Khóa luận Bước đầu nghiên cứu tận dụng bã men bia để sản xuất nước chấm lên men

0g Co 2.1mg/100g SiO2 16.3mh/100g Se 4.4mg/100g Fe 6.8mg/100g P 1430mg/100g ( Vydavatelstiro S.A., 1969 ) 4.Các hƣớng tận dụng bã men bia. Men bia đã đƣợc ứng dụng trong trị liệu y học vào khoảng 400 trăm năm trƣớc công nguyên tại Ai cập cổ đại do bác sĩ Hippokrates tiến hành. Nhƣ thế ta có thể thấy việc sử dụng men bia trong việc trị liệu đã có từ rất xa xƣa. 15 Vào khoảng thế kỷ thứ XV, XVI mặc dù ngƣời ta nhận thấy rằng bia đục chƣa qua lọc có tác dụng tƣơng đối tốt đối với cơ thể con ngƣời, nhƣng men bia vẫn không đƣợc sử dụng một cách rộng rãi. Nguyên nhân có thể là do men bia có dạng sánh lỏng bỏng, dễ bị thối hỏng và rất khó sử dụng. Một phần có thể là do trƣớc đây chƣa có kỹ thuật sấy khô men bia có khối lƣợng lớn. Tại Nhật Bản, vào năm 1930, lần đầu tiên bánh men bia cô đặc xuất hiện trên thị trƣờng dƣới dạng men khô. Khi đó, men cô đặc trong nhiệt độ vƣợt không quá 400C. Hay nói cách khác, men khô lúc đó sẽ lên chuyển hoá thành chất đƣờng glucose, và có khả năng chế biến rƣợu. Tuy nhiên, sau đó ngƣời ta thấy rằng, so với men bia tƣơi hoặc men bia sấy khô dƣới nhiệt độ thấp, men bia đƣợc sấy ở nhiệt độ cao ( trên 1000C ) cho hiệu quả cao hơn về vitamine cũng nhƣ acid amine, và dần dần men bia đƣợc chế biến có dạng cô đặc nhƣ ngày nay. Màng tế bào men bia sống rất cứng, khó phân huỷ, nếu để nhƣ thế và ăn, thì khi bài tiết ta sẽ thấy trong phân, tế bào men bia vẫn giữ nguyên hình dạng ban đầu. Trƣớc những năm 60, 70 khi đó ý thức về môi trƣờng còn thấp, ngƣời ta sử dụng men bia làm thức ăn dinh dƣỡng hoặc làm các loại thuốc đặc trị chữa các loại bệnh nhƣ lao, bệnh thấp khớp… Sau đó, men bia đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn càng ngày càng nhiều, ngành sản xuất bia cũng phát triển, kéo theo công tác nghiên cứu sao cho ứng dụng men bia một cách có hiệu quả cũng phát triển theo, và xuất hiện kỹ thuật chiết men bia. Ngày nay, việc tận dụng men bia dƣ thừa không chỉ có lợi cho chính sách môi trƣờng, mà còn giúp cho các ngành sản xuất thuốc, thức ăn gia súc và gia vị phát triển. 4.1 Sản xuất men khô. 4.1.1 Mục đích của việc sấy khô men tƣơi Để giữ men không bị biến dạng hoặc hỏng Giữ gìn, duy trì các thành phần của men Giúp men đặc tính có thể bảo quản lâu dài Giúp men có thêm đặc tính dễ sử dụng 16 Tăng cƣờng tính chất hấp thụ tiêu hoá của men Tiêu diệt các vi khuẩn có hại 4.1.2 Các loại máy sấy khô Sấy khô men dạng lỏng sánh ( thành phần khô chiếm từ 14-15% ) Máy sấy dạng trống ( drum dryer ) ( máy sấy dạng trống đơn- single drum dryer, máy sấy dạng trống kép- double drum dryer ) Máy sấy phun ( spray dryer ) Sấy khô men ép ( thành phần khô chiếm khoảng 25% ) Máy sấy thông gió dạng băng truyền lƣới ( net conveyer ) Máy sấy thông gió dạng tầng. 4.1.3 Ứng dụng của men khô. Tại Nhật, khoảng 1000 tấn men khô đƣợc sử dụng để làm thuốc dạng viên hoặc dạng bột, và ngƣời ta tính ra rằng giá cuối cùng của 1000 tấn men khô đó là vào khoảng từ 3 tỷ đến 4 tỷ yên. Ngoài ra, men khô còn đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu nuôi trồng, nguyên liệu chế biến thực phẩm bổ dƣỡng, hay là nguyên liệu chế biến thức ăn động vật trên cạn và dƣới nƣớc. Ngoài các tác dụng về thuốc hay dinh dƣỡng nói trên, màng tế bào men bia đƣợc cấu tạo từ glucagon và mannan, có tác dụng nhƣ sợi thực vật, tác dụng rất hữu hiệu, và ngƣời ta đã từng công bố trong một thí nghiệm lên động vật rằng, nhờ vào khả năng tăng cƣờng tính miễn dịch, nó còn tác dụng ngăn chặn bệnh ung thƣ. Do xuất hiện thông tin, khi hoà lẫn sữa chua với men bia, không những không hề làm giảm lƣợng dinh dƣỡng, ngƣời phát triển béo tốt, mà còn có thể có tác dụng ăn kiêng, do vậy mà lƣợng tiêu thụ tăng hết sức nhanh. Trong năm tài chính 2001, thực phẩm dinh dƣỡng là có doanh thu tăng nhanh nhất. 17 Bảng 2.7 Thành phần phân tích của men sấy khô . Protein 44.7g/100g Total Fat 8.0g/100g Total Carbohydrates 28.7g/100g Calories 414cal/100g Available Lysine 2.7g/100g Glucose 0.2g/100g Sucrose 0.2g/100g Crude Fiber 2.4g/100g Moisture 5.0g/100g Ash 5.4g/100g Pepsin Digestibility 91.8g/100g (William Bio – Products ) 4.2 Sản xuất men chiết xuất. Men chiết xuất ngoài việc đƣợc ứng dụng làm chất dinh dƣỡng, làm thuốc, chất kích thích lên men các thành tố nhƣ acid amine, giấm ăn…, thuốc chữa các loại bệnh động vật, nó còn đƣợc dùng làm gia vị tự nhiên để tăng thêm vị ngon của các món ăn. Bản chất của quá trình sản xuất ra men chiết xuất chính là quá trình thuỷ phân nấm men bánh mì hay phế liệu nấm men bia thành một hỗn hợp các chất nhƣ amino acid, nucleotide, chuỗi peptide, protein, đƣờng, vitamine và các hợp chất có vị thơm ngon. Giai đoạn quan trọng nhất trong quá trình sản xuất men chiết xuất là quá trình phá vỡ vách tế bào nấm men. Có nhiều phƣơng pháp để thực hiện nhƣ phƣơng pháp hoá học, phƣơng pháp sử dụng enzyme hay cho nấm men tự phân trong môi trƣờng nƣớc. Tuy nhiên ngƣời ta nhận thấy khi kết hợp nhiều phƣơng pháp lại với nhau thì thấy cho kết quả tốt hơn. 4.2.1 Phƣơng pháp tự phân. Nếu ta cho những tế bào con sống và những tế bào đã chết nhƣng còn tƣơi nguyên của động thực vật sống vào môi trƣờng có phạm vi mặc định, một 18 phần các thành phần bên trong tế bào sẽ tự tác dụng với acid và bị phân huỷ thành các phần tử nhỏ li ti. Sau khi bị phân huỷ thành các phần tử nhỏ li ti, các chất nhƣ chuỗi acid amine, acid amine, đƣờng, nucleotide.. sẽ thẩm thấu qua thành tế bào và thâm nhập vào thế giới bên ngoài. Hiện tƣợng này đƣợc gọi là tự phân. Men chiết xuất đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp tự phân, ngoài việc gồm các phần tử nhỏ li ti ta đề cập ở trên còn chứa rất nhiều chất dinh dƣỡng rất tốt cho cơ thể nhƣ vitamine, các loại muối khoáng. Quá trình tự phân chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có ba yếu tố hết sức quan trọng đó là : pH, nhiệt độ và thời gian. pH : Nấm men có khả năng tự phân trong khoảng pH từ 4-6, nhƣng thông thƣờng nấm men sẽ đƣợc cho tự phân ở pH 5.5. Tuy nhiên, ở pH này dung dịch tự phân thƣờng nhiễm khuẩn rất nhiều, mà vi khuẩn có thể phá huỷ mùi hƣơng của men chiết xuất. Nên ethyl acetate và chitosan thƣờng đƣợc dùng để ngăn cản vi khuẩn phát triển. ( Champagne và ctv, 1998 ) Nhiệt độ : Nấm men bia tự phân tối ƣu ở nhiệt độ 450C ( Suzzi , 1990 ; Wangchaoren và ctv, 1994 ), ở nhiệt độ quá cao thì quá trình tự phân không tốt, điều này có thể do enzyme bị biến tính ở nhiệt độ cao. Bảng 2.