Khóa luận Cô lập một số hợp chất diterpene từ phân đoạn cao ethyl acetate cây euphorbia antiquorum L

............................................................... 3 1.2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học ........................................................... 5 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .................................................................................. 12 2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp tiến hành ...................................................... 12 2.1.1. Hóa chất ......................................................................................................... 12 2.1.2. Thiết bị .......................................................................................................... 12 2.1.3. Phương pháp tiến hành .................................................................................. 12 2.2. Nguyên liệu ......................................................................................................... 13 2.3. Điều chế cao ethyl acetate ................................................................................. 13 2.4. Phân lập hợp chất TH1 và TH2 trong cao EA ................................................ 13 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .............................................................................................. 16 3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất TH1 ...................................................................... 16 3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất TH2 ...................................................................... 19 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ................................................................. 22 4.1. Kết luận ............................................................................................................... 22 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 23 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Hx n-hexane. C Chloroform. A Acetone. EA Ethyl acetate. Me Methanol. H2O Nước cất. NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance. 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance. HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence. HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation. HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation. COSY H-H Correlation Spectroscopy. NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy. HR-ESI-MS High Resolution-Electrospray Ionization-Mass Spectroscopy. s singlet. d doublet. t triplet. m multiplet. J Hằng số ghép cặp. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số hợp chất được cô lập từ thân và nhựa của cây E. antiquorum L. ...... 7 Bảng 3.1. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của TH1 với ent-14[S],16α,17- trihydroxyatisan-3-one ................................................................................................... 17 Bảng 3.2. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất TH2 với 20-deoxy- 16-hydroxyingenol ......................................................................................................... 21 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Một số loài chi Euphorbia ............................................................................... 2 Hình 1.2. Một số hình ảnh cây E. antiquorum L. ............................................................ 