Khóa luận Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà

thái chuyển động nhƣng chúng không thể nào bám vào bề mặt bình nuôi cấy đƣợc. Nhiều dòng tế bào, đặc biệt là những dòng từ mô bình thƣờng đƣợc xem là dòng phụ thuộc chỗ bám (Anchorage – Dependent), chúng chỉ có thể phát triển khi bám vào một chất nền thích hợp. Vài dòng tế bào không đƣợc xem là tế bào bình thƣờng (Transformed Cells) có thể phát triển nhanh mà không cần bám vào bề mặt hoặc di chuyển tự do trong dịch huyền phù (ví dụ: tế bào máu). 2.3.4. Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật Những tế bào nuôi cấy thƣờng đƣợc mô tả dựa trên hình thái (hình dạng và biểu hiện) hoặc đặc điểm chức năng của chúng. Có 5 dạng hình thái cơ bản: - Dạng biểu mô (Epithelial – like): những tế bào này bám trên bề mặt có dạng đa giác và dát mỏng. - Lympho bào (Lymphoblast – like): là những dòng tế bào thƣờng không bám lên bề mặt nhƣng tồn tại trong dịch huyền phù dƣới dạng hình cầu. - Nguyên sợi bào (Fibroblast – like): những tế bào bám trên bề mặt và có biểu hiện thon dài, có hai đầu, thƣờng có dạng xoáy khi nuôi cấy với mật độ dày đặc. 12 - Tế bào thần kinh (Neuron): cấu tạo có mấu lồi và sợi trục đặc trƣng, ít quan sát đƣợc sự phân chia trong môi trƣờng. - Tế bào cơ (Muscle – like): dạng ống nhỏ có nhiều nhân, biệt hóa thành dạng ống trong quá trình nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hình dạng và nuôi cấy nhiều tế bào có khả năng biểu hiện sự đa dạng về hình thái. Sử dụng kỹ thuật đồng nhất tế bào cũng có thể lai các tế bào với nhau bằng cách kết hợp những tế bào từ bố mẹ khác nhau, cho biểu hiện đặc điểm của cha hoặc mẹ hoặc cả cha và mẹ. Kỹ thuật này đƣợc sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng theo mong muốn. Những tế bào lai này gọi là Hybridomas đƣợc kết hợp từ hai tế bào khác nhau. Thứ nhất là một lympho bào lách (có khả năng sản xuất kháng thể mong muốn). Thứ hai là một tế bào myeloma đang phân chia nhanh (một loại tế bào ung thƣ). Kết quả, thể lai có thể sản xuất số lƣợng lớn kháng thể mong muốn. Những kháng thể này gọi là kháng thể đơn dòng bởi sự tinh sạch của nó, ứng dụng nhiều trong điều trị, chẩn đoán bệnh, và công nghiệp với giá trị hằng năm trên một tỉ đô la. 2.3.5. Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy Đặc điểm của những tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào nguồn gốc (gan, tim…) và khả năng thích nghi của chúng với điều kiện môi trƣờng. Những marker hóa sinh đƣợc sử dụng để kiểm tra xem tế bào có mang những đặc điểm chức năng mà chúng có trong cơ thể sống hay không (ví dụ: tế bào gan tiết albumin). Những dấu hiệu hình thái học hay siêu cấu trúc cũng có thể đƣợc xác định (chẳng hạn sự đập của tế bào tim). Thông thƣờng, những đặc điểm này có thể thay đổi hoặc mất đi khi đặt tế bào trong điều kiện nhân tạo. Sau một số lần cấy chuyền nhất định, vài dòng tế bào sẽ ngừng phân chia và biểu hiện sự hóa già. Những dòng tế bào này đƣợc gọi là “có hạn” (Finite); tế bào CEF là một dòng tế bào có hạn và số lần phân chia của tế bào CEF là từ 16 – 18 lần (Christman và ctv, 2006). Những dòng tế bào khác có thể phân chia không giới hạn (hoặc trở thành bất tử) và đƣợc gọi là dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Line). 