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hiệu quả thủy phân của nấm men Nhiệt độ Hiệu quả tự phân (% ) Nấm men bánh mì Nấm men bia 45 47.5 49.6 48 48.6 49.2 51 50.3 47.3 54 41.1 39.4 ( Champagne C.P , 2003 ) 19 Thời gian : quá trình tự phân sẽ kết thúc khi alpha amino nitrogen đạt đƣợc hơn 50%, do đó thời gian tự phân thích hợp là từ 15 – 24 giờ ( Stake Kenji, 2002 ) Để kết thúc quá trình tự phân thì nhiệt độ sẽ đƣợc tăng lên làm enzyme mất hoạt tính, thanh trùng, đồng thời loại bỏ khí sinh ra trong quá trình tự phân. Hiện nay, ngƣời ta sử dụng enzyme bổ sung thêm vào để làm quá trình thủy phân tốt hơn, nhanh hơn, đồng thời tăng hƣơng vị cho men chiết xuất sau này. 4.2.2 Phƣơng pháp hoá giải. Trong phƣơng pháp này thì acid HCl đậm đặc thƣờng đƣợc sử dụng để phân huỷ các protein của nấm men thành các amino acid. Sau đó hỗn hợp này đƣợc trung hoà bằng NaOH. Men chiết xuất đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp này thƣờng ở dạng paste hay dạng bột, có nồng độ muối cao và đƣợc sử dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm để tăng hƣơng vịt thịt. Có nhiều yếu tố chính ảnh hƣởng đến quá trình tự phân, sau đây là các yếu tố chính: Tác nhân thuỷ phân . Theo các tài liệu nghiên cứu cho thấy acid HCl có nhiều ƣu điểm hơn so với các acid hay bazơ khác vì khi thuỷ phân bằng HCl sẽ cho sản phẩm có màu sắc tƣơi đẹp, đạm thối ít và ít tổn hại acid amine. Lƣợng acid . Nếu lƣợng acid ít, tác nhân xúc tác trong quá trình thủy phân yếu, thời gian thủy phân dài, thủy phân không triệt để, tốn nƣớc và nhiệt. Nếu lƣợng acid nhiều sẽ gây lãng phí hóa chất, lƣợng muối sinh ra trong quá trình thủy phân nhiều, đồng thời dƣới tác động của nhiệt độ và lƣợng acid cao thì các amino acid sẽ bị phân hủy mạnh. Thời gian thuỷ phân. Khi thời gian thuỷ phân ngắn sẽ làm cho các mạch protid chƣa phân giải hết dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp. Khi thời gian thuỷ phân quá dài thì đạm amine sẽ bị phân hủy, hình thành nhiều hợp chất màu nâu sẫm, ảnh hƣởng đến màu sắc, mùi vị của sản phẩm. 20 Nhiệt độ thủy phân. Nhiệt độ quá thấp thì thời gian thủy phân sẽ kéo dài. Nhiệt độ quá cao sẽ làm các protid trong nguyên liệu phân giải mạnh dẫn đến các amino acid bị giảm và tạo thành nhiều sản phẩm phụ. 4.3 Một số sản phẩm tiêu biểu của men chiết xuất. 4.3.1 Yeast extract Yeast extract đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp tự phân hay hoá giải của tế bào nấm men bia tế bào nấm men bánh mì. Tuy nhiên, ngƣời ta thƣờng sản xuất nó từ nấm men bia hơn, vì men bia đƣợc coi là nguyên liệu rẻ hơn và có thể sản xuất với số lƣợng lớn. Yeast extract đƣợc sản xuất từ nấm men bánh mì thƣờng có hàm lƣợng carbohydrate cao hơn yeast extract từ nấm men bia, nhƣng hàm lƣợng protein lại thấp hơn. Yeast extract bao gồm các hợp chất hoà tan của tế bào nấm men nhƣ : amino acid, nucleotide, peptide, carbohydrate, vitamine và đặc biệt là nguồn giàu vitamine B. Bảng 2.9 Thành phần chính của Yeast extract Thành phần Hàm lƣợng (%) Nitơ tổng số 8 - 12 ( tƣơng đƣơng 50-70%protein ) Nitơ amine 3.0 - 5.2 Carbohydrate 4 -13 Lipid Không có hoặc rất ít (Satake Kenji, 2002 ) . 