Khóa luận Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ

eo thƣa cấp một. Centromere là vùng phân hóa của NST có vai trò đính kết hai nhiễm sắc tử với nhau, đồng thời giúp cho nhiễm sắc tử phân ly khỏi nhau và di chuyển về hai cực của tế bào nhờ các sợi của thoi vô sắc. Centromere chia NST thành 2 vế, chiều của 2 vế phụ thuộc vào vị trí centromere. Ngƣời ta thành lập chỉ số centromere (centromere index – Ic) để xác định vị trí của centromere và các kiểu hình NST. P: chiều dài vế ngắn. Q: chiều dài vế dài. 7 Theo Eldridge (1985), nhiễm sắc thể có các kiểu hình sau: ־ Acrocentric có centromere ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc. ־ Telocentric có centromere ở ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể. ־ Subtelocentric có centromere nằm gần điểm tận cùng nhiễm sắc thể. ־ Submetacentric có centromere ở gần chính giữa (Q > P). ־ Metacentric có centromere ở chính giữa chia 2 vế bằng nhau (P = Q). Có một số tranh luận khoa học về kiểu hình nhiễm sắc thể. Ngƣời ta tự hỏi telocentric có thật hay không. Một số nghiên cứu chứng minh rằng telocentric thật sự tồn tại, centromere của telocentric có dính một lƣợng rất nhỏ chất nhiễm sắc mà chúng ta khó xác định đƣợc. Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể (Nguồn c) Telomere Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử ADN liên kết với protein tạo thành các sợi NST xoắn, gấp khúc chạy suốt NST. Đầu tận cùng của phân tử ADN ở đầu tận cùng của NST gọi là telomere. Những dẫn liệu về cấu trúc phân tử đã chứng minh rằng telomere có ba chức năng quan trọng: ־ Ngăn cản không cho enzyme deoxiribonuclease phân giải đầu tận cùng của phân tử ADN ־ Ngăn cản không cho NST trong bộ kết dính nhau ־ Tạo thuận lợi cho tái bản ADN ở phần đầu cuối của phân tử Telomere có cấu trúc và thành phần đặc thù gồm những đoạn lặp nucleotid, tuy khác nhau ở các loài nhƣng thƣờng thể hiện theo phƣơng thức 5’ – T1-4 A0-1 G1-8 – 3’. Ví dụ ở ngƣời cũng nhƣ động vật có xƣơng sống có đoạn lặp lại là TTAGGG, ở thực vật arabidopsis thaliana có đoạn lặp lại là TTTAGGG. 8 2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể a) Sợi nucleosome Trong nhiễm sắc thể, ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc sợi xoắn nhiều cấp, đƣợc gọi là sợi nhiễm sắc. Sợi nhiễm sắc cơ bản có đƣờng kính 11 nm, là chuỗi hạt cƣờm, đƣợc gọi là sợi nucleosome. Mỗi hạt cƣờm là một nucleosome có kích thƣớc 11 nm dạng khúc giò gồm lõi đƣợc cấu tạo bởi 8 phân tử histon (2 H2A, 2 H2B, 2 H3, và 2 H4), sợi xoắn kép ADN cuốn xung quanh lõi histon với 1,75 vòng (chứa khoảng 146 cặp nucleotid). Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép ADN dài khoảng 60 nucleotid. Các sợi nucleosome gấp khúc, cuộn lại nhờ các histon H1, mỗi cuộn gồm sáu nucleosome, để tạo thành các sợi nhiễm sắc lớn hơn có đƣờng kính 30nm, đƣợc gọi là sợi solenoid. b) Các cấp độ cấu trúc nhiễm sắc thể Sợi solenoid sẽ gấp khúc tạo nên các vòng bên (looped domains) chứa khoảng 20.000 – 80.000 cặp nucleotid và có kích thƣớc khoảng 300nm. Các sợi 300 nm sẽ cuộn lại tạo nên các sợi nhiễm sắc ở cấp độ lớn hơn từ 700nm đến 1400nm tức là các nhiễm sắc tử. Ngoài protein histon, trong NST còn có nhiều protein axit có vai trò điều hòa hoạt động của gen. Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể (Nguồn 9 2.3 Chu kỳ sống của tế bào Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào đƣợc hình thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thức sự phân bào hình thành tế bào mới. Ngƣời ta chia chu kỳ tế bào ra hai thời kỳ chính: gian kỳ (interphase), kỳ phân bào (mitosis). Thời gian của một chu kỳ sống của tế bào động vật rất dài, từ 20 đến 40 giờ. Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào (Nguồn 2.3.1 Gian kỳ Trong gian kỳ tế bào thực hiện các chức năng trao đổi chất, các hoạt động sống khác nhau nhƣ tổng hợp các ARN (acid ribonucleotide) và ADN, protein và các enzyme chuẩn bị cho sự phân bào. Tùy theo đặc điểm chức năng ngƣời ta chia tế bào gian kỳ ra làm ba giai đoạn hay pha liên tiếp nhau: giai đoạn G1 (gap 1), giai đoạn S (synthesis) và giai đoạn G2 (gap 2). Thời gian tế bào ở giai đoạn gian kỳ rất dài, chiếm hơn 90% thời gian chu kỳ sống của tế bào. Thời gian này tùy thuộc vào thời gian của 3 pha G1 + S + G2, đặc biệt tùy thuộc vào G1. Vì ở các tế bào khác nhau thì thời gian G1 là rất khác nhau, còn giai đoạn S và G2 tƣơng đối ổn định (Eldridge, 1985). Ví dụ ở tế bào chuột, thời gian ở G1 là 9,5 giờ, S 7,5 giờ, G2 là 1 giờ và thời gian ở kỳ phân bào 45,5 phút. Vậy thời gian tế bào chuột ở giai đoạn gian kỳ chiếm hơn 95% thời gian của một chu kỳ sống ở tế bào chuột. 10 2.3.1.1 Pha G1 Pha G1 tiếp ngay sau phân bào, là pha đầu tiên của tế bào con. Thời gian của G1 kéo dài từ ngay sau khi tế bào tạo thành do phân bào, cho đến khi bắt đầu pha S là pha tổng hợp ADN. Vào cuối pha G1 có một thời điểm đƣợc gọi là điểm hạn định (restriction point), điểm R. Nếu tế bào vƣợt qua điểm R, chúng tiếp tục đi vào pha S. Trong nuôi cấy tế bào, tế bào có vƣợt qua điểm hạn định hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện một trƣờng. Nhân tố điều chỉnh thời điểm R là hệ protein phức tạp trong đó có các cyclin và kinase. Đối với các tế bào biệt hóa thì tế bào không vƣợt qua R mà đi vào quá trình biệt hóa tế bào. 2.3.1.2 Pha S Pha S là pha tiếp theo pha G1, đƣợc gọi là pha tổng hợp ADN vì chính trong pha này xảy ra sự tái bản ADN và nhân đôi số lƣợng NST của tế bào. Vào cuối pha G1, tế bào tổng hợp một loại protein đặc trƣng là cylin A và nhanh chóng tích lũy trong nhân tế bào. Protein cyclin A cùng với enzyme kinase sẽ xúc tiến sự tái bản ADN. Protein cyclin A tác động cho tới cuối pha S thì biến mất. Thời gian kéo dài của pha S ở đa số tế bào nhân thực tƣơng đối ổn định từ 6 – 8 giờ. 2.3.1.2 Pha G2 Tiếp theo S là pha G2, thời gian của G2 ngắn từ 1 – 4 giờ. Trong pha G2, các ARN và protein đƣợc tổng hợp chuẩn bị cho sự phân bào. Cuối pha G2 một protein đƣợc tổng hợp là cyclin b đƣợc tích lũy trong nhân cho đến tiền kỳ phân bào. Cyclin b hoạt hóa enzyme kinase tạo thành các vi ống tubulin hình thành các thoi phân bào. 2.3.1.2 Phân bào Tiếp theo pha G2 là pha M (mitosis) thời kỳ tế bào mẹ phân chia thành hai tế bào con. Sự phân