.5 – 2 %. Độ ẩm bột có ảnh hưởng quan trọng hiệu suất ép tách bơ cũng như độ nhớt của chocolate và bột ca cao do đó cần khống chế độ ẩm trong giới hạn nói trên 2.2.2.7 Nghiền mảnh nhân Mảnh nhân chứa cỡ 55 % bơ ca cao, có trong các tế bào ở pha rắn. Các thành tế bào bị phá huỷ trong tiến trình nghiền và nhiệt sinh ra do ma sát sẽ nâng nhiệt độ lên trên 34 oC, điểm nóng chảy của bơ ca cao, làm lỏng hoá chất béo tạo thành một chất bột nhão. Khi tiến trình tiếp tục, kích thước các phần tử nghiền giảm dần và chất bột nhão càng ngày càng có dạng lỏng, còn gọi là rượu mùi ca cao (cocoa liquor). Hỗn hợp này gồm các phần tử chất rắn lơ lửng trong thề pha chất béo liên tục Bột ca cao nhào nghiền xong có thể dùng hoặc để sản xuất bơ ca cao và bột ca cao, hoặc để làm chocolate. Người ta có thể giữ nó ở thể lỏng bằng nhiệt, hay để nó nguội và trở thành rắn thường gọi là ca cao khối. 2.2.2.8 Ép Mục đích của công đoạn ép rượu mùi ca cao (khối bột nhão) để tách bơ ca cao ra khỏi các thành phần không chứa chất béo. Bơ ca cao là một trong nhưng chất béo có giá trị rất cao. Nó không những để sản xuất ra chocolate mà còn sử dụng trong các ngành dược phẩm (chế supputoira), ngành mỹ phẩm (son đánh môi) nhờ đặc tính nhiệt độ tan chảy thấp khoảng 34 – 35 oC, và bơ ca cao kém chất lượng còn dùng được trong ngành sản xuất xà phòng. Bột ca cao đem ép có hàm lượng bơ ban đầu khoảng 55.5 %, sau đó giảm xuống còn khoảng 18 % (bột ép có hàm lượng bơ như vậy thích hợp làm thức uống). Áp lực tác động lên bột ca cao đạt tới 380 – 400 kg/cm2. Nhiệt độ bột ca cao đem ép cần đạt 65 – 70 oC để giảm độ nhớt của dầu ca cao, dầu ca cao sẽ dễ thoát ra hơn. Thời gian ép khoảng 5 – 10 phút. 2.2.2.9 Xay bánh dầu Bánh dầu ca cao sau khi ra khỏi mâm ép sẽ rơi vào thùng chứa hoặc trên một băng chuyền để tiếp tục được xay xát (nghiền tinh) để thành bột mịn hơn. Cấu trúc bánh dầu ép rất kết chặt, đặc biệt là khi bánh có hàm lượng chất béo thấp. Trước khi xay xát bánh được đập vỡ ra. Mục đích để đập vỡ bánh dầu thành từng 19 miếng có kích thước nhỏ hơn 5 mm, trước khi đưa vào xay trong các máy xay xát kiểu con lăn 2.2.2.10 Sàng Sản phẩm bột ca cao cuối cùng được sàng qua vải lọc, nylon hoặc lưới kim loại trước khi đem đi đóng gói bằng vật liệu chống hút ẩm 2.3 GIỚI THIỆU VỀ CELLULOSE, PECTIN, CELLULASE, PECTINASE 2.3.1 Giới thiệu cellulose Cellulose là một loại homocellulose gồm nhiều đơn vị β – D - glucose và được nối với nhau bởi liên kết β - D - 1,4 glucozit. Mức độ polymer hóa của phân tử cellulose thay đổi nhiều từ vài chục đến vài vạn đơn vị (15 – 15000) nhưng thường trung bình là khoảng 300 đơn vị β-glucose Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose Phân tử cellulose kéo dài thành chuỗi, nhiều chuỗi nằm song song với nhau và chúng gắn kết với nhau thông qua liên kết hydro. Như vậy cầu nối hydro có thể tạo nên giữa hai chuỗi cellulose trong cùng một lớp và giữa hai chuỗi cellulose ở hai lớp khác nhau.. Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi này liên kết lại thành bó gọi là các microfibrin có cấu trúc không đồng nhất. Chúng có những phần kết tinh và những phần vô định hình nhưng phần lớn cellulose trong thiên nhiên có cấu trúc kết tinh. O O O OH OH CH2OH n O O CH2OH OH OH O CH2OH OH OH OH - D - glucopyranoseβ n 20 Những phần kết tinh không liên tục mà xen kẽ trong chuỗi cellulose. Kích thước chuỗi kết tinh này khác nhau tùy thuộc vào nguồn cung cấp cellulose nhưng thường thì đường kính dao động từ 60 – 100 Ao và dài 600 – 1500 Ao. Các sợi microfibrin có chiều rộng khoảng 100 – 300 Ao và chiều dày khoảng 40 – 100 Ao. Tính chất chung của cellulose ¾ Cellulose là một trong những chất tự nhiên khá bền, không tan trong nước nhưng có thể hút nước và trương nở lên. Tuy nhiên, chúng có thể bị phân hủy trong điều kiện nước có nhiệt độ cao và áp suất lớn, hay trong dung dịch có chứa tác nhân acid hay kiềm mạnh. ¾ Cellulose có thể bị phân hủy ở nhiệt độ 40 – 50 oC thường nhưng với điều kiện phải có mặt enzyme cellulase ¾ Cellulose có cấu tạo từ các đơn vị C6H10O5 nhưng cấu tạo phức tạp hơn rất nhiều so với tinh bột và cho màu nâu với Iod Trong tế bào thực vật cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin, lignin. Điều này ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hủy cellulose của enzyme. Trong tự nhiên không có sinh vật nào có đầy đủ các hệ enzyme vì thế để phân hủy phức cellulose thì đòi hỏi có sự kết hợp của nhiều vi sinh vật khác nhau Dạng kết tinh vô định hình dễ bị phân hủy bởi enzyme vi sinh vật, nhưng dạng kết tinh thì có cấu trúc rất chặt chẽ nên khó bị phân hủy. Ở các loại gỗ càng có nhiều vùng kết tinh thì gỗ càng chắc. Muốn phá hủy hoàn toàn cellulose thì trước tiên phải chuyển chúng sang dạng vô định hình nhờ các loại enzyme khác có ở vi sinh vật 2.3.2 Giới thiệu enzyme cellulase Enzyme cellulase có thể chia thành 3 enzyme như sau ¾ Enzyme C1 ¾ Enzyme C2 Trong loại này có thể chia làm hai loại enzyme nhỏ o Cellobiohydrolase (CBH) có tên khác là exo-β-1,4 glucanase hay exocellulase o Endoglucanase có tên khác là endo β-1,4-D-glucanase hay β-1,4 glucan-4-glucanohydrolase 21 ¾ β-glucozitase có tên khác β-D-glucozit-glucohydrolase, hay cellobiase Theo nhiều tác giả khác nhau thì cơ chế tác động của hệ enzyme cellulase có nhiều kiểu tác động khác nhau. Theo Mandels và Reese (1964) thì: Hình 2.2: Sơ đồ tác động enzyme cellulase lên cellulose theo Mandels và Reese Trong đó C1 là nhân tố tiền phân hủy nhưng đặc hiệu, chỉ có tác dụng làm trương tạo thành các chuỗi cellulose mạch ngắn, các chuỗi này lại bị tấn công bởi Cx. Các vi sinh vật sinh trưởng trên cellulose phức tạp có trật tự sắp xếp cao thì tổng hợp cả hai C1 và Cx. Trong tự nhiên người ta cũng tìm thấy có hiện tượng phối chéo tức là C1 sinh ra từ loài nấm mốc này nhưng Cx lại sinh ra từ một loài nấm mốc khác. β-glucozitase ở cuối chuỗi có tác dụng lớn trong việc phân giải hoàn toàn cellobiose thành glucose. 2.3.3 Giới thiệu về pectin Khối lượng phân tử pectin trong khoảng 3.000 – 280.000, ty nguồn gốc thực vật. Dung dịch pectin có độ nhớt cao. Độ hòa tan của pectin trong nước phụ thuộc vào mức độ ester hóa nhóm cacbonyl. Mức ester hóa càng cao độ hòa tan càng cao. Dưới tác dụng của axit, protopectinase hay đun sôi protopectin chuyển thành pectin hòa tan. Pectin hòa tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzym pectase sẽ giống nhóm metoxi tạo rượu metylic và axit pectic tự do. Pectin là dẫn xuất polysaccharide phân tử của chúng bao gồm các đơn vị mắt xích là axit -D-galacturonic. Các đơn vị này nối với nhau nhờ liên kết 1-4 glucozit. Cellulose hoạt động Cellulose Cellobiose Glucose C1 Cx -glucozitase β 22 Mỗi