21 Bảng 2.10 Thành phần các vitamine trong Yeast extract Thành phần Hàm lƣợng ( µg/g ) Thiamine ( B1 ) 150 Riboflavin ( B2 ) 60 Pyridoxine ( B5 ) 25 Cyanocobalamin ( B12 ) 0.13 Pantothenic acid 40 Inositol 2.8 Niacin 300 Biotin 0.13 Folic acid 0.33 ( Satake Kenji, 2002 ) 22 Bảng 2.11 Thành phần các amino acid trong Yeast extract . Thành phần Hàm lƣợng ( % ) Lysine 3.8 Histidine 1.2 Arginine 1.2 Tryptophan 0.5 Aspartic acid 3.6 Threonin 2.6 Serine 4.7 Glutamic acid 4.2 Tyrosine 0.5 Proline 0.5 Glycine 2.2 Alanine 4.9 Cystine 0.5 Valine 3.2 Methionine 0.6 Isoleucine 1.5 Leucine 1.6 Phenylalanine 2.1 ( Satake Kenji, 2002 ) Phƣơng pháp sản xuất. Tự phân là quá trình xảy ra khi tế bào nấm men đã chết, vách tế bào không còn khả năng tự bảo vệ và sẽ bị phá huỷ bởi chính các enzyme ở trong tế bào. Lúc này các chất ở trong tế bào chất nhƣ protein, nucleotide, carbohydrate… cũng sẽ bị chính hệ thống enzyme này tấn công và phân huỷ. ( Biocatalyst technical bulletin – 108 ). Quy trình sản xuất đƣợc trình bày ở hình 1.3 23 Hình 1.3 Sơ đồ sản xuất yeast extract ở Anh ( Gogrey và West, 1996 ) Nấm men 28% trọng lƣợng khô đƣợc pha loãng với nồng độ 600g/l Điều chỉnh về pH 5 Tăng nhiệt độ lên 550C trong 5 – 8h Giữ ở 550C trong 24h Tăng nhiệt độ lên 700C và giữ trong 15h Ly tâm ( tách các mảnh vỏ) 70-75 0 C trong 2-5h ( quá trình thanh trùng ) Sấy thăng hoa trong điều kiện chân không đến khi đạt nồng độ hơn 30% chất rắn Lọc Sấy thăng hoa lần hai trong điều kiện chân không đến khi đạt nồng độ 70-75% chất rắn Sản phẩm cuối Protease Peptidas e Muối ( 3.5 kg/ 1000l ) 24 Thuyết minh qui trình Bao gồm 5 bƣớc Giai đoạn 1 : Co nguyên sinh Nó là giai đoạn mở đầu cho quá trình phá vỡ tế bào nấm men. Quá trình này xảy ra khi ta cho thêm tác nhân co nguyên sinh nhƣ là muối hoặc dung môi hữu cơ, nhƣng thƣờng sử dụng muối hơn vì nó là chất gây vị, do đó nó sẽ góp phần tạo hƣơng vị cho sản phẩm. Ngoài ra những tác nhân này còn góp phần diệt vi khuẩn có hại trong dịch, mà vi khuẩn này có thể gây cản trở quá trình lọc, tăng độ nhớt và tạo mùi khó chịu cho sản phẩm cuối cùng. Điều kiện thích hợp cho quá trình này là pH=5.5, ở nhiệt độ 550C trong khoảng thời gian 40 – 48 giờ. Giai đoạn 2 : Tự phân Đây là giai đoạn tự phá vỡ vách tế bào chính nhờ các enzyme nội bào có trong tế bào nấm men. Trong giai đoạn này có thể bổ sung thêm enzyme protease để tăng hiệu suất thủy phân. Giai đoạn 3 : Thanh trùng Nhằm giết chết các vi khuẩn còn sống và làm bất hoạt các enzyme. Trong giai đoạn này còn xảy ra sự tƣơng tác giữa các phân tử nhỏ nhƣ amino acid và đƣờng, tạo nên hƣơng vị cho sản phẩm. Giai đoạn 