bào là phƣơng thức sinh sản của tế bào, và là phƣơng thức tế bào mẹ truyền thông tin di truyền chứa DNA cho hai tế bào con. Ngƣời ta phân biệt bốn dạng phân bào sau: nguyên phân, giảm phân, trực phân, nội phân. 11 2.3.2 Nguyên phân 2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân Nguyên phân hay còn đƣợc gọi là phân bào nguyên nhiễm, xảy ra trong pha M của chu trình tế bào, tiếp ngay sau pha G2. Qua M, tế bào mẹ sau khi đã đi qua pha S sẽ tạo hai tế bào con, mỗi tế bào con mang bộ máy di truyền giống hệt tế bào mẹ. Hiện tƣợng này đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Strasburger và Flemming từ những năm 1882, khi quan sát thấy các cấu trúc sợi nên đặt tên là phân bào có tơ (Nguyễn nhƣ hiền, 2005). 2.3.2.2 Các kỳ của phân bào a) Tiền kỳ (prophase) Tiền kỳ đƣợc tiếp theo sau pha G2 của gian kỳ. Rất khó phân biệt một cách chính xác điểm chuyển tiếp này, các hiện tƣợng đặc trƣng cho tiền kỳ là: Hình thành nhiễm sắc thể: chất nhiễm sắc ở gian kỳ bao gồm các sợi nhiễm sắc đã đƣợc nhân đôi qua pha S, trở nên xoắn và cô đặc lại, hình thành các NST thấy rõ dƣới kính hiển vi thƣờng, mà số lƣợng, hình thái đặc trƣng cho loài. Màng hạch nhân có nhiều thay đổi: hạch nhân giảm thể tích, phân rã và biến mất. Màng nhân đứt thành nhiều đoạn và biến thành các bóng không bào bé phân tán trong tế bào chất. Hình thành bộ máy phân bào: qua pha S, trung tử nhân đôi tạo thành 2 đôi trung tử con, do sự hoạt hóa của các chất quanh trung tử, các đơn hợp tubulin trong tế bào hợp tạo thành các vi ống tubulin. Các vi ống phóng xạ quanh trung tử tạo thành sao phân bào, hai sao di chuyển về hai cực của tế bào. Giữa hai sao, các vi ống phát triển sắp xếp thành hệ thống ống có dạng hình thoi, đƣợc gọi là thoi phân bào hay thoi vô sắc. Cấu tạo nên thoi có hai dạng vi ống: vi ống cực và vi ống tâm động. Đến cuối tiền kỳ, khi màng nhân biến mất thì bộ máy thoi với hai sao đƣợc hình thành. Tiền kỳ chiếm thời gian nhiều nhất trong kỳ nguyên phân. Ở tế bào động vật, tiền kỳ chiếm hơn 50 % thời gian trong giai đoạn tế bào phân chia (Eldridge, 1985). 12 b) Trung kỳ sớm (prometaphase) Bắt đầu khi màng nhân tiêu biến thành các bong bóng nhỏ phân tán trong tế bào chất quanh thoi phân bào. Khi vùng nhân biến mất thì thoi vô sắc di chuyển chiếm ngay vị trí trung tâm. Lúc này centromere đƣợc phân hóa thành 2 cấu trúc đƣợc gọi là tâm động có kích thƣớc khoảng 1 µm. Thông qua tâm động, NST đƣợc đính với các sợi tâm động của thoi. c) Trung kỳ (metaphase) Đối với tế bào động vật, thời gian tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất ngắn, chỉ kéo dài từ năm đến bảy phút (Eldridge, 1985). Trong giai đoạn này, nhiễm sắc thể xoắn, cô đặc, co ngắn tối đa và sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, tạo nên tấm trung kỳ. Tấm trung kỳ nằm thẳng góc với trục dọc của thoi. Đây cũng là thời điểm có thể quan sát hình dạng, số lƣợng NST rõ nhất. Vì thế ngƣời ta thƣờng tập trung vào giai đoạn này để nghiên cứu kiểu nhân hay đặc điểm NST của mỗi loài. d) Hậu kỳ (anaphase) Nhiễm sắc thể tách đôi và rời khỏi nhau tạo thành hai NST con độc lập. Nhiễm