đơn vị mắt xích chứa một nhóm cacboxyl ở vị trí C6, các nhóm axit này tồn tại ở dạng tự do hay dưới dạng liên kết ester (như metyl ester). Trong pectin tự nhiên có khoảng ¾ số nhóm axit bị metyl hóa. Các nhóm hydroxyl ở C2 và C3 của mỗi đơn vị mắc xích có thể bị ester hóa một phần bởi axit acetic hoặc axit phosphoric. Một phần nhóm axit không ester hóa tham gia tạo liên kết ngang với ion canxi và magie. O COOH OH O O COOH OH OH O O COOH OH OH O O OH Hình 2.3: Cấu trúc của axit polygalacturonic. 2.3.4 Giới thiệu enzyme pectinase i. Nhóm hydrolase Gồm có enzym pectinesterase và enzym polygalacturonase ™ Pectinesterase (PE) Theo H. lineviver, pectinesterase có ái lực với nhóm metoxy ở vị trí 5 lớn hơn với các nhóm metoxy ở vị trí 3 và 7. Hình 2.4: Sơ đồ phân cắt của enzym pectinesterase. COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3COOH 1 2 3 4 5 6 7 COOCH3 8 COOCH3 9 II I II Như vậy, sự phân cắt nhóm metoxy sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đầu từ nhóm −COOH tự do. Kết quả tạo thành axit pectinic hoặc axit pectic và rượu metanol. 23 ™ Polygalacturonase (PG) PG còn có tên gọi là poly-α-1,4-galacturonit glucanohydrolase. PG là enzym xúc tác sự phân cắt các liên kết glucozit 1-4 ở trong các mạch của pectin . PG là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao khi tác dụng với cơ chất. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác động trên cơ chất, H.Deuel và E.Stutz (1958) đã chia ra như sau: 9 Polymetilgalacturonase (PMG):Enzym tác dụng trên axit polygalacturonic đã được metoxyl hóa (tức là pectin). Enzym này thường có tên gọi hệ thống là poly-α-1-4-galacturonic metil esteglucanohydrolase và có mã số 3.2.1.11. PMG lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt liên kết ở trong hay ở cuối mạch của pectin là: Endoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu I (endo-PMG-I) và Exo- glucosidase-polimetilgalacturonase kiểu III (exo-PMG-III). 9 Poligalacturonase: Enzym này tác dụng trên axit pectic hoặc axit pectinic, chia thành hai nhóm nhỏ: Endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II (endo-PG-II) và Exoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu IV (ex-PG- IV) ™ Nhóm Transeliminase (TE) Nhóm enzym này mới được tìm ra cách đâu không lâu. Nhóm enzym này phân cắt phi thủy phân chất pectin với sự tạo ra nối kép ở trong gốc galacturonic giữa nguyên tử carbon thứ 4 và thứ 5. Khi đứt liên kết α-1-4 bởi transeliminase thì hydro từ nguyên tử carbon thứ 5 của gốc axit galacturonic này được chuyển đến nguyên tử carbon thứ nhất của gốc axit galacturonic khác. Phản ứng xảy ra dễ dàng trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Hình 2.5: Sơ đồ phân cắt của enzym transeliminase. O OH OH H H H H O O COOH OH OHH H O H O H C OH OH O H H H H OH OH3C O H C OH OH H H H O OH3C O C OH3C 24 Transeliminase tác dụng được trên pectin cũng như trên axit pectic. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng có thể phân thành những nhóm enzym sau: 9 Pectin−traseliminase có tên gọi hệ thống là poli α-1-4 galacturonit- metilesterglucano-liase và mã số là 4.2.99.8. Những enzym tác dụng trên pectin và axit pectinic. Các enzym này lại phân thành: Endo- pectintranseliminase kiểu I ( Endo-PTE-I) và Exo-pectintransemilinase kiểu III ( Exo–PTE–III). 