3 Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất hữu cơ trong cây E. antiquorum L. . ...................... 9 Hình 2.1. Một số hình ảnh trong quá trình phân lập các chất từ cao EA ...................... 14 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC, COSY, NOESY của TH1 14 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC, COSY, NOESY của TH2 20 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học các chất đã được cô lập ..................................................... 22 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. Quy trình cô lập chất từ cao EA của cây E. antiquorum L. ........................... 15 DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất TH1 ...................................................................... Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất TH1 ..................................................................... Phụ lục 3. Phổ HSQC của hợp chất TH1 .......................................................................... Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất TH1 ......................................................................... Phụ lục 5. Phổ COSY của hợp chất TH1 .......................................................................... Phụ lục 6. Phổ NOESY của hợp chất TH1 ....................................................................... Phụ lục 7. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TH2 ................................................................ Phụ lục 8. Phổ 1H-NMR của hợp chất TH2 ...................................................................... Phụ lục 9. Phổ 13C-NMR của hợp chất TH2 ..................................................................... Phụ lục 10. Phổ HSQC của hợp chất TH2 ........................................................................ Phụ lục 11. Phổ HMBC của hợp chất TH2 ....................................................................... Phụ lục 12. Phổ COSY của hợp chất TH2 ........................................................................ Phụ lục 13. Phổ NOESY của hợp chất TH2 ..................................................................... 1 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia nằm gần đường xích đạo, có khí hậu nhiệt đới gió mùa quanh năm và còn nằm trên khối Indosinias của vỏ Trái Đất bền vững từ rất lâu. Do đặc tính độ ẩm cao, nhiệt độ phù hợp mà thời tiết và vị trí địa lý của nước ta đã tạo thành một tổ hợp các điều kiện sinh thái thuận lợi cho sự sinh sôi, phát triển của của các loài thực vật. Vì thế, Việt Nam trở thành một trong những vùng đất có nền thực vật vô cùng đa dạng và phong phú, với hơn 12.000 loài sinh sống (chưa kể rong, rêu, tảo, ) [1]. Từ xa xưa, người dân chúng ta đã biết tận dụng đặc điểm thuận lợi này trong việc nghiên cứu dược tính của các loại cây thuốc và đã tạo nên một nền y học cổ truyền rất phát triển (thường gọi là Nam Y). Với kiến thức y học cổ truyền hàng nghìn năm cùng nguồn thảo dược vô cùng phong phú và đầy tiềm năng này đã tạo ra động cơ cho việc nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các hợp chất đó, nhằm mục đích phát hiện ra những chất có hoạt tính cao và từ đó mới tiến hành tổng hợp nên các hợp chất nhằm mục đích làm tăng tính đa dạng trong kho tàng y học thế giới. Hiện nay, ngành hóa dược trên thế giới đang có sự tiến triển vượt bậc. Cùng với những kỹ thuật, công nghệ phân lập, tổng hợp mới mà nhiều loại dược phẩm có giá trị y học cao đã xuất hiện. Những loại dược phẩm này góp vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe và an sinh cho nhân