sắc thể con di chuyển về 2 cực nhờ sự co ngắn của sợi tâm động, phối hợp với sự kéo dài của các sợi cực và hẹp lại của thoi. e) Mạt kỳ (telophase) Trong kỳ này, các NST con đã di chuyển đến hai cực, giãn xoắn, dài ra và biến dạng thành chất nhiễm sắc. Hạch nhân đƣợc tái tạo, hình thành 2 nhân con trong khối tế bào chất chung. Quá trình phân chia tế bào chất của tế bào bắt đầu từ cuối hậu kỳ hoặc đầu mạt kỳ và diễn ra suốt mạt kỳ. Sự phân chia này bắt đầu bởi sự hình thành một eo thắt, đƣợc cấu tạo bởi các vòng vi sợi actin nằm giữa hai nhân con. Khi vòng vi sợi actin co rút kéo theo phần màng sinh chất lõm thắt vào trung tâm, và khi màng nối với nhau sẽ phân tách tế bào chất thành 2 nửa, mỗi nửa chứa một nhân con. Mặt phẳng phân cắt tế bào chất thẳng góc với trục của thoi phân bào. 13 Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm (Nguồn 14 2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể Cơ chế chung của việc nghiên cứu kiểu nhân là giải phóng NST ở các tế bào, mô ở giai đoạn trung kỳ. Sau đó tiến hành nhuộm để quan sát hình thái, cấu trúc, số lƣợng cũng nhƣ những băng vạch trên nhiễm sắc thể. Có hai kỹ thuật dựa trên cơ chế này để nghiên cứu NST là kỹ thuật splash và kỹ thuật squash. 2.4.1 Kỹ thuật splash Kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể từ rất lâu. Cơ chế của kỹ thuật này theo đúng theo tên gọi của nó là “splash” có nghĩa là “bắn” hay “văng”. Với kỹ thuật này, màng tế bào sẽ bị phá hủy, những giọt dịch chứa nhân của tế bào sẽ đƣợc cho rơi từ một độ cao thích hợp lên một mặt phẳng, nhờ điều này mà nhiễm sắc thể bị bắn ra khỏi nhân và trải đều trên phiến kính. Ta có thể tiến hành nhuộm và quan sát nhiễm sắc thể. Kỹ thuật này đơn giản, đáng tin cậy và đƣợc ứng dụng trên các nguồn tế bào nhƣ: a) Tế bào in vivo Kỹ thuật splash đƣợc ứng dụng kỹ thuật đƣợc thực hiện đầu tiên ở các mô, tế bào phân chia nhanh trong in vivo để nghiên cứu về NST. Những mô, tế bào có thể sử dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể ngay nhƣ: rễ ở thực vật, hay tủy xƣơng, tế bào lách, biểu mô ruột ở động vật hữu nhũ, lƣỡng cƣ và chim (Herbert, 1993). Những mẫu mô này đƣợc ngâm trong những hỗn hợp dung môi nhƣ metanol – acid acetic để cố định mẫu, sau đó mẫu đƣợc nhuộm và bảo quản bởi một lớp papain. Tuy nhiên phƣơng pháp này chỉ thực hiện đƣợc trên những loài có số lƣợng NST thấp, đối với những loài nhƣ gia cầm có số lƣợng nhiều thì không có kết quả chính xác. b) Tế bào nuôi cấy in vitro Khắc phục nhƣợc điểm của những tế bào in vivo, kỹ thuật trên sử dùng nguồn tế bào đã đƣợc nuôi cấy in vitro để thay thế. Năm 1885, Roux là ngƣời báo cáo đầu tiên về nuôi cấy tế bào in vitro, hơn 100 năm qua thuật ngữ “nuôi cấy tế bào” vẫn đƣợc dùng, mặc dù lĩnh vực này đã đƣợc mở rộng từ thập niên 1950 khi các nhà khoa học đã sử dụng những tế bào nuôi cấy rời (Eldridge, 1985). 