Khóa luận Bước đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó

ntamycin. Các loại kháng sinh đều có vai trò quan trọng nhất là giảm nguy cơ nhiễm khuẩn từ các tác nhân bên trong và bên ngoài trong quá trình nuôi cấy.  Thành phần bổ sung - Hormon Hầu hết các môi trƣờng IVM đều đƣợc bổ sung hormon, đặc biệt là FSH và LH. FSH giúp noãn giãn nở hạt tụ và vƣợt qua chƣớng ngại trong giảm phân nhƣng không giúp phát triển hơn nữa. Ngoài ra còn bổ sung estradiol, progesteron vào môi trƣờng. Tỷ lệ MII khi thêm estradiol (14,7%) cao hơn so với đối chứng(1,5-8,2%), khi thêm progesterone cao hơn (10 %) so với đối chứng (4,8 %) (Kim et.al., 2005). - Yếu tố tăng trƣởng Trên chó, EGF đƣợc thu từ ống dẫn trứng. EGF đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy làm tăng tỷ lệ MII (16,7%) so với đối chứng (4%) (Bogliolo et.al., 2002). Khi bổ sung EGF với nồng độ 20 ng/ml thì tỷ lệ trứng chín tăng (13,3%) so với đối chứng (2,7%) (Kim et.al., 2004). - Chất chống oxy hóa Các chất trong môi trƣờng nuôi cấy có thể bị oxy hóa và tao một số chất độc gây ảnh hƣởng xấu tới noãn. Do đó chất chống oxy hóa thƣờng đƣợc cho vào môi trƣờng là β- mercaptoethanol. Tỷ lệ trứng đạt đến MII tăng 20% so với đối chứng khi bổ sung 50µM vào môi trƣờng nuôi cấy (Kim et.al., 2004). 2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả IVM 2.3.3.1 Thời gian Cho đến nay cũng chƣa có một công bố chính thức về thời gian tối ƣu nhất cho nuôi chín trứng in vitro trên chó, có nhà khoa học cho rằng thời gian tốt nhẩt là 13 48h (Bogliolo et.al., 2002), nhƣng cũng có kết quả cho là không có sự khác biệt giữa 48 giờ và 72 giờ (Kim et.al., 2006). 2.3.3.2 Chất lƣợng noãn và kích thƣớc nang noãn Theo Sorrensen và Wassaman (1976), nang noãn nguyên thủy chứa noãn không có khả năng hỗ trợ quá trình giảm phân và phát triển của phôi. Tỷ lệ noãn có khả năng giảm phân và hỗ trợ quá trình phát triển của phôi tăng dần theo đƣờng kính của noãn. Để đạt hiệu quả IVM cao thì kích thƣớc noãn thƣờng đƣợc lấy là 100 µm (Kim et.al., 2006). 2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái Hewitt và England (1998) so sánh noãn chó từ 2 nhóm tuổi : từ 1 - 6 tuổi và trên 7 tuổi. Kết quả chứng minh rằng noãn từ các chó từ 1 - 6 tuổi đạt tỉ lệ trƣởng thành nhiều hơn nhóm thứ hai. Yamada et.al., (1992) đã báo cáo rằng có đến 32% trứng lấy từ chó siêu bài noãn đạt đến MII sau 72 giờ nuôi cấy; trong khi đó, trứng lấy từ chó ở giai đoạn không động dục thì không có dấu hiệu tiếp diễn giảm phân kể cả khi nuôi tới 144 giờ. 2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng Nhiệt độ tốt nhất bảo quản mẫu buồng trứng là 37oC trong môi trƣờng nƣớc muối sinh lý có đệm phosphate (phosphate buffered saline - PBS), thời gian tối đa cho phép trữ mẫu từ lúc lấy buồng trứng ra ngoài cơ thể là 2 giờ (Kim et.al., 2006). Ngoài ra còn có một số yếu tố khác nhƣ: điều kiện vô trùng, thao tác ngƣời thực hiện, tủ nuôi cấy… 2.4 Phó tinh hoàn  Vị trí: nằm ở một bên thân và đầu dƣới của tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005)  Cấu tạo Về giải phẫu học, phó tinh hoàn gồm 3 phần (Hoàng Văn Tiến và ctv, 1995). Đầu: có