loại. Gần đây, những công trình nghiên cứu về chi Euphorbia đã cho thấy dược tính của chi này rất đa dạng và phong phú, hứa hẹn sẽ là nguồn thảo dược đầy tiềm năng trong ngành y học. Một số công dụng của chi Euphorbia như phần nhựa của cây có nhiều tác dụng y học điển hình như các bài thuốc trị đau dạ dày, tiểu đường, thuốc chống viêm, sát khuẩn [2]. Trong đó, Euphorbia antiquorum L. trở nên nổi bật với nhiều chức năng chữa bệnh được sử dụng trong các đơn thuốc Đông Y trong nhiều quốc gia ở Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ và thành phần hóa học của cây cho thấy sự hiện diện một số hợp chất diterpene có giá trị. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về cây này vẫn còn hạn chế. Từ đó, xuất phát từ kết quả nghiên cứu của thế giới và bổ sung vào nền y dược học các chất diterpene trên đối tượng cây E. antiquorum L. chúng tôi đã chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp này. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Mô tả về chi Euphorbia Euphorbia thuộc họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae), là chi thực vật có hoa và số lượng loài của chúng vô cùng phong phú với hơn 2000 loài, đứng thứ hai chỉ sau cây họ đậu Astragalus [3]. Đặc điểm chung của các loại cây này thường có một loại mủ trắng độc hại được tiết ra khi bị cắt. Một số loài trong chúng được cho là độc hại [4]. Tuy nhiên, chúng có một lợi thế đó là có vẻ bề ngoài hấp dẫn, vì thế một số loài trong chúng được tận dụng làm cây cảnh hay nhân giống với mục đích thương mại hóa toàn cầu. Euphorbia sinh sống và phát triển chủ yếu ở sa mạc Nam Phi, các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Ấn Độ, khu vực Đông Nam Á [1]. Cây Bát Tiên (E. milii) Cây Cushion Spurge (E. polychroma) Cây Trạng Nguyên (E. pulcherrima) 1.2. Mô tả về cây E. antiquorum L. 1.2.1. Các thông tin chung Cây Xương rồng Ngọc Lân có tên khoa học là E. antiquorum L., thuộc bộ Malpighiales, họ Euphorbiaceae và chi Euphorbia. Cây nhỏ, cao khoảng 7 m, nhánh có 3 cạnh, dày khoảng từ 2 cm trở lên. Lá ở các ngọn nhánh, hình trái xoan ngược thuôn, hơi Hình 1.1. Một số loài chi Euphorbia 3 nạc, nguyên, chóp tròn, thon đầu lại thành cuống rộng, dài 13-15 cm, rộng 3-4 cm, có lá kèm thành gai, xếp 2 cái một ở các đệm. Cụm hoa thành xim nhỏ bên, ở ngọn các nhánh. Quả nhỏ có màu xanh có 3 mảnh và mang vòi nhụy. Hoa thường nở vào đầu mùa hè hằng năm (khoảng tháng 3-4) [1,5]. Cây E. antiquorum L. sinh sống chủ yếu ở các vùng nhiệt đới như Decan (Ấn Độ), Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan Đặc biệt ở nước ta, cây được trồng khá phổ biến ở khu vực miền trung và có thể thu hái thân cành quanh năm [1,5]. 1.2.2. Các nghiên cứu về dược tính Y học cổ truyền cho rằng cây Xương rồng có vị đắng, tính hàn, có độc. Mỗi bộ phận của cây sẽ có những tác dụng khác nhau như: thân cây có tác dụng chống loét, tăng cường đường huyết; lá có tác dụng giải nhiệt, giải độc; nước ép ra sữa có tác dụng điều trị ho khan, giảm đau do sưng khớp. Ngoài ra, cây Xương rồng còn có tác dụng điều trị nhiễm trùng da và các vết thương do rắn cắn [5]. Cây Xương rồng đã trở thành một trong những cây thuốc phổ biến ở nhiều quốc gia trong các khu vực khác nhau trên thế giới. Tuy nhiên, quan điểm về công dụng của cây Xương rồng là khác nhau ở mỗi quốc gia. Điển hình tại Assam đã diễn ra một cuộc nghiên Hình 1.2. Một số hình ảnh về cây E. antiquorum L. 4 cứu về dược tính cổ truyền của cây này trên đối tượng dân địa phương ở các vùng khác nhau vào năm 2008. Cây được sử dụng để điều trị các căn bệnh như giảm đau các