15 Những mẫu mô nhƣ tim, da, gan, thận, phổi thƣờng đƣợc sử dụng nuôi cấy để nghiên cứu kiểu nhân, vì tế bào của những mẫu mô này có thể phát triển và phân chia mà không cần các tác nhân kích thích đặc biệt (Herbert, 1993). Bên cạnh đó, ngƣời ta còn nuôi cấy nang noãn hay phôi nang (blastocyst) để nghiên cứu kiểu nhân (Eldridge, 1985). Tuy nhiên phƣơng pháp này vẫn có một số nhƣợc điểm là: sự phân chia của tế bào rất chậm và thời gian nuôi cấy tế bào thƣờng theo quy trình dài ngày từ một đến ba tuần. Bên cạnh đó các mô trên cơ thể rất khó trong việc bảo quản cũng nhƣ nuôi cấy tế bào, do các tế bào của mô này đòi hỏi phải có môi trƣờng sinh khiết nhƣ trong cơ thể và tế bào phải bám dính trên một gián thể mới tồn tại và phát triển đƣợc. c) Tế bào bạch cầu Cho tới năm 1960, tế bào bạch cầu chƣa đƣợc dùng để nghiên cứu NST. Vì ngƣời ta cho rằng tế bào bạch cầu, đặc biệt là tế bào lympho không thể phân chia khi đã đi vào dòng máu trong cơ thể. Năm 1960, Novell vô tình phát hiện ra Phytohemagllutinin (PHA) là tác nhân kích thích tế bào bạch cầu phân bào. Nó đƣợc chiết xuất từ cây đậu đỏ phaseolus vulgaris. Ông đặt tên phytohemaglutinin là do “phyto” nghĩa là thực vật, “hem” thuộc về máu và “agllutinin” có nghĩa là kết dính (Eldridge, 1985). Đặc tính của nó là có khả năng làm lắng tụ hồng cầu, nhờ đó mà tế bào bạch cầu đƣợc tách ra. Chính vì điều này mà làm tế bào bạch cầu, và chủ yếu là tế bào lympho có khả năng phân chia (Herbert, 1993). Ngày nay, ngƣời ta có thể sử dụng Pokeweed có thể thay thế cho PHA trong nuôi cấy tế bào bạch cầu. Tuy nhiên khả năng tác dụng của nó yếu hơn PHA. Pokeweed chỉ áp dụng cho những loại máu đòi hỏi nồng độ PHA thấp. Việc phát hiện ra PHA là một bƣớc tiến lớn trong việc nghiên cứu NST, vì tế bào bạch cầu có những ƣu điểm vƣợt trội so những dòng tế bào trƣớc đây. Thời gian phát triển của tế bào rất ngắn từ 48 đến 72 giờ, bạch cầu dể tồn tại trong môi trƣờng nuôi cấy và có khả phát triển tốt trong môi trƣờng huyền phù. Do đó tế bào bạch cầu đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu NST của các loài vật nuôi nhƣ: heo, bò, dê, cừu, gà… 16 Khi nuôi cấy in vitro, tế bào bạch cầu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp có bổ sung chất kích thích phân bào là PHA hoặc Pokeweed. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, tế bào đƣợc xử lý và cố định trên một mặt phẳng nhất định và đƣợc nhuộm màu. Bằng kỹ thuật nhuộm băng nhƣ: nhuộm giemsa, nhuộm huỳnh quang, nhuộm màu kết hợp với xử lý bằng enzyme, hoặc bằng nhiệt sẽ làm xuất hiện các băng vạch trên NST, kỹ thuật này đƣợc gọi là “banding”. Các kỹ thuật banding thƣờng dùng là G-banding, R-banding, C-banding, Q-banding, T-banding… Sự hiện diện và phân bố các băng trên NST ở trung kỳ có thể phản ánh kiểu tổ chức thành đơn vị nhóm của sự hoạt hóa gen. Ví dụ: băng C tƣơng ứng với vùng chứa chứa đoạn ADN lặp lại và liên kết rất chặt với các protein acid. 2.4.2 Kỹ thuật squash Một phƣơng pháp khác trong nghiên cứu NST mà nó thƣờng dùng trong nghiên cứu hệ gen là kỹ thuật squash. Cơ chế của kỹ thuật này rất đơn giản. Các tế bào hay các mẫu mô nhỏ trên một mặt phẳng cố định, đặt một miếng kính phủ lên và tác động một lực mạnh lên kính phủ làm màng tế bào và màng nhân vỡ ra, giải phóng NST. Ƣu điểm của kỹ thuật này là có thể khống chế đƣợc lực tác dụng theo từng loại các tế bào do đó có thể thu nhận đƣợc nhiều tế bào ở trung kỳ. Kỹ thuật này đƣợc báo cáo đầu những năm 1930, nó đƣợc nghiên cứu đầu tiên trên NST ngƣời năm 1944. 