rất nhiều ống dẫn ra (13 đến 20) đính vào ống dẫn của phó tinh hoàn, tạo nên một cấu trúc dẹt, gắn vào một đầu của tinh hoàn. 14 Thân: phần này hẹp, nối tiếp sau đầu phó tinh hoàn và tận cùng ở đầu kia của tinh hoàn. Đuôi: phần này nối tiếp sau phần thân và rộng hơn thân phó tinh hoàn. Đƣờng viền quanh của đuôi phó tinh hoàn là đặc điểm có thể thấy đƣợc ở gia súc còn sống. Bên ngoài là lớp màng sợi, trong là các ống sinh tinh. Ở đầu trên khoảng 15- 20 ống từ tinh hoàn đi lên, chúng uốn lƣợn, gấp đi gấp lại tập trung thành 6-10 ống ở phần thân, đi xuống đuôi chỉ còn 2-3 ống, cuối cùng còn 1 ống dẫn ra khỏi đuôi phó tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005) Phó tinh hoàn có 2 loại tế bào (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005) - Tế bào hình trụ có tiêm mao: có chức năng hấp thu - Tế bào đáy: có chức năng bài tiết  Chức năng Làm tinh trùng thành thục và dự trữ tinh trùng: Những giọt bào tƣơng còn sót lại trên cổ tinh trùng tụt dần xuống các phần tận cùng của đoạn giữa tinh trùng, hoạt lực tinh trùng tăng lên khi tinh trùng đi vào thân phó tinh hoàn. Tại đuôi phó tinh hoàn, tinh trùng đƣợc cung cấp những yếu tố làm tăng khả năng thụ tinh, tinh trùng ở đuôi phó tinh hoàn có khả năng thụ tinh cao hơn tinh trùng ở phần thân, ngoài ra cũng có khả năng thụ tinh mà không cần bổ sung chất bài tiết của các tuyến phụ. Những bất bình thƣờng về hình thái tinh trùng trong tinh dịch có thể làm tăng lên trong quá trình tinh trùng đi qua và thành thục trong phó tinh hoàn (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005). Trong phó tinh hoàn, tinh trùng đƣợc bao bởi một màng glycoprotein giúp tinh trùng vận động tiến thẳng, thể đỉnh thành thục (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005). Tinh trùng nằm trong phó tinh hoàn có thể giữ đƣợc năng lực thụ tinh trong vài tuần lễ và ống phồng trong đuôi phó tinh hoàn là cơ quan bảo tồn chính. Khả năng đặc biệt của đuôi phó tinh hoàn để bảo tồn tinh trùng phụ thuộc vào nhiệt độ thấp của bao tinh hoàn và hoạt tính của hormon tính dục đực (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005). Phó tinh hoàn làm tăng nồng độ K+, mà K+ có tác dụng ức chế sự vân động của tinh trùng, làm tăng tuổi thọ tinh trùng. Tinh trùng đƣợc chuyển xuống và dự trữ ở 15 đuôi phó tinh hoàn, môi trƣờng ở đây rất phù hợp để tinh trùng kéo dài tuổi thọ: Na+ thấp, K+ cao, phân áp oxy thấp, CO2 cao, pH tƣơng đối thấp, tinh trùng bị ức chế hầu nhƣ không vận động (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005) Tinh trùng di chuyển trong phó tinh hoàn sẽ biến đổi cấu trúc để có thể sống lâu: giảm lƣợng nƣớc, giảm thể tích, sinh ra protein mới bao quanh tinh trùng làm tinh trùng mang điện tích âm nên không bị ngƣng kết với nhau, hoàn chỉnh khả năng thụ tinh, tinh trùng sống trong phó tinh hoàn 7-10 ngày, tối đa 2 tháng (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005) Bảng 2.1. Lƣợng tinh trùng dữ trữ trong các phần của phó tinh hoàn (Nguồn: Davol, 2000) Hấp thu và bài tiết dịch: Hầu hết lƣợng lớn chất dịch ra khỏi tinh hoàn hằng ngày bị hấp thu ở phần đầu của phó tinh hoàn, phần đuôi