13 Khi một dòng tế bào “có hạn” bình thƣờng trở thành bất tử, nó trải qua một sự thay đổi không thể đảo ngƣợc (Transformation). Nó có thể xảy ra tự phát hay do sử dụng thuốc, bức xạ hay virus có chủ định. Những tế bào biến đổi thƣờng phát triển dễ hơn và nhanh hơn, thƣờng có Chromosome lớn hoặc không bình thƣờng và có thể phát triển trong dịch huyền phù. 2.3.6. Điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật Một điều kiện thích hợp (“happy”) là điều kiện tốt hơn so với điều kiện cho phép tế bào tồn tại trong nuôi cấy. Thông thƣờng, nó là điều kiện cho phép những tế bào - ở số lƣợng rất ít – tăng số lƣợng thông qua sự phân chia. Đúng hơn là, khi có những điều kiện xác định, tế bào nuôi cấy sẽ biểu hiện sự thích hợp của chúng với điều kiện sống, nhƣ mang các chức năng sinh lý, sinh hóa quan trọng nhƣ trong cơ thể sống, chẳng hạn sự co cơ hay sự tiết hormone và enzyme. Để có điều kiện sống này, cần cung cấp cho tế bào nhiệt độ thích hợp, chất bám tốt và môi trƣờng nuôi cấy chuẩn xác.  Nhiệt độ thƣờng là tƣơng tự nhiệt độ cơ thể vật chủ mà tế bào đƣợc tách ra. Với sinh vật máu lạnh, nhiệt độ thƣờng thay đổi từ 18 – 250C, hầu hết động vật hữu nhũ đòi hỏi nhiệt độ từ 36 – 370C. Phạm vi nhiệt độ này đƣợc bảo đảm bằng nhiệt kế và tủ ấm phải đƣợc kiểm tra thƣờng xuyên.  Những tế bào phụ thuộc chỗ bám cũng đòi hỏi một chất nền tốt để bám và phát triển. Thủy tinh và plastic (đƣợc xử lý đặc biệt) thƣờng đƣợc sử dụng nhất. Tuy nhiên, những yếu tố bám nhƣ collagen, gelatin, fibronectin cũng có thể đƣợc sử dụng nhƣ “áo khoác” cho bề mặt bám để cải tiến sự phát triển và chức năng của những tế bào lấy từ não, máu, thận, gan, da… Thƣờng thì những tế bào phụ thuộc chỗ bám bình thƣờng sẽ có chức năng tốt hơn nếu chúng đƣợc phát triển trên một chất nền xốp hay có dạng tổ ong. Tế bào cũng có thể phát triển trên các hạt trong huyền phù (hạt thủy tinh, plastic, polyacrylamide và hệ thống các phân tử dextrin). Bằng cách này, các tế bào phụ thuộc chỗ bám có thể phát triển trong hệ thống nuôi cấy huyền phù và làm tăng khả năng sản xuất tế bào bằng phƣơng pháp sinh học. 14  Môi trƣờng nuôi cấy là yếu tố phức tạp và quan trọng nhất để kiểm soát khả năng làm tế bào phát triển tốt. Bên cạnh những đòi hỏi dinh dƣỡng cơ bản của tế bào, môi trƣờng nuôi cấy phải có nhiều yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH và áp suất, cung cấp các khí thiết yếu (O2 và CO2). Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy gồm amino acid, vitamine, khoáng và carbohydrate. Chúng cho phép tế bào tạo ra những protein mới và các thành phần thiết yếu khác cho sự phát triển và các hoạt động chức năng – tƣơng tự nhƣ sự cung cấp năng lƣợng cho trao đổi chất. Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không đƣợc tổng hợp trong cơ thể nên cần phải đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Nhu cầu về cysteine và tyrosine thay đổi khác nhau tùy theo dòng tế bào. Các amino acid không cần thiết khác cũng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng để bù đắp cho những dòng tế bào không có khả năng tổng hợp. Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào, hiện nay, một số bằng chứng cho thấy glutamine đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào nhƣ nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Vitamine: môi trƣờng MEM của Eagle (EMEM) chỉ có các vitamine thuộc nhóm B, các vitamine từ nhóm khác sẽ đƣợc bổ sung từ huyết thanh. Khi tăng thành phần môi trƣờng lên (mục đích để giảm lƣợng huyết thanh xuống) thì danh sách các vitamine trong môi trƣờng cũng phải tăng theo. Khi giảm lƣợng huyết thanh trong môi trƣờng thì việc bổ sung các vitamine khác ngoài những vitamine đã có sẳn trong môi trƣờng là rất cần thiết. Khi mật độ tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lƣợng vitamine cho dù trong môi trƣờng đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chế về vitamine có ảnh hƣởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trƣởng của tế bào hơn là trên mật độ tế bào. Muối: các loại muối chủ yếu nhƣ Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO3 2- , PO4 3- và HCO3 - là thành phần chính tạo ra áp suất thẩm thấu của môi trƣờng. Trong huyền 15 phù tế bào, lƣợng Ca2+ thƣờng đƣợc giảm xuống để hạn chế sự kết cụm của tế bào. Nồng độ của HCO3 - đƣợc xác định bởi nồng độ CO2 ở dạng khí. Glucose: glucose đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp năng lƣợng. Glucose đƣợc chuyển hóa chủ yếu bởi quá trình đƣờng phân (glycolyse) tạo ra acid lactic để đi qua chu trình Krebs giải phóng CO2. Nghiên cứu lƣợng acid lactic tích tụ trong môi trƣờng, đặc biệt là khi nuôi các tế bào phôi và các tế bào biến đổi, ngƣời ta thấy rằng chu trình Krebs ở đây hoạt động không trọn vẹn nhƣ in vivo, và carbon trong acid lactic chủ yếu là chuyển hóa từ glutamine, chỉ một phần nhỏ là từ glucose. Điều này giải thích cho nhu cầu về glutamine và glutamate của tế bào nuôi cấy. Khoáng chất: cũng nhƣ một vài loại vitamine, hầu hết các khoáng chất cần thiết cho tế bào đƣợc cung cấp bởi huyết thanh. Việc bổ sung các chất này vào môi trƣờng nói chung không cần thiết lắm, trừ khi có sự giảm lƣợng huyết thanh trong môi trƣờng. Trong môi trƣờng có hàm lƣợng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết thanh thì lúc đó cần phải bổ sung sắt, đồng, kẽm, selenium và các nguyên tố khác vào môi trƣờng nuôi cấy. Các chất hữu cơ khác: các hợp chất khác nhau nhƣ nucleoside, các chất trung gian của chu trình Krebs, pyruvate và lipid cũng có mặt trong các môi trƣờng nuôi cấy phức tạp. Những hợp chất này cần thiết khi giảm lƣợng huyết thanh trong môi trƣờng nuôi cấy. Các chất này có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng tế bào chuyên biêt. Trong hầu hết các loại môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật đều cần đến huyết thanh vì nó có những vai trò quan trọng nhƣ sau (Phan Kim Ngọc, 2002): - Cung cấp chất dinh dƣỡng quan trọng cho tế bào nhƣ các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lƣợng… - Cung cấp các nhân tố tăng trƣởng, kích