2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ Năm 1926, Painter là ngƣời đầu tiên báo cáo số lƣợng nhiễm sắc thể thỏ là 2n = 44, sau đó rất nhiều báo cáo về kiểu nhân của thỏ trên nhiều loại tế bào khác nhau (Kannan và ctv, 2006). Năm 1962, Sarkar và ctv đã nuôi cấy lớp tế bào giác mạc và mô của phổi, Nicolai và Shaver (1977) sử dụng phôi nang sáu ngày tuổi của thỏ để nghiên cứu NST. Năm 2002, Hayes đã nguyên cứu kiểu nhân thỏ trên nguyên sợi bào. Và trong thời gian gần đây đã có những báo cáo về kiểu nhân NST thỏ trên tế bào bạch cầu nhƣ Parkányi và ctv (2004), Kannan và ctv (2006). 17 Dựa theo vị trí của centromere chia NST thỏ thành bốn dạng metacentric, submetacentric, subtelocentric và telocentric. Mỗi nhóm đƣợc xếp theo kiểu hình và chiều dài giảm dần. Theo Ford và ctv (1980), nhiễm sắc thể của thỏ đƣợc nhuộm theo kỹ thuật G – bading và đã đƣợc Hội nghị Quốc tế giới giới thiệu jiểu nhân nhƣ sau: Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thỏ Nhiễm sắc thể thứ Đặc điểm 1 p: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. Băng trung tâm nổi bật q: băng tối hẹp kề sát centromere. Hai băng tối gần tâm. Băng trung tâm rộng, sáng và hai băng tối xa tâm. 2 p: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. q: băng tối hẹp kề centromere. Hai băng tối gần tâm. Hai băng tối xa tâm. 3 p: băng tối gần tâm. Băng tối xa tâm q: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. 4 p: băng trung tâm tối q: hai băng trung tâm tối 5 p: băng tối kề sát centromere q: băng tối gần tâm. 6 p: băng tối gần centromere q: băng trung tâm tối 7 p: băng trung tâm tối. q: hai băng tối gần tâm. Băng trung tâm sáng và hai băng tối xa tâm. 8 p: băng tối xa tâm. Băng hẹp gần tâm thỉnh thoảng hiển nhiên q: ba băng tối có khoảng cách bằng nhau. Băng gần tâm phân hai. 9 p: băng gần tâm tối. q: băng gần tâm tối có thể phân thành hai. Băng tối xa tâm. 18 10 p: băng rộng, tối kề sát centromere. Băng trung tâm tối. q: băng tối hẹp gần tâm. Băng tối xa tâm có thể phân thành hai. 11 p: băng trung tâm tối. q: băng trung tâm tối. Băng xa tâm tối 12 p: băng gần tâm tối. q: băng sáng kề sát centromere. Hai băng gần tâm tối. Băng trung tâm tối. Hai băng xa tâm tối. 13 p: băng trung tâm tối. q: băng tối kề sát centromere. Hai băng trung tâm tối. Xa tâm sáng. 14 p: băng trung tâm tối. q: hai băng gần tâm tối. Hai băng xa tâm tối. 15 p: băng trung tâm tối. q: bốn hoặc năm băng tối khoảng cách bằng nhau. 16 p: băng xa tâm tối, hẹp. q: băng gần tâm tối. Băng xa tâm tối. 17 p: băng trung tâm hẹp, tối. q: ba băng tối khoảng cách bằng nhau 18 q: băng tối hẹp nằm gần centromere. Băng tối trung tâm có thể tách làm hai. Băng tối hẹp xa tâm 19 q: băng tối nằm gần centromere. Băng trung tâm tối. Băng tối hẹp xa tâm 20 q: băng tối nằm gần centromere. Băng tối trung tâm 21 q: băng tối nằm gần centromere. Xa tâm sáng X p: băng nằm gần tâm sáng. Băng nằm xa tâm tối q: băng nằm gần tâm tối. Hai băng tối nằm xa tâm Y p: băng