vết đốt của côn trùng và rắn, dịch chiết từ lá cây điều trị ho và cảm cúm, nhựa cây được sử dụng để điều trị bệnh trĩ cũng như các vết nhọt, mụn độc và tăng cường khả năng lợi tiểu [6]. Ở Việt Nam, cây Xương rồng được xem là một trong những cây thuốc quý được dùng để điểu trị nhiều căn bệnh khác nhau như chữa bệnh đau dạ dày, đau lưng và đau do gai cột sống [2,3]. Y học dân gian đã có rất nhiều bài thuốc hay món ăn kết hợp với cây Xương rồng nhằm tạo thành một phương thuốc trị bệnh hiệu quả. Hiện nay, trên thế giới cũng đã công bố nhiều công trình liên quan đến dược tính của E. antiquorum L. Năm 2008, Jyothi T.M và các cộng sự đã công bố bài báo về một cuộc nghiên cứu chứng minh được cây E. antiquorum L. có khả năng bảo vệ gan và kháng oxi hóa một cách tự nhiên. Tác giả điều chế cao chiết và tiến hành khảo sát thực nghiệm và kết quả cho thấy tiềm năng điều trị bệnh vàng da ở người [7]. Cùng thời điểm trên, W.A.P.P. de Silva và cộng sự đã đưa ra kết luận rằng nhựa cây E. antiquorum L. có khả năng tiêu diệt côn trùng hiệu quả là do ông đã tiến hành thí nghiệm sử dụng cao thô trên một quần thể loài côn trùng và kết quả là trên 50% số loài này đã bị tiêu diệt [8]. Năm 2011, Wen-Tsong Hsieh và cộng sự bằng thực nghiệm đã đưa ra kết luận rằng nhựa cây E. antiquorum L. có khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư cổ tử cung ở nữ giới. Điều này đã cho thấy rằng E. antiquorum L. có tiềm năng kháng ung thư ở người [9]. Năm 2015, Varadharajan Madhavan và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu về khả năng chống tăng đường huyết được thực hiện trên chuột, và nhận ra rằng những con chuột bị đái tháo đường được điều trị bằng rễ cây E. antiquorum L. trong một thời gian thì lượng đường huyết trong cơ thể đã giảm. Hoạt tính chống tăng đường huyết của chiết xuất E. antiquorum L. được so sánh với glimepiride - thuốc hạ đường huyết thế hệ thứ hai, cho thấy rằng cây này rất có tiềm năng điều trị bệnh đái tháo đường ở người [10]. Năm 2017, Chandrasekaran Rajkuberan và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm chế tạo hạt nano bạc (EAAgNPs) thông qua sự sinh tổng hợp từ dịch được chiết xuất từ nhựa của cây E. antiquorum L. Với kích thước 10-50 nm, các hạt nano phân tán tốt trong cơ thể và 5 có khả năng hoạt động tiêu diệt mầm bệnh của các sinh vật ký sinh. Thông qua đánh giá độc tính tế bào trong ống nghiệm đã cho thấy khả năng chống lại các tế bào ung thư cổ tử cung ở người [11]. Năm 2018, Miao Dong đã cô lập một số hợp chất và đã thử nghiệm hoạt tính sinh học của chất từ E. antiquorum. Kết quả đáng ngạc nhiên, khi một trong chúng có tên là Prostratin có khả năng kháng hoạt động của các virus HIV. Điều này đã tạo một kỷ nguyên mới về dược tính của E. antiquorum [12]. 1.2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học Trên thế giới, đã có một số các công trình khoa học về thành phần hóa học của cây E. antiquorum L. Năm 1989, Min Zhi-Da và cộng sự đã cô lập được một diterpene mới tên là antiquorin (1) và hai triterpene là friedelan-3β-ol (2) và β-taraxerol (3) [13]. Cùng năm đó, Mohan B. Gewali và cộng sự đã cô lập được bốn macrocylic diterpene đó là 3,12-di-Ο- acetyl-8-O-benzoylingol (4); 3,12-di-O-acetyl-8-O-tigloylingol (5); 12-O-acetyl-8-O- tigloylingol (6) và 8-O-tigloylingol (7) [14]. Năm 1990, Mohan B. Gewali và cộng sự đã cô lập được ba triterpene là euphol 3-O-cinnamate (8), antiquol A (9) và antiquol B (10), euphol (11), 24- methylenecycloartanol (12), cycloeucalenol (13), (Z)-9-nonacosene (14), sitosterol (15), S- acetoxyphenol (16) [15]. Năm 2002, Toshihiro Akihisa và cộng sự đã cô lập một triterpene từ nhựa cây là antiquol C (17), antiquol B, euphorbol (18), lemmaphylla-7,21-dien-3β-ol (19), isohelianol (20), camelliol C (21) và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất đó trong việc ức chế virus Epstein-Barr (EBV-EA) [16]. Năm 2014, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được 18 hợp chất diterpene mới (22- 39) cùng với 4 hợp chất đã biết từ trước (40-43). Một số hợp chất được khảo sát hoạt động ức chế 1β-HSD1 (một loại enzim liên quan đến đái tháo đường loại 2) trên chuột [17]. Năm 2016, Jiang hu và cộng sự đã cô lập được ba hợp chất neolignan mới là 7S,8S- 4,9-dihydroxy-3,5,3’,9’-tetramethoxy-7-O-5’,8-O-4’-neolignan(44), 7S,8S-4,9-diacetyl- 3,3’,9’-trimethoxy-7-O-5’,8-O-4’-neolignan (45), 3’-hydroxycleomiscosin B (46) [18]. 6 Năm 2018, Miao Dong và cộng sự đã cô lập được các chất mới 24,24-dimethoxy- 25,26,27-trinoreuphan-3β-ol (47), (24S)-24-hydroperoxyeupha-8,25-dien-3β-ol (48) và khảo sát hoạt tính kháng HIV của chúng trông môi trường ống nghiệm [12]. Cùng thời điểm đó, Siritapetawee và cộng sự đã cô lập được galactose-lectin (49) và được khảo sát về hoạt tính kháng khuẩn [19]. Trong công trình nghiên cứu của Wei-Yan Qi và cộng sự đã phát hiện ra các chất quorumolides A-C (50-52) [20]. Năm 2019, Yue Liang và cộng sự đã cô lập thành công 18 diterpenoid (53-70) [21]. Cùng năm đó, Lijun An và cộng sự đã cô lập đã phân lập được thêm 12 chất (71-82) từ thân cây E. antiquorum. Một số trong các chất này được tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học chống viêm trên người [22]. Năm 2020, W. J. Yuan và cộng sự đã cô lập thêm sáu diterpenoid mới euphonoid A-F (83-88).[23] Các hợp chất tự nhiên đã được phân lập từ cây E. antiquorum L. được thống kê ở bảng dưới đây. 7 Bảng 1.1. Một số hợp chất được cô lập từ thân và nhựa của cây E. antiquorum L. Tên hợp chất Kí hiệu Tài liệu tham khảo Antiquorin 1 [13] Friedelan-3-β-ol 2 β-taraxerol 3 3,12-di-Ο-acetyl-8-O-benzoylingol 4 [14] 3,12-di-O-acetyl-8-O-tigloylingol 5 12-O-acetyl-8-O-tigloylingol 6 8-O-tigloylingol 7 Euphol 3-O-cinnamate 8 [15] Antiquol A 9 Antiquol B 10 Euphol 11 24-methylenecycloartanol 12 Cycloeucalenol 13 (Z)-9-nonacosene 14 Sitosterol 15 S-acetoxyphenol 16 Antiquol C 17 [16] Euphorbol 18 lemmaphylla-7,21-dien-3β-ol 19 Isohelianol 20 Camelliol C 21 Euphorantin A-R 22- 42 [17] 3,12-diacetyl-7-angeloyl-8-methoxyingol 43 7S,8S-4,9-dihydroxy-3,5,3’,9’-tetramethoxy-7-O-5’,8-O-4’- neolignan 44 [18] 7S,8S-4,9-diacetyl-3,3’,9’-trimethoxy-7-O-5’,8-O-4’- neolignan 45 3’-hydroxycleomiscosin B 46 24,24-dimethoxy-25,26,27-trinoreuphan-3β-ol 47 [12] (24S)-24-hydroperoxyeupha-8,25-dien-3β-ol 48 Galactose- lectin 49 [19] Quorumolides A 50 [20] 8 Quorumolides B 51 Quorumolides C 52 Antiquorpene (A-I) 53- 61 [21] (4R,5S,8S,9R,10S,13R,16S)-ent-16α,17-dihydroxy-19- butyryloxykauran-3-one 62 ent-3-oxokaurane-16α,17-diol 63 Euphopilolide 64 Eurifoloid G 65 17-hydroxyjolkinolide A 66 Andaracopimaradienolal 67 3,12-di-O-acetyl-8-O-tigloylingol 68 12-O-acetylingol 3,8-ditiglate 69 12-O-acetyl-3-O-benzoylingol 8-tiglate 70 Euphorin A-E 71- 75 [22] 3,12-O-diacetyl-7-O-[(E)-2-methyl-2-butenoyl]-8,12-diepjing-ol 76 3,12-diacetyl-8-benzoylingol 77 12-O-acetyl-8-O-benzoylingol 3-tiglate 78 ent-3,14-dioxo-16-atisane 79 ent-(3α,5β,8α,9β,10α,12α)-3-hydroxyatis-16-en-14-one 80 eurifoloid R 81 (3β,11β)-3,11-dihydroxylanosta-8,24-dien-7-one 82 Euphonoid A-F 83- 88 [23] 9 Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất hữu cơ trong cây E. antiquorum L. 10 Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất hữu cơ trong cây E. antiquorum L. (tiếp) 11 Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất hữu cơ trong cây E. antiquorum L. (tiếp) 12 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp tiến hành 2.1.1. Hóa chất - Dung môi hữu cơ: methanol, ethanol, n-hexane, ethyl acetate, chloroform, acetone. - Silica gel 0.040–0.063 mm (Merck), 60 RP-18 F254S dùng cho sắc ký cột. - Sắc ký bản mỏng loại DC–Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F254 (Merck). - Thuốc thử hiện hình sắc ký bản mỏng: dung dịch H2SO4 15% + vanilin. 2.1.2. Thiết bị - Cột sắc ký pha thường, pha đảo, sephadex LH-20 với các kích thước khác nhau. - Máy cô quay chân không; - Cân điện tử 4 số; - Đèn UV bước sóng 254 nm; - Máy cộng hưởng từ hạt nhân (Bruked Avance III) tần số 400 MHz đối với phổ 1H-NMR và 100 MHz đối với phổ 13C-NMR tại viện kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM. - Máy đo phổ khối Bruker MicroTOF Q-II tại viện công nghệ Hóa học Tp.HCM. 2.1.3. Phương pháp tiến hành - Cao EA thô được điều chế bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexane, n-hexane:ethyl acetate (1:1), ethyl acetate. - Để phân lập các hợp chất trong cao EA, sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột (pha thường, pha đảo, sephadex LH-20). - Dự đoán cấu trúc của các hợp chất cô lập được bằng khối phổ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, MS được hòa tan trong dung môi CD3OD (Methanol-d4 với các peak dung môi δH 4.87 và δC 49.00). 13 2.2. Nguyên liệu Toàn bộ cây E. antiquorum L. được thu hái từ tỉnh Bình Thuận, Việt Nam vào tháng 6 năm 2019. Sau đó, mẫu cây được bảo quản và vận chuyển về phòng nghiên cứu hợp chất tự nhiên, Khoa Hoá học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu cây được định danh là E. antiquorum bởi TS. Phạm Văn Ngọt, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. 2.3. Điều chế cao ethyl acetate Các bộ phận của cây Xương rồng có khối lượng 6 kg được thái nhỏ, phơi khô sau đó ngâm trong ethanol ở nhiệt độ phòng một thời gian thu được cao tổng. Lần lượt tiến hành chiết lỏng-lỏng trong Hx, Hx:EA (1:1), EA. Phần dung dịch chiết được từ EA đem lọc và được cô quay chân không, thu được 180.7 gam cao EA. 2.4. Phân lập hợp chất TH1 và TH2 trong cao EA Thực hiện sắc ký cột cao EA (180.7 g) thu được ở trên với hệ dung môi giải ly là Hx:EA (1:2) thu được năm phân đoạn (A-E). Phân đoạn B và C tiếp tục được khảo sát để phân lập các chất. Thực hiện sắc ký gel Sephadex LH-20 phân đoạn B (5.6 g) với dung môi giải ly là C:Me (1:3) thu được sáu phân đoạn (B1-B6). Tiến hành phân tách các chất trong B3 (2.31 g) bằng sắc ký cột sử dụng hệ dung môi giải ly Hx:C:EA:A:Me:H2O (170:10:70:20:1:0.1) thu được năm phân đoạn (B6A-B6E). Tiến hành sắc ký pha đảo phân đoạn B3B (300 mg) với hệ dung môi giải ly Me:H2O (1:3) thu được hợp chất TH1 (3.7 mg). Thực hiện sắc ký gel Sephadex LH-20 với dung môi giải ly là methanol đối với phân đoạn C (20.3 g) thu được năm phân đoạn (C1-C5). Tiến hành chạy sắc ký phân đoạn C1 (0.334 g) với dung môi giải ly là Hx:EA (1:1.5), thu được bốn phân đoạn (C1A-C1D). Thực hiện sắc ký pha đảo phân đoạn C1D (50 mg) với dung môi giải ly Me:H2O (2:1) thu được hợp chất TH2 (3.8 mg). 