thích cho tế bào tăng trƣởng và phân chia. - Kích thích sự phục hồi các tổn thƣơng của tế bào khi cấy chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzyme gây tổn thƣơng tế bào. 16 - Cải thiện tính tan của các chất dinh dƣỡng. - Cải thiện tính dích của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ. - Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy. Huyết thanh đƣợc sử dụng trong hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy mô là huyết thanh bê, huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh ngƣời. Huyết thanh bê thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất, kế đến là huyết thanh bò (tùy theo nhu cầu của dòng tế bào) và huyết thanh ngƣời đƣợc sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào của ngƣời. Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều. Ngoài ra, huyết thanh còn dể bị nhiễm virus, mycoplasma và khó ổn định chất lƣợng của những lô môi trƣờng khác nhau cũng nhƣ còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp, không chứa yếu tố ức chế đối với dòng tế bào nuôi cấy). Hormone: hormone có những ảnh hƣởng khác nhau trên tế bào và thƣờng khó có thể nhận ra đƣợc tác động chính của chúng. Insulin kích thích sự hấp thu glucose và amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế bào của nó đã ảnh hƣởng đến thuộc tính này. Một vài yếu tố tăng trƣởng kết hợp với chất nhận của insulin trên bề mặt của tế bào và có những hoạt động tƣơng tự. Các hormone tăng trƣởng có thể có mặt trong huyết thanh, đặc biệt là trong huyết thanh bò và cùng với somatomedine ảnh hƣởng trên sự phân bào. Hydrocortisone cũng có trong huyết thanh với hàm lƣợng thay đổi. Chất này có thể kích thích sự bám dính của tế bào và sự tăng sinh của tế bào. Nhƣng trong những điều kiện nhất định (nhƣ khi mật độ tế bào cao) thì cản sự phân bào và có thể cảm ứng sự biệt hóa tế bào. Trong các thí nghiệm giảm hoặc bỏ hẳn huyết thanh trong môi trƣờng nuôi cây cho thấy các hormone cần thiết cho sự nuôi cấy có thể cũng có mặt trong thành 17 phần của huyết thanh nên việc bổ sung huyết thanh vào môi trƣờng nuôi cấy là cần thiết. Các chất biến dưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có các amino acid, glucose, ketoacid và một số các dƣỡng chất, các chất biến dƣỡng trung gian. Những chất này quan trọng trong các môi trƣờng đơn giản, nhƣng ít quan trọng hơn trong các môi trƣờng phức tạp, đặc biệt là những môi trƣờng có ít các chất bổ sung khác và các amino acid với nồng độ cao. Các yếu tố kiềm hãm: huyết thanh có thể có chứa những cơ chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng sinh của tế bào. Một số chất có thể đƣợc tạo ra trong quá trình chuẩn bị môi trƣờng nhƣ độc tố của các loại vi khuẩn nhiễm vào môi trƣờng trƣớc khi qua lọc vô trùng, các phân đoạn của γ – globulin có thể chứa các loại kháng sinh gây trở ngại cho việc nuôi cấy. Hơi nóng có thể làm phân hủy một vài phức chất trong huyết thanh và làm giảm tính độc của immunoglobulin mà không gây hại đến các yếu tố tăng trƣởng là polypeptide, hơi nóng có thể làm phân hủy một số chất dễ bị biến tính bởi