tối kéo dài từ gần tâm đến xa tâm q: có thể không bắt màu nhuộm 19 Parkányi và ctv (2004) sau khi nhuộm bằng kỹ thuật G – banding và xây dựng kiểu nhân trên NST thỏ cũng đã đƣa ra năm dạng NST thỏ là: metacentric, submetacentric, subtelocentric, telocentric và acrocentric. Kiểu nhân đƣợc trình bày bởi Parkányi không có sự khác biệt với kiểu nhân đƣợc Hội đồng Quốc tế đƣa ra. Vì từ năm 1975, John và Freeman sau rất nhiều nghiên cứu trên kiểu hình nhiễm sắc thể đã cho rằng kiểu hình acrocentric cũng có thể bao gồm telocentric (Eldridge, 1985). Vì kiểu hình của arcocentric và telocentric đều không nhìn thấy đƣợc nhiễm sắc chất ở vế ngắn trong giai đoạn trung kỳ của tế bào, còn kiểu hình subtelocentric có thể thấy đƣợc trong giai đoạn trung kỳ. (Ford và ctv, 1980) (Parkányi và ctv, 2004) Hình 2.7 Kiểu nhân của nhiễm sắc thể thỏ đực 20 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm ־ Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2007. ־ Thỏ đƣợc nuôi tại trại bò Sarec, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. ־ Máu thỏ đƣợc nuôi cấy Phòng Nuôi Cấy Tế Bào và phân tích tại Phòng Sinh Lý Động Vật, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng Đề tài thực hiện chủ yếu trên máu của thỏ có trọng lƣợng từ 2 – 3 kg. 3.3 Nội dung nghiên cứu ־ Máu thỏ đƣợc lấy và nuôi cấy để thu nhận đƣợc các tế bào lympho ở trung kỳ, sau đó tiến hành nhuộm với giemsa. ־ Xem mẫu dƣới kính hiển vi để xác định hình dạng NST thỏ. 3.4 Vật liệu và hóa chất 3.4.1 Thiết bị ־ Tủ ấm ־ Tủ ấm CO2 ־ Tủ cấy vô trùng ־ Máy ly tâm ־ Kính hiển vi độ có máy chụp ảnh ־ Máy ảnh kỹ thuật số ־ Tủ lạnh -200C ־ Tủ lạnh 40C ־ Cân điện tử ־ Bồn ủ nhiệt ־ Máy vi tính 21 3.4.2 Dụng cụ ־ Micro pipette loại 100 - 1000 μl, 10 - 100 μl ־ Đầu típ tƣơng ứng với các loại micro pipette ־ Ống nghiệm 15ml, chai Rough, eppendorf ־ Ống kháng đông có tráng heparin ־ Chai nắp xanh 250ml và 1000ml ־ Kim tiêm, ống chích, găng tay, khẩu trang và phiến kính 3.4.3 Hóa chất a) Các chất trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào bạch cầu: 1) Môi trƣờng RPMI 1640 (1X) của hãng Gibco BRL - Thành phần: L glutamine và 25mM HEPES trong 500ml môi trƣờng. - Chức năng: Là môi trƣờng chính nuôi cấy tế bào bạch cầu, cung cấp dinh dƣỡng, ổn định nồng độ CO2 5% và pH cho sự phát triển tế bào. 2) Pokeweed - Thành phần: 10 mg lectin trong 10 ml PBS - Chức năng: là tác nhân chính kích thích bạch cầu phân bào. 3) Huyết thanh thai bò (FBS) đã đƣợc bất hoạt bằng nhiệt - Chức năng: cung cấp đạm, hấp thu các ion kim loại độc. Nếu thiếu, tế bào không phân bào mà chuyển sang giai đoạn G0. 4) Antibiotic – Antimycotic (100X) - Thành phần: 10000 IU/ml penicilin G sodium, 10000 µg/ml streptomicin sulfate, 25 µg/ml amphotericin trong dung dịch muối 0.85%. - Chức năng: ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại cho tế bào. 5) Colcemid (10 µg/ml) - Chức năng: phá hủy thoi vô sắc của tế bào ức chế sự nhân đôi của centromere của NST làm tế bào dừng lại ở giai đoạn trung kỳ. 22 Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu Tên hóa chất Dung tích RPMI 1640 (1X) 8 ml FBS 1 ml