cũng có khả năng hấp phụ những phần tử nhỏ kể cả tinh trùng. Dòng chảy của chất dịch màng lƣới tinh hoàn đi ra những ống dẫn ra và ống của phó tinh hoàn là cần thiết cho việc duy trì hình thái bình thƣờng của những ống này. Sự vận chuyển tinh trùng thông qua phó tinh hoàn là do dòng chảy của chất dịch màng lƣới, hoạt động của biểu mô có nhung mao của các ống dẫn ra và sự co rút của thành cơ của ống phó tinh hoàn (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005). Phó tinh hoàn hấp thu rất mạnh, làm giảm nồng độ Na+, Cl-, tăng nồng độ K+ trong dịch của phó tinh hoàn (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005). 2.5 Tinh trùng 2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng Tinh trùng đƣợc sinh ra từ biểu mô ống sinh tinh và thải vào lòng ống. Tinh trùng di ra khỏi tinh hoàn và đƣợc dữ trữ ở phó tinh hoàn. Trƣớc khi xuất tinh, tinh Trọng lƣợng (kg) 4,5 - 15,4 15,9 - 17,7 27,2 - 38,1 Đầu phó tinh hoàn (10 9 tế bào/ml) 0,07 ± 0,01 0,23 ± 0,04 0,23 ± 0,05 Thân phó tinh hoàn (10 9 tế bào/ml) 1,1 ± 0,18 1,85 ± 0,16 2,27 ± 0,24 Đuôi phó tinh hoàn (10 9 tế bào/ml) 2,06 ± 0,31 3,3 ± 0,36 4,68 ± 0,39 16 trùng đƣợc đẩy ra khỏi phần đuôi phó tinh hoàn và đƣợc kết hợp với tinh thanh từ tuyến tiền liệt tại niệu đạo (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005) Tinh trùng có hình dạng giống nòng nọc. Tinh trùng chó có hình dạng đặc thù khác biệt so với các loài khác. Nó có dạng sợi dài, đƣờng kính của đầu hơi nhỏ, còn đuôi thì khá dài, chiều dài toàn bộ khoảng 50 - 60 µm (Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). 2.5.2 Quá trình sinh tinh Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), sự sản sinh tinh trùng xảy ra khi bắt đầu thành thục tính dục. Đó là quá trình biệt hóa tế bào, bắt đầu từ tế bào mầm đến khi sản sinh ra các tinh trùng. Quá trình này đƣợc chia làm 4 giai đoạn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005): Giai đoạn sinh sản: tinh nguyên bào ở biểu mô ống sinh tinh (2n) liên tục phân chia, dẫn đến tinh nguyên bào tăng về số lƣợng. Giai đoạn sinh trưởng: tinh nguyên bào ngừng phân chia, lớn lên thành tinh bào bậc I nhƣng số NST giữ nguyên 2n. Giai đoạn thành thục: tinh bào bậc I phân chia giảm nhiễm thành hai tinh bào bậc II có số NST n và một NST giới tính X hoặc Y. Tinh bào bậc II lại phân chia thành hai tinh tử có NST n. Giai đoạn tạo hình: tinh tử hoàn chỉnh cấu trúc thành tinh trùng. Các tiền tinh trùng dài ra phát triển thành đuôi nối với nhau và kết nối với lớp dƣới của tế bào Sertoli qua các cầu nối bào tƣơng. Các tế bào Sertoli giữ vai trò dinh dƣỡng, nuôi các tiền tinh trùng (tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tƣờng Anh, 2002). Chỉ sau khi sự biệt hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới đƣợc giải phóng vào ống tinh. Cuối cùng tinh trùng vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục trƣởng thành trong một khoảng thời gian nhất định. 2.5.3 Cấu tạo Tinh trùng có cấu tạo gồm 3 phần: đầu, cổ và đuôi ( Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) Phần đầu: chứa vật chất di truyền, dài khoảng 5,6 µm. Đầu tinh trùng gồm 2 phần: nhân và thể đỉnh (acrosome). Trong nhân chứa chromatin đậm đặc, đó là DNA liên kết với 1 protein, đặc biệt là phân tử DNP (deoxyribonucleoprotein) xếp 17 song song và gắn rất chặt chẽ với nhau làm cho cấu trúc của nhân gần nhƣ cấu trúc của tinh thể. Phần trƣớc đầu tinh trùng đƣợc bao bọc bằng một acrosome, có hình dạng nhƣ 1 cái túi mỏng gồm 2 lớp màng bọc sát vào nhân. Trong acrosome có chứa các enzyme thủy phân nhƣ: hyaluronidase, phosphatase acid, esterase và các hydrolase acid. Chúng có liên quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh: hyaluronidase có tác dụng phân hủy acid hyaluronic – là chất liên kết giữa các tế bào hạt bao quanh trứng. Phần cổ: chỉ dài khoảng 1µm, hơi co lại và cắm vào hõm ở đáy phía sau của nhân. Phần đuôi: dài khoảng 49,26 µm - 50,26 µm, đƣợc bao bọc bằng 1 màng chung và đƣợc chia thành 3 phần: đoạn giữa, đoạn chính và chót đuôi. 2.5.4 Thành phần Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tinh trùng chứa 75% nƣớc, 25% vật chất khô trong đó 85% protein, 13,2% lipid, 1,8% khoáng. Đầu tinh trùng chứa 65% nhân, chủ yếu là DNA; đuôi chủ yếu là lipid. Tinh trùng thành thục và đƣợc dự trữ ở phó tinh hoàn. Tại đây màng tinh trùng đƣợc bão hòa thêm một lớp glycoprotein giúp tinh trùng có khả năng vận động. 2.5.5 Đặc tính sinh lý Theo Trịnh Bỉnh Duy (2001), trong ống sinh tinh, tinh trùng có thể sống vài tuần nhƣng khi đƣợc phóng ra ngoài, đời sống tối đa chỉ từ 24 - 48 giờ. Khi trữ ở nhiệt độ thấp, chuyển hóa giảm nên thời gian sống của tinh trùng kéo dài hơn. Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động độc lập về phía trƣớc, tính lội ngƣợc dòng nƣớc, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và tính tiếp xúc với điện. Sự rung động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động tiến thẳng tới trƣớc. Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội tại và ngoại cảnh nhƣ: niêm dịch ở đƣờng sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phƣơng thức phóng tinh của con đực và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng. Tinh trùng chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngƣợc dòng nƣớc và cũng có xu hƣớng lội ngƣợc dòng 18 nƣớc. Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy. Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm của tế bào trứng để đi vào. Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng hƣng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hóa học này gọi là chất fertilizin. Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng có điện thế, mà đặc tính của dòng điện chạy từ cao đến thấp cho nên tinh trùng lội có phƣơng hƣớng nhất định. Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tinh trùng sử dụng năng lƣợng theo 3 phƣơng thức: Oxy hóa yếm khí: Fructose → acid lactic + CO2 + Q (27,7 Kcal) Với enzyme xúc tác là hexokinase, photphatase. Oxy hóa hiếu khí: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 674 Kcal Hệ số hô hấp của tinh trùng là số µl O2 tiêu hao cho 10 5 tinh trùng trong 1 giờ ở 37oC. Đây là chỉ tiêu đánh giá sức sống của tinh trùng. Phân giải ATP: do enzyme ATPase ở cổ và đuôi tinh trùng ATP → ADP + P + Q (7-12 Kcal) 2.5.