nhiệt và thành phần của huyết thanh sẽ không còn giống nhƣ trƣớc khi xử lý. Sự tác động của những yếu tố kiềm hãm chuyên biệt trong mô lên sự tăng sinh của tế bào hoặc những hormone ức chế ở trong huyết thanh chƣa thể xác định đƣợc, mặc dù một số hormone có thể ức chế theo cách không chuyên biệt. Môi trƣờng cũng góp phần kiểm soát pH và là chất đệm cho tế bào tránh sự thay đổi pH đột ngột. Chất đệm trong môi trƣờng thƣờng là CO2 – bicarbonate hay là đệm hữu cơ nhƣ HEPES (Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulphonic acid), đƣợc sử dụng để giữ pH môi trƣờng trong khoảng 7,0 – 7,4 tùy loại tế bào nuôi cấy. Đệm CO2 – bicarbonate điều chỉnh lƣợng CO2 hòa tan trong môi trƣờng, thƣờng đƣợc sử dụng khi dùng tủ ấm kiểm soát CO2 và đƣợc cung cấp từ 2 – 10% CO2 (với đệm của Earle), còn môi trƣờng sử dụng đệm CO2 – bicarbonate của Hank không đòi hỏi CO2, nhƣng phải đƣợc đặt trong bình kín. Cuối cùng, áp suất thẩm thấu rất quan trọng với việc điều chỉnh dòng chất trong và ngoài tế bào. Nó đƣợc kiểm soát bởi sự thêm hay bớt một lƣợng muối 18 trong môi trƣờng nuôi cấy. Sự bay hơi của môi trƣờng ở hệ thống nuôi cấy hở (đĩa…) sẽ làm tăng nhanh áp suất, làm cho tế bào bị stress, biến dạng hoặc chết. Với hệ thống nuôi cấy hở, cần có tủ ấm với ẩm độ cao để hạn chế sự bay hơi của môi trƣờng. Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy Ƣớc lƣợng trạng thái sức khỏe nói chung hay sự “happy” của tế bào nuôi cấy thƣờng dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phủ và biểu hiện chức năng đặc biệt.  Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) là dễ xác định nhất nhƣng thƣờng ít đƣợc sử dụng nhất. Tuy đặc điểm này đƣợc theo dõi thƣờng xuyên khi nuôi cấy nhƣng rất khó đƣa ra kết luận dựa vào những quan sát này. Ngoài ra, đặc điểm này không thể hiện một số lƣợng hay đo lƣờng chính xác nào. Phƣơng pháp này thỉnh thoảng sai khi quan sát tế bào bằng kính hiển vi và vi trƣờng quan sát xấu hay có biểu hiện bất thƣờng. Khi nghi ngờ, có thể nhuộm những tế bào đó với crystal violet hoặc các chất nhuộm mô khác để xác định vấn đề bất thƣờng.  Đếm tế bào để ƣớc lƣợng số lƣợng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển – tỷ lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy. Dựa vào đó để thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trƣờng, chất nền, huyết thanh…) tốt hơn cho tế bào.  Năng suất che phủ là phƣơng pháp kiểm tra dựa trên số lƣợng nhỏ tế bào (từ 20 – 200) bám trên bình nuôi cấy và số lƣợng các cụm tế bào đặc trƣng đƣợc xác định. Phần trăm các cụm tế bào đặc trƣng biểu hiện cho khả năng tồn tại, trong khi kích thƣớc cụm tế bào đặc trƣng cho tỷ lệ phát triển. Phƣơng pháp này tƣơng tự phƣơng pháp phân tích tỷ lệ phát triển, nhƣng nhạy cảm hơn với sự khác biệt nhỏ của điều kiện nuôi cấy.  Đặc điểm cuối cùng là sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thƣờng khó quan sát và đo lƣờng nhất, đƣợc xác định bằng các xét nghiệm hóa sinh và miễn dịch. Những tế bào đƣợc nuôi cấy có thể phát triển rất tốt trong điều kiện gần tối ƣu, 19 trong khi chức năng đặc biệt thƣờng đòi hỏi điều kiện nuôi cấy hoàn chỉnh và thƣờng nhanh chóng mất đi khi tế bào bám lên bề mặt bình nuôi cấy. 2.3.7. Vấn đề cần lƣu ý khi nuôi cấy tế bào động vật Tránh sự tạp nhiễm: sự tạp nhiễm trong nuôi cấy tế bào có hai loại chính là nhiễm hóa học và nhiễm sinh học. Nhiễm hóa học là khó phát hiện nhất, nó gây ra bởi nhiều tác nhân nhƣ: endotoxin, ion kim loại hoặc thuốc tẩy hóa học - những chất này không thể nhìn thấy đƣợc. Nhiễm sinh học: nấm, vi khuẩn phát triển nhanh và thƣờng có thể thấy biểu hiện trong nuôi cấy (thay đổi pH hoặc đục môi trƣờng) và do đó dễ phát hiện (thƣờng xảy ra nếu thiếu kháng sinh trong môi trƣờng nuôi cấy). Tuy nhiên, hai dạng khác của nhiễm sinh học là mycoplasma và virus thì không dễ phát hiện và đòi hỏi những phƣơng pháp xác định đặc biệt. Hai yêu cầu chính để tránh tạp nhiễm: thứ nhất là đảm bảo vô trùng tốt trong khu vực làm việc, thứ hai là môi trƣờng, dụng cụ phải đƣợc tiệt trùng, cất giữ và sắp xếp hợp lý. Sử dụng kháng sinh cẩn thận và có giới hạn trong nuôi cấy mô có thể giúp tránh tổn thất do tạp nhiễm sinh học. 2.3.8. Các pha của sự nuôi cấy tế bào động vật 2.3.8.1. Pha ức chế Pha ức chế là pha đầu tiên, nó phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhƣ thành phần, mật độ, trạng thái ban đầu của tế bào... Pha này xảy ra sớm, không tăng về số lƣợng tế bào (số lƣợng tế bào có thể giảm). Nếu mật độ nuôi cấy và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này sẽ kéo dài hơn. 2.3.8.2. Pha phát triển Sau 3 – 4 ngày nuôi cấy, số lƣợng tế bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng. Trong chẩn đoán, thƣờng sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển). 20 2.3.8.3. Pha ổn định Mật độ tế bào không tăng, tốc độ chết bằng tốc độ sinh trƣởng. Sự sinh trƣởng của tế bào bị hạn chế do: Hết dinh dƣỡng. Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể ức chế sự phát triển của tế bào. Tế bào đã phủ kín trên chất nền, nên không còn chỗ bám và không thể sinh sản tiếp đƣợc. 2.3.8.4. Pha suy giảm Số lƣợng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm. 2.4. Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy Để bảo đảm sức khỏe nói chung hay sự phát triển của tế bào nuôi cấy nói riêng cần chú ý giảm thiểu khả năng rủi ro và sự tạp nhiễm. Bên cạnh đó, khả năng phát triển nhanh của tế bào sẽ thay đổi, nhƣ tất cả mọi sinh vật, những biến đổi do tuổi tác hay sự thay đổi môi trƣờng có thể làm giảm khả năng và sự phát triển liên tục của tế bào. Có thể giải quyết những vấn đề này bằng cách bảo quản lạnh để dừng hoạt động sinh học tế bào, đặt chúng vào trong điều kiện ngừng hoạt động thật sự. Trong một thời gian dài, ý tƣởng này đƣợc xem là giả tƣởng cho đến năm 1949, Polge, Smith và Parkes phát hiện rằng glycerol ngăn chặn đƣợc sự phá hủy tế bào khi đông lạnh (John A. Ryan, 2004). Và từ đó, ngƣời ta đƣa ra nhiều quy trình đông lạnh tế bào, và đạt dƣợc kết quả rất tốt. 2.4.1. Những ƣu điểm của việc đông lạnh tế bào nuôi cấy - Tiết kiệm thời gian và tiền của. - Có nguồn để đáp ứng ngay khi cần. - Cung cấp một loại tế bào thuần nhất và giảm thiểu sự phát triển và hóa già của tế bào nuôi cấy. 21 2.4.2. Tiến trình bảo quản lạnh tế bào 2.4.2.1. Lựa chọn tế bào Chọn bình tế bào nuôi cấy ở gần cuối giai đoạn log phase (đầy 90%) và thay môi trƣờng phát triển mới trƣớc thu hoạch 24 giờ. Kiểm tra sự nhiễm (đặc biệt là Mycoplasma), kiểm tra sự đồng nhất của tế bào và cả một vài biểu hiện đặc biệt. 2.4.2.2. Thu hoạch tế bào Phải tiến hành đúng cách và thao tác thật nhẹ nhàng. 