14 Hình 2.1. Một số hình ảnh trong quá trình phân lập các chất từ cao EA của E. antiquorum L. 15 Sơ đồ 1. Quy trình cô lập chất từ cao EA của cây E. antiquorum L. Cao EA thô (180.7g) A (41.1 g) B (5.6 g) B1 (523 mg) B2 (426 mg) B3 (2.31 g) B3A (148 mg) B3B (300 mg) TH1 (3.7 mg) SKC pha đảo Me:H2O (1:3) B3C (201 mg) B3D (605 mg) B3E (333 mg) SKC Hx:C:EA:A:Me:H2O (170:10:70:20:1:0.1) B4 (238 mg) B5 (243 mg) B6 (156 mg) Sephadex LH-20 C:Me (1:3) C (20.3 g) C1 (334 mg) C1A (47 mg) C1B (94 mg) C1C (33 mg) C1D (50 mg) TH2 (3.8 mg) SKC pha đảo Me: H2O (2:1) SKC Hx:EA (1:1,5) C2 (1.45 g) C3 (4.18 g) C4 (6.20 g) C5 (1.97 g) Sephadex LH-20 Me (100%) D (12.3 g) E (40.8 g) SKC Hx:EA (1:2) 22 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Đề tài “Cô lập một số hợp chất diterpene từ phân đoạn cao ethyl acetate của cây Euphorbia antiquorum L.” thu được các kết quả sau: Sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng kết hợp với các kỹ thuật sắc ký cột cao EA đã cô lập được hai chất có kí hiệu như sau: TH1 (từ phân đoạn B3B) và TH2 (từ phân đoạn C1D). Sử dụng phương pháp phổ nghiệm và đối chiếu với các tài liệu tham khảo có liên quan đã đưa ra cấu trúc đề nghị của các hợp chất như sau: Hình 4.1. Cấu trúc hóa học các chất đã được cô lập Trong đó, hợp chất TH1 là hợp chất tự nhiên mới lập thể và hợp chất TH2 là hợp chất tự nhiên mới. 4.2. Kiến nghị Trong phạm vi của khóa luận này chỉ cô lập được hai chất trong cao EA của cây E. antiquorum L. Trong tương lai nếu có đầy đủ điều kiện và sự thuận lợi sẽ tiếp tục khảo sát các phân đoạn khác của cao EA và tiến hành kiểm tra hoạt tính sinh học của chúng với hy vọng tìm ra những hợp chất mới có giá trị y học nhằm đóng góp một phần vào kho tàng kiến thức của nhân loại. 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam - T.1. Nhà xuất bản trẻ: Hà Nội, 1999. [2] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học: Hà Nội, 2004. TÀI LIỆU TRANG WEB [3] (2019, Aug 20). Euphorbia PBI - Project Description [Online]. Available: TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI [4] G. L. Stebbins, and R. D. Hoogland, “Species diversity, ecology and evolution in a primitive Angiosperm genus: Hibbertia (Dilleniaceae), ” Plant Syst. Evol, 1976, 125 (3): 139–154. [5] A. Kumar, and D. Saikia, “Euphorbia Antiquorum Linn: A Comprehensive Review of Ethnobotany, Phytochemistry and Pharmacology, ” J Anal Pharm Res, 2016, 2 (4): 2–6. [6] P. Deka, K. K. Nath, and S. K. Borthakur, “Ethoiatrical uses of Euphorbia antiquorum L. and E. ligularia Roxb. in Assam, ” Indian J. Tradit. Knowl, 2008, 7 (3): 466–468. [7] P. Mag, T. M. Jyothi, K. Prabhu, J. E. L. S, and R. S. S, “PHCOG MAG: Research Article Hepatoprotective and antioxidant activity of Euphorbia antiquorum,” 2008; 4(13): 127–133. [8] W. A. P. P. de Silva, G. K. Manuweera, and S. H. P. P. Karunaratne, “Insecticidal activity of Euphorbia antiquorum L. latex and its preliminary chemical analysis,” J. Natl. Sci. Found. Sri Lanka, 2008; 36(1): 15–23. [9] W. T. Hsieh, H. Y. Lin, J. H. Chen, Y. H. Kuo, M. J. Fan, R. S. C. Wu, K. C. Wu , W. G. Wood, and J. G. Chung, “Latex of euphorbia antiquorum induces apoptosis in human cervical cancer cells via c-Jun N-terminal kinase activation and reactive oxygen species production,” Nutr. Cancer, 2011; 63(8): 1339–1347. [10] V. Madhavan, A. Murali, D. Lalitha, and S. Yoganarasimhan, “Studies on 24 antihyperglycemic effect of Euphorbia antiquorum L. root in diabetic rats,” J. Intercult. Ethnopharmacol, 2015; 4(4): 308–313. [11] C. Rajkuberan, S. Prabukumar, G. Sathishkumar, A. Wilson, K. Ravindran, and S. Sivaramakrishnan, “Facile synthesis of silver nanoparticles using Euphorbia antiquorum L. latex extract and evaluation of their biomedical perspectives as anticancer agents,” J. Saudi Chem. Soc., 2017; 21(8):