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của tinh trùng Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tuổi thọ và năng lƣợng vận động của tinh trùng phụ thuộc vào: Nhiệt độ: khi ở nhiệt độ cao, tinh trùng vận động mạnh làm tiêu hao nhiều năng lƣơng nên tinh trùng nhanh chết. Nhiệt độ thấp sẽ ức chế hoạt động của tinh trùng, do đó sẽ kéo dài tuổi thọ tinh trùng. Cơ sở này đã đƣợc ứng dụng trong công nghệ làm tinh đông viên hoặc tinh cọng rạ -196oC. pH: pH trung tính hay kiềm làm tinh trùng vận động mạnh, tiêu tốn nhiều năng lƣợng, dẫn đến giảm tuổi thọ tinh trùng. pH acid yếu ức chế vận động của tinh trùng nên sẽ kéo dài tuổi thọ của tinh trùng. 19 Áp suất thẩm thấu: môi trƣờng nhƣợc trƣơng hay ƣu trƣơng đều giảm thời gian sống của tinh trùng. Ánh sáng: tia tử ngoại và hồng ngoại kích thích vận động cuả tinh trùng, làm tinh trùng tiêu năng lƣợng và giảm tuổi thọ. Chất hóa học: tinh trùng mẫn cảm với muối kim loại nặng. Màng tinh trùng mang điện tích âm đẩy rời ra nhau, khi gặp điện tích dƣơng thì điện tích âm bị trung hòa, do đó tinh trùng dính vào nhau và mất khả năng vận động tiến thẳng. 2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) 2.6.1 Lịch sử IVF Sau khi IVM thành công trên một số loài thì các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục nghiên cứu về kỹ thuật IVF. IVF đã thành công trên rất nhiều loài động vật nhƣ chó, heo, thỏ, bò…Kỹ thuật ra đời đã mang lại một ý nghĩa to lớn trong việc giải quyết vấn đề vô sinh ở ngƣời. Năm 1959, con thỏ đầu tiên ra đời từ phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm Năm 1972, con chuột đầu tiên ra đời từ phôi đông lạnh. Ngày 25 tháng 7 năm 1978, lần đầu tiên trong lịch sử nhân loại, bé gái Louise Brown ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh. Năm 1982, bé gái thứ hai Amadine ra đời bằng công nghệ này ở Pháp. Những năm 80 của thế kỷ XX, kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm phát triển mạnh. Singapore đƣợc ghi nhận là nơi thực hiện thành công thụ tinh trong ống nghiệm đàu tiên ở châu Á vào năm 1983 Năm 1984, một phôi đông lạnh đƣợc rã đông để cấy vào tử cung, đã cho ra đời bé trai đầu tiên là Zoe. Năm 1986, Cheng và ctv đã thành công IVF heo Năm 1990, Gordon và Lu đã tạo thành công phôi bò IVF Năm 1992, Yamada và ctv đã tạo phôi chó thành công Năm 1994, Madan và ctv đã tạo thành công phôi trâu IVF Năm 2006, Kim và ctv thành công IVF trên chó. 20 Ở Việt Nam: Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM đã thành công trên bò, chuột và heo. Thụ tinh nhân tạo thành công trên ngƣời ở bệnh viện Từ Dũ, Hùng Vƣơng. 2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh (Phạm Thị Minh Đức và ctv, 2001) Khi còn trong tinh dịch, một lƣợng lớn cholesterol bọc quanh đầu tinh trùng, tạo thành màng bao bọc quanh đầu bền vững và ngăn chặn sự giải phóng enzyme. Khi di chuyển trong đƣờng sinh dục cái lớp cholesterol bị mất, màng tinh trùng yếu và tăng tính hấp thụ đối với Ca2+, Ca2+ cao trong bào tƣơng của đầu tinh trùng làm tăng vận động của tinh trùng và giải phóng enzyme. Đầu tinh trùng dự trữ lƣợng lớn hyaluronidase