9 Poligalacturonat–transeliminase có tên gọi hệ thống là poli α-1-4 D- galacturonit glucanoniase và mã số là 1.2.99.3. Đây là những enzym tác dụng trên axit pectinic và axit pectic. Enzym này lại chia làm 2 loại: Endo polygalacturonat-transeliminase kiểu II (Endo-PGTE-II) và Exopolygalacturonat-transeliminase kiểu IV (Exo-PGTE-IV). 25 PHẦN 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Thời gian thực hiện : từ ngày 15/3/2005 đến 15/7/2005 Địa điểm thực hiện : đề tài được nghiên cứu và thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh hoá thuộc Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 NGUYÊN LIỆU 3.2.1 Trái cacao Trái ca cao tươi được lấy từ huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Trước khi lấy hạt để lên men trái ca cao được lưu trữ ở nơi thoáng mát trong 7 - 9 ngày. Mục đích của quá trình này là giúp cho lớp cơm nhầy bao quanh hạt giảm đi giúp làm giảm độ ẩm của khối lên men sau này. Sau khi lưu trữ hạt được tách khỏi trái tươi. Sau khi tách hạt cần phải ủ ngay và không được lưu quá 20 ngày (Phạm Hồng Đức Phước, 2004). 3.2.2 Giống vi sinh vật Chủng được sử dụng là Aspergillus niger được lấy từ hai nguồn: ¾ Nguồn thứ nhất: từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học bộ môn Công nghệ sinh học đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh ¾ Nguồn thứ 2: từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên Chủng Aspergillus niger Thuộc nhóm: Aspergillus niger Giống: Aspergillus Họ: Aspergillaceae 26 Giống đưa vào nghiên cứu được bảo quản trong môi trường PGA giữ ở nhiệt độ 4oC. 3.2.3 Nguyên liệu làm môi trường Malt: là thành phần chính của môi trường malt để nuôi cấy nấm mốc. Malt rất giàu đường và các khoáng chất cho sự phát triển của nấm mốc. Malt được sử dụng trong thí nghiệm này là loại malt đã được xay nát dùng để sản xuất bia lấy từ khoa Công nghệ thực phẩm trường Cao đẳng công nghiệp thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh Cám: trong cám gạo có chứa nhiều chất dinh dưỡng giúp cho nấm mốc phát triển tốt như: protein, lipid, tro, cellulose; các loại khoáng Na, Ca, K, Zn, Fe và các loại vitamin. Cám được sử dụng trong thí nghiệm là cám gạo được mua tại chợ Bình Tây thành phố Hồ Chí Minh. Trấu: được đưa vào môi trường với mục đích tạo độ thoáng, xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Đồng thời theo một số nghiên cứu cho thấy trấu là nhân tố kích thích hệ enzyme cellulase rất tốt ở các loài nấm mốc. Trong thí nghiệm này trấu được mua từ chợ Kim Biên thành phố Hồ Chí Minh là loại trấu khô, không bị mục nát, không lẫn nhiều các tạp chất khác Cà rốt: là thành phần kích thích sự tổng hợp của enzyme pectinase. Cà rốt sử dụng trong thí nghiệm này được lấy từ nông trường Sông Hậu. Agar: sử dụng agar của công ty đồ hộp Hạ Long Muối sunfat amon (NH4)2SO4 là nguồn đạm bổ sung cho sự phát triển bình thường của nấm mốc. 3.