4 : Lọc Giai đoạn này sẽ loại bỏ những mảnh vỏ tế bào, glucan, mannan, và một số protein khác chƣa bị phân huỷ bởi các enzyme của nấm men trong quá trình tự phân. Nhà sản xuất có thể lọc thêm một lần nữa để thu đƣợc dịch yeast extract thật sạch. Lần lọc này sẽ loại bỏ những oligopeptide ít tan và sẽ bị kết tủa khi ở nồng độ cao. Giai đoạn 5 : Cô đặc Quá trình cô đặc có thể thực hiện bằng kỹ thuật cô đặc chân không, để tránh sự thất thoát hƣơng vị và chất dinh dƣỡng của yeast extract. Nhiệt độ yêu cầu của quá trình cô đặc không đƣợc vƣợt quá 500C. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng kỹ thuật sấy phun để tạo sản phẩm yeast dạng bột. 25 4.3.2 Yeast autolysate Yeast autolysate là sản phẩm chứa những thành phần hoà tan và cả không hòa tan của tế bào nấm men. Bản chất của quá trình tạo yeast autolysate là nhờ vào sự hoạt động của những enzyme thủy phân và tự phân của nấm men. Yeast autolysate thƣờng bổ sung vào snack, bánh biscuit, … để làm tăng hƣơng vị. Ngoài ra, yeast autolysate còn dùng làm thức ăn cho thú cƣng và làm thành phần môi trƣờng vi sinh. Qui trình sản xuất Qui trình sản xuất yeast autolysate cũng giống nhƣ yeast extract, chỉ khác nhau ở thời gian tự phân và không loại bỏ những thành phần không hòa tan. Theo Eurasyp, thành phần chính của yeast autolysate bao gồm: ( tính theo vật chất khô )  Đạm tổng số : 8 – 11% , trong đó protein chiếm 50 – 69%  Carbohydrate tổng số : 15 – 25%  Lipid : 3 – 10%  Muối : có thể có hoặc không có 4.3.3 Vách tế bào nấm men Vách tế bào chiếm khoảng 26-32% trọng lƣợng khô của Saccharomyces và những loại tế bào nấm men khác. Vách tế bào nấm men chứa từ 30- 60 % polysaccharides ( beta-glucan và mannan sugar polymer), 15 – 30% protein, 5 – 20% lipid, và một lƣợng rất nhỏ chitin. Hầu hết protein trong vách tế bào liên kết với Mannan – Oligo – Saccharide (MOS ) và tạo thành phức hợp Mannoprotein. Vách tế bào nấm men đƣợc sử dụng trong công nghiệp bia vì nó có khả năng gắn kết với những thành phần không mong muốn trong quá trình lên men giúp ngăn chặn và khắc phục các yếu tố cản trở quá trình lên men. . 26 1. Hình 1.4 Cấu tạo vách tế bào nấm men 2.4 Nấm mốc Aspergilus oryzae. Nghề làm tƣơng và làm rƣợu Sake đã với loài nấm sợi Aspergillus oryzae đã có từ rất lâu đời. Trƣớc đây bào tử nấm này từ thiên nhiên rơi vào trong xôi hay gạo và mọc lên mốc làm tƣơng hay rựơu. Bây giờ tình hình ở Nhật Bản đã khác hẳn. Nấm sợi Aspergillus oryzae đã đƣợc chọn lọc để có các chủng có hoạt tính cao. Bộ gene di truyền của Aspergillus oryzae đã đƣợc phân tích và biết rất kỹ vào năm 2001. Nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau ( amylase, proease, lipase, hemicellulase, cellulase, oxidoreductase, phytase, pectinsterase… ) Một vấn đề rất quan trọng và liên quan mật thiết đến nghề làm tƣơng ở Việt Nam là không thể tiếp tục làm tƣơng theo phƣơng pháp để lên mốc tự nhiên. Khi đó bào tử nấm mốc lấy từ tự nhiên và nơi nào làm tƣơng ngon thì ngƣời ta không rửa nong để mẻ sau có mốc đó tiếp tục phát triển. Vấn đề không phải ở chỗ làm tƣơng ngon