và enzyme thủy phân protein. Hyaluronidase phá hủy liên kết các tế bào hạt quanh noãn, sau đó nhờ enzyme phân giải protein mà tinh trùng có thể chọc thủng màng trong suốt của noãn và tiếp cận với lớp vỏ bao quanh noãn. Tại đây có các thụ thể cố định màng trƣớc của tinh trùng vào lớp vỏ noãn, màng trƣớc tinh trùng bị tiêu đi, giải phóng enzyme và mở đƣờng xâm nhập vào lòng noãn, màng trong đầu tinh trùng tan ra và vật chất di truyền của đầu tinh trùng xâm nhập vào noãn. Hình 2.4. Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng (Nguồn: Naokazu et.al., 2005) 21 2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi Quá trình thụ tinh hoàn tất dẫn đến quá trình hình thành phôi ở dạng một tế bào. Sau đó, phôi bắt đầu phân chia thành dạng 2, 4, 8, và 16 tế bào (tế bào nguyên phôi-blastomer). Các blastomer này ngày càng đƣợc phân chia nhiều hơn, nhỏ hơn và kết hợp lại thành khối rắn chắc đƣợc gọi là phôi dâu (morula), lúc này rất khó nhìn thấy từng tế bào trong phôi, khối tế bào chiếm gần hết không gian của trứng. Sau đó, phôi tiếp tục phát triển hình thành dạng phôi nang (blastocyst) và có sự tích lũy chất dịch bên trong tạo khối cầu rỗng. Tiếp đó, blastocyst qua giai đoạn phôi nang trƣơng nở (expanded blastocyst) và thoát khỏi màng trong suốt ở giai đoạn thoát nang (hatching blastocyst) rồi bắt đầu làm tổ trong tử cung. 22 2.6.4 Vật liệu cho IVF (Phan Kim Ngọc, 2006) 2.6.4.1 Giao tử Trứng (noãn) dùng cho thụ tinh in vitro thƣờng có thể ở 3 dạng: trứng non, trƣởng thành và hậu trƣởng thành. Tùy mức độ phát triển của trứng mà tiến hành các thao tác tiền xử lý khác nhau, thông qua việc nuôi trong khoảng thời gian nhất định trƣớc khi thụ tinh. Các tinh trùng dùng cho thụ tinh in vitro đƣợc chuẩn bị theo một số phƣơng pháp: swim up, tạo vón cục kết hợp swim up, ly tâm, lắng… nhằm làm tăng nồng độ và khả năng hoạt động của tinh trùng. Nồng độ tinh trùng đƣợc quyết định do số lƣợng tinh trùng và dung tích của vi giọt môi trƣờng thụ tinh. Thƣờng thì nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh là 105 tinh trùng bình thƣờng/ml, nếu các tinh trùng thiếu các tiêu chuẩn về độ di động và hình thái thì nồng độ thụ tinh phải cao hơn. Nồng độ tinh trùng dƣới 5.104/ml thì kết quả IVF không tốt, tuy nhiên nếu nồng độ tinh trùng quá cao cũng không thuận lợi cho IVF vì sẽ tăng khả năng đa bội, thậm chí sẽ ảnh hƣởng khả năng sống sót của phôi bởi các enzyme trong đầu cực tinh trùng có hại cho trứng và phôi, mẫu tinh trùng chết có thể gây tổn thƣơng cho trứng vì các gốc oxy tự do. 2.6.4.2 Môi trƣờng IVF Thông thƣờng môi trƣờng nuôi trứng còn đƣợc sử dụng cho giai đoạn thụ tinh, thậm chí còn cho cả giai đoạn hình thành và phát triển phôi sau này. Tuy nhiên hiệu quả này không rõ ràng. Trong các môi trƣờng thụ tinh in vitro, có 3 nhóm chất cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng: muối, cơ chất năng lƣợng (pyruvate, glucose, lactate), và nguồn protein. Ion Ca2+, bicarbonat, tỷ lệ Na+/K+ gần giống trong dịch ống dẫn trứng. Ca2+ cần thiết cho phản ứng cực đầu và thúc đẩy cho các cơ chế sinh học khác tiến triển. Đƣờng glucose, lactate là nguồn năng lƣợng ngoại