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 3.3.1 Môi trường thạch malt Chúng tôi sử dụng môi trường malt để cấy truyền và phục hồi giống. Cách tiến hành làm môi trường Malt như sau 27 Lấy 200 g malt đã được xay nát cho vào becher 1000 ml. Thêm nước cất cho đủ 1000 ml. Đặt becher trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 55 oC trong 1 giờ, sau đó tăng lên 65 oC trong 1 giờ sau. Trong quá trình thủy phân dịch malt được khuấy trộn để tăng khả năng thủy phân tinh bột. Quá trình thủy phân tinh bột tạo một lớp nước có màu nâu đục phía trên. Khi kết thúc quá trình thủy phân ta gạn thu phần dịch malt có màu nâu đục ở phía trên. Lọc qua bông gòn thấm nước để loại bỏ một số tạp chất còn sót lại. Dịch malt sau khi lọc được bổ sung agar với hàm lượng 18 ‰ thể tích dịch malt Đun sôi dịch malt và agar trên bếp ở nhiệt độ không quá cao và tiến hành khuấy liên tục tránh hiện tượng caramel hóa Chuẩn bị ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống khoảng 3 ml dịch malt Làm nút bằng bông gòn y tế không thấm nước và bao đầu ống nghiệm bằng giấy báo. Đem thanh trùng ở 121 oC, 1 atm, trong 15 phút Đặt nghiêng ống nghiệm tạo môi trường thạch nghiêng. Giữ môi trường malt ở nhiệt độ 4 oC 3.3.2 Môi trường nhân giống Chúng tôi sử dụng môi trường nhân giống có thành phần môi trường được lấy theo kết quả nghiên cứu của thạc sĩ Lê Hồng Phú trong luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ”. Môi trường này đã được xác định là thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme cellulase và pectinase của Aspergillus niger. Cụ thể nuôi cấy trên môi trường nhân giống có thành phần: cà rốt 9 %, trấu 15 %, cám 75 % và (NH4)2SO4 1 %, độ ẩm 64 %, thời gian 40 giờ. 28 Cách thực hiện môi trường nhân giống: Cấy Asp. niger trên môi trường thạch malt Thêm 10ml nước cất vào mỗi ống 48 giờ; 34,5 oC Dùng que cấy mài nhẹ trên mặt thạch tách bào tử Cân 75% cám, 9% cà rốt, 15% trấu, 1% (NH4)SO4 Thêm nước (V ml), trộn đều và cho vào erlen Thanh trùng ở 121oC, 1atm, 20 phút Lưu trữ ở nhiệt độ 34,5 oC trong 40 giờ Trộn đều Thể tích nước cất thêm vào (V ml) khi trộn các thành phần của môi trường nhân giống theo công thức: V ml = 64%.m – (w1.m1 + w2.m2 + w3.m3 + 10) Trong đó: V ml: lượng nước thêm vào để trộn các thành phần môi trường nhân giống 64%: độ ẩm của môi trường nhân giống m: khối lượng môi trường nhân giống w1, w2, w3: độ ẩm của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt m1, m2, m3: khối lượng của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt 10: thể tích nước cất thêm vào để tách bào tử Asp. niger từ môi trường thạch malt 3.3.3 Chế phẩm sinh học Mục đích của việc tạo chế phẩm là tạo môi trường dinh dưỡng cho nấm mốc phát triển, dễ sử dụng, và dễ bảo quản 29 Aspergillus niger sau khi được nhân giống trên môi trường bán rắn được trộn với bột mì rang vàng. Thêm nước cất để chỉnh độ ẩm của môi trường chế phẩm về độ ẩm mong muốn. Chế phẩm sau đó được đưa vào bịch nylon có sử dụng bông gòn làm nút. Mục đích của việc sử dụng bông gòn làm nút để giúp cho môi trường chế phẩm ở trạng thái hiếu khi nhưng vẫn không làm phát tán bào tử Asp. niger ra ngoài môi trường. Chế phẩm sau đó được cất giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 34,5 oC trong 3 ngày. 3.4 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.4.1 Dụng cụ và thiết bị Máy khúc xạ kế Cân phân tích Máy đo mật độ quang OD Tủ sấy Tủ ấm Tủ lạnh Bình hút ẩm Máy đo pH Bình tam giác Máy xay Bercher Erlen Pipette Bình định mức Ống đong Phễu lọc Que cấy Các loại chai lọ đựng hóa chất Đũa thủy tinh Bể điều nhiệt Máy vortex 30 Máy lắc mẫu Máy ép thủy lực Máy khuấy từ Tủ hấp Bình Kjeldahl 3.4.2 Hóa chất cho phân tích Nước cất NaOH HCl CMC (sodium carboxymethyl – cellulose) H2SO4 Cồn (C2H5OH) 96o Thuốc thử anthrone Antron