Khóa luận Bước đầu xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real - Time PCR

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ . iii

TÓM TẮT . iv

MỤC LỤC . vi

CHỮ VIẾT TẮT . xi

DANH MỤC HÌNH . xii

DANH MỤC BẢNG . xiv

PHẦN I: MỞ ĐẦU . 1

1.Đặt vấn đề . 1

2.Mục đích và yêu cầu . 2

2.1.Mục đích .2

2.2.Yêu cầu .2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3

1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) . 3

2. Quá trình tạo sinh vật GMO . 3

2.1.Quá trình cơ bản .3

2.2.Promoter CaMV 35S .4

3.Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen . 6

3.1.Ứng dụng .6

3.1.1. Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] . 6

3.1.2. Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17]. 7

3.2.Tác động có lợi của thực vật chuyển gen .8

4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới . 9

4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới .11

5.Ảnh hƣởng bất lợi và dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen . 12

5.1.Các rủi ro có thể gặp [34] .12

5.2.Tác động có hại .12

5.2.1. Môi trường . 13

5.2.2. Sức khoẻ người tiêu dùng . 13

5.2.3. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể . 14

5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .14

6. . Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới . 16

6.1.Quy định tại châu Âu [33]: .17

6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA . 18

6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu . 19

6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 19

6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen . 19

7. . Tình hình Việt Nam . 21

7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen .21

7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen .21

8. . Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen . 22

8.1.Phương pháp ELISA .23

8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] .23

8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR .24

8.3.1. Hóa chất định lượng . 24

8.3.1.1. SYBR Green I . 25

8.3.1.2. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) . 25

8.3.2. Công cụ phát hiện . 27

8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR .28

8.4.1. Quan hệ định lượng . 28

8.4.2. Thiết kế thí nghiệm . 29

8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR . 30

8.4.4. Tính toán hàm lượng GMO . 31

8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen

[9][44]32

8.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên

promoter 35S. .34

8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S. . 34

8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S . 35

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 36

1.Nội dung nghiên cứu . 36

2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm . 36

2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm .36

2.2.Thời gian thực hiện .36

3.Tiến trình thí nghiệm: . 36

4.Vật liệu thí nghiệm . 37

5.Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA . 38

5.1.Mục tiêu .38

5.2.Vật liệu .38

5.3.Phương pháp thực hiện .38

5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích.41

6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 41

6.1.Mục tiêu .41

6.2.Nguyên tắc .41

6.3.Vật liệu thí nghiệm .42

6.4.Trang thiết bị .42

6.5.Phương pháp thực hiện .43

6.5.1. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR . 43

6.5.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại . 43

6.5.3. Phát hiện sản phẩm khuếch đại. 44

6.5.4. Phân tích kết quả . 45

7.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen . 46

7.1.Mục tiêu .46

7.2.Nguyên tắc .46

7.3.Vật liệu thí nghiệm .46

7.4.Trang thiết bị .46

7.5.Phương pháp thực hiện .46

7.5.1. Bố trí thí nghiệm . 46

7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S . 47

7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng . 48

7.5.2. Thành phần phản ứng PCR . 48

7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix . 49

7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix . 49

7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR . 49

7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển . 50

7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm . 51

8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR.

. 54

8.1.Mục tiêu .54

8.2.Nguyên tắc .54

8.3.Vật liệu thí nghiệm .54

8.4.Trang thiết bị .54

8.5.Hóa chất .54

8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix . 55

8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference

calibration DNA standards) . 55

8.6.Phương pháp thực hiện .55

8.6.1. Bố trí thí nghiệm . 56

8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng . 56

8.6.1.2. Độ chính xác:. 56

8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng . 56

8.6.3. Thành phần phản ứng Real-Time PCR . 57

8.6.4. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR . 57

8.6.5. Phân tích kết quả . 58

9.Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trƣờng 58

9.1.Mục tiêu .58

9.2.Nguyên tắc .58

9.3.Vật liệu thí nghiệm .58

9.4.Trang thiết bị và hóa chất .58

9.5.Phương pháp thực hiện .59

9.5.1. Bố trí thí nghiệm . 59

9.5.2. Thiết kế phản ứng định lượng . 59

9.5.3. Thành phần phản ứng và chương trình nhiệt thiết lập . 59

9.5.4. Phân tích kết quả . 59

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 60

1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA . 60

2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 63

2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống .63

2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green .65

3.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO . 71

3.1.Xây dựng đường chuẩn: .71

3.2.Đánh giá kết quả định lượng .74

4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR

. 76

4.1.Độ nhạy của phương pháp: .76

4.2.Độ chính xác của phương pháp .78

5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR . 79

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 85

1.Kết luận . 85

2.Đề nghị . 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 87

PHỤ LỤC . 92