2.4.2.3. Đƣa vào chất bảo quản lạnh: Các chất có tác dụng bảo quản lạnh là methyl acetamide, methyl alcohol, ethylene glycol và polyvinyl pyrrolidone… Tuy nhiên, DMSO (dimethylsulfoxide) và glycerol là thuận tiện và đƣợc sử dụng nhiều nhất. Cần chú ý, DMSO là chất phân cực mạnh, dễ dàng thấm qua da và mang theo các chất có độc tính hay chất gây ung thƣ. 2.4.2.4. Đƣa vào ốngbảo quản. Hình 2.3. Ống bảo quản tế bào (Nguồn: cc.pdf). 2.4.2.5. Dán nhãn và ghi sổ. 2.4.2.6. Đƣa vào bình bảo quản lạnh: 22 (Nguồn: cc.pdf). Tốc độ làm lạnh thích hợp với hầu hết các dòng tế bào là giảm từ 1 đến 30C trong 1 phút. Bảo quản dƣới -1300C, giám sát lƣợng Nitơ lỏng thƣờng xuyên, và cần phải ghi chép vào sổ đầy đủ. 2.4.3. Một số vấn đề có thể ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản (John A. Ryan, 2004) 2.4.3.1. Quá trình thu hoạch và thao tác trên tế bào Thừa tác nhân tách tế bào, sử dụng chất bảo quản có chứa độc tính, đặt tế bào quá lâu ở nhiệt độ phòng hoặc pH không thích hợp… 2.4.3.2. Tiến trình làm lạnh Tế bào bị hƣ hỏng nhiều và khả năng sống giảm thƣờng do tốc độ làm lạnh quá nhanh hoặc quá chậm, hoặc tiến trình làm lạnh bị gián đoạn. Chất làm lạnh ở nồng độ không thích hợp cũng ảnh hƣởng khả năng sống của tế bào. 2.4.3.3. Quá trình trữ lạnh Khả năng sống của tế bào giảm khi nhiệt độ ấm lên lúc vận chuyển hoặc khi nhiệt độ bình chứa không ổn định. 2.4.3.4. Quá trình rã đông và hoạt hóa Rã đông quá lâu hoặc phƣơng pháp tách chất bảo quản không chính xác. 23 2.5. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vẫt Nuôi cấy tế bào đã trở thành một trong những công cụ cơ bản trong sinh học tế bào và sinh học phân tử. Một số ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật: 2.5.1. Thiết lập hệ thống mô hình Nuôi cấy tế bào cung cấp một hệ thống mô hình thích hợp cho nghiên cứu: 1- Sinh lý và sinh hóa tế bào, 2- Tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và tế bào, 3- Tác dụng của thuốc đối với tế bào, 4- Tiến trình và sự hóa già, 5- Những nghiên cứu về dinh dƣỡng. 2.5.2. Xét nghiệm độc tế bào Những tế bào nuôi cấy đƣợc sử dụng riêng hay kết hợp với các xét nghiệm trên cơ thể động vật để nghiên cứu hiệu của của thuốc, dƣợc phẩm và các hóa chất mới đối với sự tồn tại và phát triển của các loại tế bào khác nhau. Ứng dụng quan trọng là nuôi cấy tế bào gan và thận. 2.5.3. Nghiên cứu ung thƣ Từ khi phát hiện những tế bào bình thƣờng và những tế bào ung thƣ có thể phát triển trong điều kiện nuôi cấy, sự khác biệt của chúng đã đƣợc nghiên cứu một cách tỉ mỉ. Trong đó, ngƣời ta sử dụng hóa chất, virus và phóng xạ để làm biến đổi những tế bào đƣợc nuôi cấy bình thƣờng thành những tế bào ung thƣ. Từ đó nghiên