sinh của tinh trùng. Protein, đặc biệt là albumin thúc đẩy khả năng vận chuyển và tăng cƣờng hoạt hóa. pH của môi trƣờng IVF khoảng 7,4 gần giống với pH máu phù hợp cho thụ tinh 23 và phát triển ban đầu của phôi. Ở môi trƣờng acid phôi phát triển kém. Hệ đệm bicarbonat đƣợc dùng để ổn định pH vì khi ủ kín các tế bào hô hấp sẽ tạo CO2 làm tăng tính acid của môi trƣờng, sự kết hợp giữa hệ đệm này cùng với CO2 trong tủ ấm sẽ giúp ổn định pH cho tế bào. Khi thụ tinh hoặc nuôi phôi in vitro phải phủ lên bề mặt môi trƣờng một lớp dầu khoáng để làm giảm quá trình tạo hạt ngƣng tụ trong môi trƣờng và sự thay đổi nồng độ các chất. Ngoài ra, dầu khoáng còn có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của bụi và vi sinh vật từ ngoài. Tuy nhiên, nó ngăn cản sự khuyếch tán của CO2 vào môi trƣờng nuôi. 2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro (Phan Kim Ngọc, 2006) Có 3 yếu tố quan trọng trong một hệ thống thụ tinh in vitro: dụng cụ thụ tinh, môi trƣờng thụ tinh và các điều kiện khác (khí, nhiệt độ, độ ẩm môi trƣờng…) Thụ tinh trong ống nghiệm 5 ml: Thích hợp nhất là ống ly tâm nhựa 5 ml với nắp mở đƣợc vặn lỏng, giúp kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu. Thông thƣờng, tỷ lệ thụ tinh tối ƣu là 1 phức hợp trứng với tế bào cumulus (cumulus oocyte complex-COC)/ ống nghiệm trong 0,5 ml môi trƣờng và 5.104 tinh trùng di động. Thụ tinh trong đĩa một hay bốn giếng: Thêm một thể tích huyền phù đã đo trƣớc vào mỗi giếng với nồng độ trung bình là 105 tinh trùng di động/giếng. Sự gắn tinh trùng vào màng trong suốt xảy ra sau 1-3 giờ thụ tinh, do đó sau 3h trứng có thể đƣợc rửa lại để loại bỏ tinh trùng thừa. Thụ tinh trong ống mao quản và cọng rạ: Ƣu điểm là tiết kiệm trứng cũng nhƣ tinh trùng. Phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là nuôi cấy trong âm đạo. Tỷ lệ thụ tinh tốt nhất đạt đƣợc trong các ống mao quản và cọng rạ với thể tích 5-10 µl chứa 2000-4000 tinh trùng di động. Huyền phù trứng/tinh trùng trong cọng rạ đƣợc bảo vệ bằng các khoảng môi trƣờng, ngăn cách xen kẽ với các bóng không khí, đƣợc đặt nằm ngang trong tủ ấm 24 37 oC và 5% CO2. Sau thụ tinh, dùng pipet đẩy hết dung dịch trong ống vào đĩa để kiểm tra. Thụ tinh trong vi giọt: Đây là phƣơng pháp IVF phổ biến nhất. Đƣa các COC vào một vi giọt đã đƣợc chuẩn bị sẵn từ 20-50 µl huyền phù tinh trùng dƣới lớp dầu. Thuận lợi của phƣơng pháp này là kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu bởi thể tích nhỏ và số lƣợng tinh trùng ít, rất phù hợp cho những trƣờng hợp mẫu ít tinh trùng. Trên chó, thể tích vi giọt dùng cho thụ tinh in vitro tùy thuộc vào loại môi trƣờng, nhƣ thể tích 50 µl/giọt đối với môi trƣờng Fert-TALP (Kim et.al., 2006), thể tích 100 µl/giọt đối với môi trƣờng TYH (Yamada et.al., 1992). 