Pokeweed 80 µl Antibiotic – Antimycotic (100X) 100 µl Colcemid 40 µl b) Các dung dịch trong quá trình nhuộm nhiễm sắc thể 1) Dung dịch nhƣợc trƣơng KCl 0,075 M - Thành phần: 0,56 g KCl trong 100 ml nƣớc khử ion. - Tác dụng làm tăng thể tích tế bào lên. 2) Dung định cố định - Thành phần: 3 methanol : 1 acid axetic - Chức năng: giữ tế bào tình trạng trƣơng phòng, loại bỏ lipid, biến tính protein nên làm màng tế bào và màng nhân rất mỏng dể giải phóng NST. 3) Dung dịch nhuộm - Thành phần: 8 ml giemsa trong 100 ml dung dịch sorensen buffer. - Chức năng: nhuộm nhiễm sắc thể. c) Một số dung dịch khác 1) Nồng độ các chất trong giemsa Tên hóa chất Liều lƣợng Giemsa 1 g Methanol 50 ml Glycerin 50 ml 23 2) Nồng độ các chất trong dung dịch PBS (phosphate buffer saline) Tên mg/50 ml mg/100 ml NaCl 400 800 KCl 10 20 Na2HPO4.12H2O 145 290 H2PO4 10 20 3) Nồng độ các chất trong dung dịch đệm (Sorensen buffer) Tên hóa chất g/500 ml nƣớc cất g/1000 ml nƣớc cất KH2PO4 4,54 9,078 Na2HPO4 5,94 11,876 3.5 Bố trí thí nghiệm 3.5.1 Thí nghiệm 1: khảo sát thời gian ủ mẫu với colcemid - Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát tác động của colcemid theo thời gian đối với tế bào nuôi cấy để thu nhận đƣợc tế bào trung kỳ nhiều nhất. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm 3 nghiệm thức theo thời gian ủ với colcemid là 20 phút, 40 phút, 60 phút trƣớc khi nhuộm. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm gồm có 10 mẫu, bố trí theo kiểu một hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành nhuộm trên sáu phiến kính. 3.5.2 Thí nghiệm 2: khảo sát lƣợng máu nuôi cấy - Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát lƣợng máu nuôi cấy thích hợp để thu nhận đƣợc tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhiều nhất. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm hai nghiệm thức là nuôi cấy máu với thể tích 0,4 ml và 1ml. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm gồm 15 mẫu, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. 24 3.5.3 Thí nghiệm 3: tiến hành nuôi cấy trên ống nghiệm 15 ml. - Mục đích thí nghiệm: khảo sát khả năng dùng ống nghiệm 15 ml nuôi cấy tế bào bạch cầu để thay thể cho chai Rough - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm chia làm 2 nghiệm thức là nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml với lƣợng máu là 1 ml và theo thời gian ủ với colcemid là 60 phút. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm có 3 mẫu. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành nhuộm trên sáu phiến kính. 3.5.4 Chỉ tiêu quan sát Số mẫu nhuộm thành công: là số mẫu có phiến kính nhuộm thành công. Số phiến kính nhuộm thành công: là những phiến kính có bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ. Số lƣợng tế bào bạch cầu ở trung kỳ thu đƣợc theo từng thí nghiệm. 3.6 Phƣơng pháp tiến hành 3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ: 3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim Đầu tiên thỏ đƣợc cố định và xác định vị trí tim. Tim nằm ở giữa sụn mấu kiếm và xƣơng sƣờn đầu tiên, hơi lệch về phía trái đƣờng trắng khoản