cứu những nhân tố gây ra sự biến đổi. Những tế bào ung thƣ đƣợc nghiên cứu cũng đƣợc cung cấp cho các hệ thống xét nghiệm để xác định phƣơng pháp và thuốc điều trị thích hợp cho các loại ung thƣ khác nhau. 2.5.4. Virus học Một trong những ứng dụng cơ bản và sớm nhất của nuôi cấy tế bào là khả năng nhân lên của virus trong nuôi cấy tế bào (động vật) để sử dụng trong điều chế vaccine. Nuôi cấy tế bào cũng đƣợc sử dụng rộng rãi trong định danh và phân lập virus cũng nhƣ các nghiên cứu cơ bản nhƣ cách thức virus xâm nhập và phát triển trong cơ thể. 24 2.5.5. Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào Từ khi nhận thấy những tế bào nuôi cấy có thể sản xuất nhiều sản phẩm quan trọng, có 3 vấn đề đƣợc đặc biệt quan tâm: - Thứ nhất là sản xuất một lƣợng lớn virus để sản xuất vaccine, bao gồm vaccine bại liệt, dại, đậu gà, viêm gan B và sởi. - Thứ hai là sản xuất một lƣợng lớn tế bào dựa trên sự di truyền để sản xuất các protein có giá trị trong y học và thƣơng mại, bao gồm kháng thể đơn dòng, insulin, hormone… - Thứ ba là sử dụng tế bào ở dạng mô và cơ quan thay thế. Da nhân tạo sử dụng trong điều trị bỏng và loét là sản phẩm có giá trị thƣơng mại đầu tiên. Tuy nhiên, các cơ quan nhân tạo nhƣ gan, thận, lách thì đang trong giai đoạn thử nghiệm. Khả năng cung cấp các tế bào và mô thay thế có thể tiến xa hơn với những nghiên cứu về phôi và tế bào gốc trƣởng thành. Đây là loại tế bào có khả năng biến đổi thành những loại tế bào khác nhau. Điều quan trọng là cần có những nghiên cứu để kiểm soát sự phát triển cũng nhƣ chiều hƣớng phát triển của các tế bào này. 2.5.6. Chẩn đoán di truyền Chọc màng ối là kỹ thuật mà bác sĩ thu và nuôi cấy những tế bào phôi từ thai phụ, đây là một biện pháp quan trọng để chẩn đoán sớm những rối loạn của phôi. Những tế bào này đƣợc kiểm tra sự bất thƣờng của gene và chromosome dựa trên kiểu nhân, dự nhuộm màu chromosome và các lỹ thuật phân tử khác. 2.5.7. Kỹ thuật di truyền Khả năng chuyển nhiễm hoặc tái lập chƣơng trình của tế bào với vật liệu di truyền mới (DNA và gene) là công cụ quan trọng cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu sự biểu hiện của các gene này (thông qua những protein mới). Kỹ thuật này cũng đƣợc dùng để sản xuất những protein mới với số lƣợng lớn thông qua nuôi cấy tế bào (phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn). Côn trùng đƣợc sử dụng nhƣ một nhà máy tế bào nhỏ để tạo ra một lƣợng lớn protein – các protein này đƣợc sản 25 xuất sau khi gây nhiễm côn trùng với baculovirus đã đƣợc xử lý bằng kỹ thuật di truyền. 2.5.8. Liệu pháp gene Có khả năng các tế bào qua xử lý kỹ thuật di truyền đƣợc sử dụng cho điều trị gene. Tế bào đƣợc lấy ra từ bệnh nhân thiếu một gene chức năng và gene thiếu (hay bị hƣ hỏng) đó đƣợc đƣa vào tế bào. Những tế bào này đƣợc nuôi cấy rồi đƣa trở vào cơ thể bệnh nhân. Phƣơng pháp khác là đặt gene thiếu vào một vector virus và “gây nhiễm” vào bệnh nhân với hy vọng gene thiếu sẽ biểu hiện đƣợc trong các tế bào của bệnh nhân. 2.5.9. Phát triển và chọn lọc thuốc Xét nghiệm dực trên tế bào ngày càng quan trọng hơn đối với cô