hay không ngon, làm nhanh hay chậm mà quan trọng hơn là có đảm bảo an toàn cho con ngƣời không. Vấn đề đƣợc đặt ra là hai loài không độc Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae về hình thái, màu sắc, cấu tạo hiển vi rất khó phân biệt với hai loài rất nguy hiểm khác là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Hai loài này có thể sinh ra loài độc tố gây ung thƣ có tên gọi là Aflatoxin. Hiện đã biết 16 loại Aflatoxin khác nhau và độc nhất là các loại Aflatoxin B1, G1, B2, G2. Đã đến lúc giải thích rộng rãi và kiểm soát chặt chẽ các cơ sở làm tƣơng. Không đƣợc tiếp tục tiếp tục lên men tự nhiên mà phải làm theo phƣơng pháp cổ truyền có cải tiến ở khâu cấy bào tử thuần khiết của 27 Aspergillus oryzae hoặc Aspergillus sojae. Bào tử các nấm này đƣợc đóng sẵn trong các bao nhỏ và đƣợc cung cấp với giá không đáng kể. Chỉ cần lấy giống một vài lần sau đó cấy truyền sang các mẻ khác. Kinh nghiệm cho thấy với các chủng thuần khiết đã đƣợc lựa chọn không những tuyệt đối an toàn mà còn làm cho tƣơng mẻ nào cũng chất lƣợng tốt nhƣ mẻ nào. Có thể liên hệ với viện công nghệ thực phẩm hoặc bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật ( TT Công nghệ sinh học, ĐH Quốc Gia Hà Nội ) để tiếp nhận giống và phƣơng pháp sử dụng. Hình 1.5 Nấm mốc Aspergillus oryzae. . 28 Chƣơng 3 . Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.1. Địa điểm và vật liệu nghiên cứu. 3.1.1. Địa điểm : Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh của khoa Công Nghệ Thực Phẩm . Thời gian tiến hành từ 3/2006-- - 8/2006. 3.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Bếp điện. Máy đo pH. Microway. ……. 3.1.3. Hóa chất sử dụng. HCl 0.1N NaOH 0.1N H2S04 đđ Formol HCl đđ …… 3.1.4. Nguyên vật liệu. Bã men bia khô đƣợc lấy ở công ty bia Foster ở Tiền Giang 3.2 Phƣơng pháp thí nghiệm. Chúng tôi đƣa ra hai thí nghiệm để sản xuất nƣớc chấm lên men. 3.2.1 Thí nghiệm 1: Sản xuất nƣớc chấm lên men từ dịch tự phân bã men bia dƣới tác dụng của tác nhân thủy phân của nấm mốc. a. Theo dõi quá trình tự phân Từ các tài liệu tham khảo, có rất nhiều phƣơng pháp sản xuất dịch thuỷ phân nấm men nhƣ phƣơng pháp hoá giải, phƣơng pháp tự phân… ở đây chúng tôi tiến hành sản xuất bằng phƣơng pháp tự phân có bổ sung enzyme ( nấm mốc Aspergillus oryzae ) 29 Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lập lại. Cách tiến hành : ta tiến hành cân 1kg men hoà lẫn vào 2lít nƣớc, cân 0.35% muối vào, điều chỉnh pH về 5, đem ủ trong tủ ấm nhiệt độ 500C trong 24h rồi tiến hành bổ sung thêm 15% muối và các tỷ lệ nấm mốc Aspergillus oryzae khác nhau : 3%, 4%, 5%. Cho tiến hành tự phân ở nhiệt độ 500C. Yếu tố cố định: Thành phần nguyên liệu tự phân Yếu tố thay đổi: Tỷ lệ nấm mốc Nhƣ vậy sẽ có tất cả 3 nghiệm thức  Nghiệm thức 1: Tỷ lệ mốc 3%  Nghiệm thức 2: Tỷ lệ mốc 4%  Nghiệm thức 3: Tỷ lệ mốc 5% Kết quả mỗi nghiệm thức đƣợc kiểm tra các chỉ tiêu :đạm formol biến thiên theo thời gian Ngày đầu Ngày thứ 2 Ngày thứ 4 Ngày thứ 6… Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Số