2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh (Phan Kim Ngọc, 2006) Có thể ghi nhận và đánh giá kết quả sau 24 giờ thụ tinh bằng quan sát kính hiển vi và có thể tiến hành phẩu tích phôi, có thể dùng enzyme hay cơ học để tách bỏ lớp tế bào cumulus xung quanh để dễ quan sát và đánh giá. Đánh giá trứng thụ tinh cũng đƣợc dựa vào hai chỉ tiêu cơ bản, đó là sự thay đổi của nhân và tế bào chất. Đạt được các tiền nhân Những trứng thụ tinh tốt là những trứng đƣợc quan sát thấy 2 tiền nhân và 2 thể cực. Trạng thái của tế bào chất Biểu hiện hình dạng đặc thù với màng trong suốt đầy đặn và nguyên sinh chất sạch. Ngoài ra cũng có thể quan sát thêm: nguyên sinh chất của tế bào luôn có ít hạt, có thể biểu hiện từ màu nâu đến đen, hình dạng của trứng có thể biến đổi từ hình cầu đến những hình dạng không đặc trƣng, một vành sáng rõ nguyên sinh chất ngoại vi là một bằng chứng về sự hoạt hóa tốt và sự bắt đầu cho một chu kỳ tiếp theo của quá trình phân bào. Tuy nhiên, không phải tất cả các trứng đều đƣợc thụ tinh trong ngày đầu tiên, các trứng không xuất hiện tiền nhân có thể đƣợc tái thụ tinh. Sự thụ tinh hay phân cắt thƣờng đƣợc xác nhận vào ngày thứ hai, đó có thể là kết quả thụ tinh của lần 25 đầu, hoặc có thể là sự chậm trễ thụ tinh do các khiếm khuyết chức năng tinh trùng hay sự trƣởng thành trễ của trứng. 2.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến IVF Sự trƣởng thành của trứng: trứng chỉ đƣợc thụ tinh khi đạt đến MII, do đó sự trƣởng thành của trứng trong IVM là một cơ sở rất quan trọng cho tỷ lệ thành công trong IVF. Đa số các loài động vật, khi rụng trứng đã đạt đến MII nhƣng ở chó trứng rụng khi còn ở giai đoạn GV, do vậy đây là một trở ngại rất lớn làm cho tỷ lệ trứng chín trong IVM và tỷ lệ tạo phôi trong IVF ở chó rất thấp. Năng lực của tinh trùng: hoạt lực của tinh trùng là một yếu tố cực kỳ quan trọng quyết định khả năng xâm nhập của tinh trùng vào màng trong suốt và kết hợp với nhân cái để tạo thành tiền nhân. Nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh: nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh là một yếu tố rất cần thiết trong IVF. Tinh trùng sẽ tiết enzyme hyaluronidase để phá hủy mối liên kết giữa các tế bào cumulus bao quanh trứng nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của tinh trùng vào bên trong. Nhƣng để quá trình đó diễn ra thì phải có đủ lƣợng enzyme hyaluronidase, do đó nồng độ tinh trùng là yếu tố cần thiết, nhƣng nồng độ tinh trùng cũng không đƣợc quá cao vì sẽ gây ảnh hƣởng xấu cho sự phát triển của trứng và làm giảm tỷ lệ thụ tinh. Môi trƣờng IVF: có nhiều loại môi trƣờng IVF khác nhau và phù hợp cho từng loài động vật, nhƣ môi trƣờng NCSU 23 dùng cho heo, môi trƣờng TYH và Fert-TALP dùng cho chó. Kỹ thuật của ngƣời thao tác: trong kỹ thuật IVF tất cả mọi quá trình đều có sự tham gia trực tiếp của ngƣời thao tác do đó để góp phần vào tỷ lệ thành công trong IVF thì trƣớc hết ngƣời thao tác phải có kinh nghiệm, sự tỷ mỉ và chính xác trong công việc. Mặc khác, thao tác cũng là một khâu rất dễ xảy ra sự tạp nhiễm từ các nguồn bên ngoài mà đó là một vấn đề rất khó khăn và phức tạp trong khâu giải quyết, làm giảm đáng kể tỷ lệ thành công. 26 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành Thời gian: từ 1/3/2007 đến 15/8/2007 Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa khoa Chăn Nuôi Thú Y 3.2 Nội dung nghiên cứu Cải thiện quy trình nuôi chín trứng và nhuộm trứng để xác định các giai đoạn phát triển của trứng So sán