liệu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0 b. Theo dõi ảnh hƣởng của nhiệt độ lên quá trình thủy phân. Theo dõi ở hai nhiệt độ : 300C và 500C Ta tiến hành bố trí thí nghiệm tƣơng tự nhƣ trên, chỉ khác là cho tự phân ở nhiệt độ 300C. Ta sẽ tiến hành theo dõi sự biến thiên của đạm formol theo thời gian ở hai nhiệt độ này. Ta tiến hành theo dõi trong 20 ngày. Nghiệm thức Nhiệt độ 300C Nhiệt độ 500C Ngày đầu Ngày thứ 2 Ngày thứ 4….. Ngày đầu Ngày thứ 2 Ngày thứ 4…. 1 2 3 30 Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố ba lần lập lại. Mục đích : Xác định đƣợc nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân. c. Ly trích dịch tự phân để thu nƣớc chấm lên men Sau khi theo dõi sự gia tăng của đạm formol ở hai nhiệt độ 300C và 50 0 C, đến khi không còn tăng nữa, ta chọn nhiệt độ cho chất lƣợng dịch thủy phân tốt hơn và tiến hành chiết rút dich tự phân bằng hệ thống chiết rút nhỏ giọt , thu dịch này và tiến hành thanh trùng, đo đạm tổng số. Mục đích : đánh giá màu sắc, độ trong , độ đạm của sản phẩm. 3.2.2 Thí nghiệm 2 : Sản xuất nƣớc chấm lên men từ bã men bia kết hợp với các cơ chất khác nhau qua giai đoạn ủ với nấm mốc a. Theo dõi sự phát triển của Aspergillus oryzae trên các cơ chất: bã đậu nành, nếp, gạo lức Bã men bia đƣợc phối trộn với các cơ chất trên theo các tỷ lệ khác nhau, tạo thành môi trƣờng nuôi cấy mốc Bảng 3.1 Thành phần nuôi cấy nấm mốc Nghiệm thức Thành phần nguyên liệu Bã men bia / bã đậu nành Bã men bia / nếp Bã men bia / gạo lức 1 1/1.5 1 1/2 3 1/2.5 4 1/1 5 1/1.2 6 1/1.5 7 1/1 8 1/1.5 9 1/2.34 Nhƣ vậy sẽ có tất cả 9 nghiệm thức 31 Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lập lại Cách tiến hành: Nếp và gạo lức đƣợc mua về và nấu chín, sau đó cùng với bã đậu nành đƣợc hấp 15 phút trong Autoclave, tiếp theo ta cân 100g các nguyên liệu trên vào hộp nhựa và cho hấp 2 phút trong Microway. Để nguội, thêm 10% mốc và tiến hành trộn với bã men bia theo các nghiệm thức trên. Sau khi đã trộn đều và làm tơi xốp hỗn hợp, ta cân 50g hỗn hợp tƣơng ứng với 9 nghiệm thức và cho vào hộp nhựa để mốc phát triển trong 48h. Yếu tố cố định: Tỷ lệ mốc Yếu tố thay đổi: Thành phần nguyên liệu Mục đích: Theo dõi sự phát triển của nấm mốc và đánh giá mùi hƣơng của chúng trên 9 nghiệm thức trên. b. Theo dõi quá trình thủy phân của 9 nghiệm thức trên Từ kết quả 9 nghiệm thức trên, sau khi mốc đã phát triển có màu trắng thì ngay lập tức đƣợc bổ sung thêm nƣớc muối 20% và đƣợc để ở nhiệt độ phòng để diễn ra quá trình thủy phân. Mục đích : theo dõi sự biến thiên của đạm formol theo thời gian Ngày đầu Ngày thứ 2 Ngày thứ 4 Ngày thứ 6 ….. Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 …… Nghiệm thức 9 Số liệu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0 c. Chiết rút dịch thủy phân để làm nƣớc chấm lên men Sau khi theo dõi sự biến thiên của đạm formol ở 9 nghiệm thức trên, đến khi đạm không tăng nữa, ta tiến hành chiết rút dịch tự phân bằng hệ thống nhỏ giọt. 32 Thu dịch nhỏ giọt và tiến hành thanh trùng sản phẩm Ta tiến hành đo đạm tổng số cho sản phẩm cuối cùng. Mục đích : đánh giá màu sắc, độ trong, hàm lƣợng đạm của sản phẩm 33 Chƣơng 4 . K ẾT QU Ả V À TH ẢO LUẬN Qua thời gian tiến hành thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc dung dịch acid amine ở mỗi nghiệm thức. Sau khi đem các mẫu ấy kiểm tra các chỉ tiêu đạm formol, đạm amôn ( đạm NH3 ), chúng tôi thu đƣợc các kết quả sau ( vì kết quả kiểm tra đạm NH3 rất thấp, hầu nhƣ không có nên đạm Formol bằng đạm amine ) 4.1 Thí nghiệm 1: Sản xuất nƣớc chấm lên men từ dịch tự phân bã men bia dƣới tác dụng của tác nhân thủy phân của nấm mốc 4.1.1 Theo dõi quá trình tự phân Các hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức ở nhiệt độ 500C Bảng 4.1 Hàm lƣợng đạm formol của các tỷ lệ mốc ở nhiệt độ 500C Thời gian ( ngày ) Đạm Formol ( g / l ) Tỷ lệ mốc 3% Tỷ lệ mốc 4% Tỷ lệ mốc 5% 1 2.38 2.52 2.1 2 2.38 2.52 2.1 4 2.94 2.52 2.66 6 2.94 2.8 2.66 8 3.08 2.8 2.94 10 3.08 2.94 3.22 12 3.22 3.22 3.5 14 3.36 3.22 3.22 16 3.22 3.42 3.08 18 3.08 2.66 3.08 20 2.94 2.66 3.08 34 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Ngày Đạ m Fo rm ol (g /l ) Tỷ lệ 3% mốc Tỷ lệ 4% mốc Tỷ lệ 5% mốc Biểu đồ 4.1 Sự biến thiên đạm formol ở các nghiệm thức ở nhiệt độ 500C Dựa vào biểu đồ chúng tôi nhận thấy hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức có sự thay đổi theo thời gian, và có sự khác nhau giữa các nghiệm thức. Theo xử lý thống kê LSD với độ tin cậy 95% cho thấy sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Kết luận: Qua so sánh trên chúng ta có thể nhận thấy ảnh hƣởng của tỷ lệ nấm mốc Aspergillus oryzae lên hiệu quả của quá trình thuỷ phân, và ở tỷ lệ 5% cho chất lƣợng dịch thuỷ phân tốt nhất. 4.1.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên quá trình tự phân Các hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức ở nhiệt độ 300C 35 Bảng 4.2 Hàm lƣợng đạm formol của các tỷ lệ mốc ở nhiệt độ 300C Thời gian ( ngày ) Đạm Formol ( g / l ) Tỷ lệ mốc 3% Tỷ lệ mốc 4% Tỷ lệ mốc 5% 1 1.4 1.68 2.3 2 1.4 1.68 2.3 4 1.5 1.7 2.38 6 1.58 1.74 2.38 8 1.62 1.74 2.4 10 1.74 1.94 2.5 12 1.94 2.38 2.7 14 2.1 1.94 2.88 16 1.94 1.78 2.7 18 1.74 1.7 2.5 20 1.62 1.7 2.4 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Ngày Đạ m Fo rm ol (g /l) Tỷ lệ 3% mốc Tỷ lệ 4% mốc Tỷ lệ 5% mốc Biểu đồ 4.2 Sự biến thiên đạm formol của các nghiệm thức ở nhiệt độ 300C Dựa vào biểu đồ chúng tôi nhận thấy hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức có sự thay đổi theo thời gian, và có sự khác nhau giữa các nghiệm thức. Theo xử lý thống kê LSD với độ tin cậy 95% cho thấy sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê. 36 Kết luận: Qua so sánh trên chúng ta có thể nhận thấy ảnh hƣởng của tỷ lệ nấm mốc Aspergillus oryzae lên hiệu quả của quá trình thuỷ phân, và ở tỷ lệ 5% cho chất lƣợng dịch thuỷ phân tốt nhất. 4.13 So sánh sự biến thiên đạm formol của các nghiệm thức ở hai nhiệt độ 30 và 500C  Các hàm lƣợng đạm formol ở tỷ lệ mốc 3% 0 1 2 3 4 1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Ngày Đạ m F or m ol (g /l ) 30 độ C 50 độ C Biểu đồ 4.3 Sự