Khóa luận Công nghệ nuôi cấy tế bào sâm Ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

như cây, lá, hoa, cành cần rửa sạch bằng xà bông dưới vòi nước nhiều lần để hạn chế sự tạp nhiễm. Sử dụng các chất có hoạt tính diệt khuẩn như cồn chlorua, nước javen,... Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy. Môi trường: Môi trường thuờng được hấp khử trùng ở 121 oC, 1atm trong 30 phút. Có một số chất trong môi trường nuôi cấy không bền nhiệt (vitamin, kháng sinh,..), những chất này được lọc vô trùng sau đó được thêm vào môi trường sau khi đã được hấp, làm nguội đến khi cầm trên tay được. 2.1.5.2. Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm. Tuỳ thuộc vào từng loại nuôi cấy sẽ có một môi trường tối ưu. Thông thường ta phải trải qua quá trình thực nghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi. Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor. Nhiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone,..không bền nhiệt vì vậy nên dùng phin lọc micropore để khử trùng. Ø Có 3 nguồn nhiễm tạp chính: Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối. Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy. Trong quá trình thao tác. Bảng 2.1: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C. Thể tích môi trường (ml) Thời gian tối thiểu (phút) 20-25 24 50 26 100 28.5 250 31.5 500 35 1000 40 2000 48 3000 55 4000 63 2.1.5.3. Chọn mô cấy và xử lý đúng cách Tuỳ mục đích nuôi cấy để chọn loại mô cấy thích hợp. Thông thường các mô trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy, trừ những mô đã hoá gỗ. Khi bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Nguồn lấy mẫu, vị trí lấy mẫu cấy từ cây mẹ là những yếu tố quan trọng trong việc thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Lấy mẫu vào mùa xuân khi cây đâm lộc, các chồi mới nhú sạch hơn so với các chồi ngủ. Cây trồng ngoài ruộng dễ bị nhiễm hơn cây trồng trong nhà kính hoặc chậu trong phòng. Các phần như rễ, củ hoặc gần như nằm trên mặt đất như thân bò, dạng củ, protocom của lan thì khó làm sạch hơn các nguyên liệu thực vật khác. Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rảnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm. Để loại bỏ sự tạp nhiễm bề mặt, có thể rửa sơ bộ mô cấy với nước xà phòng để loại bỏ bụi, đất và làm tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng. Để làm tăng sự khử trùng có thể dùng chất hỗ trợ làm tăng sự tiếp xúc như Tween - 20, xà phòng. Thường dùng 1 - 3 giọt Tween cho 100 ml dung dịch nước khử trùng là tốt nhất. Ngoài ra để tăng sự tiếp xúc bằng cách lắc hoặc khuấy đều mẫu cấy trong lúc đang khử trùng. Ø Qui trình khử trùng bề mặt: Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịnh khử trùng. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10-30 phút. Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng. Bỏ dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng. Bảng 2.2: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật: Stt Chất khử trùng Nồng độ Thời gian khử trùng (phút) Hiệu quả 1 Hypochlorite calcium 9-10% 5-30 Rất tốt 2 Hypochlorite sodium 0,5-5% 5-30 Rất tốt 3 Nước bromine 1-2% 2-10 Rất tốt 4 Oxy già 3-12% 5-15 Tốt 5 Chlorua thủy ngân 0,1-1% 2-10 Tốt 6 Nitrate bạc 1% 5-30 Tốt 7 Kháng sinh 4-50mg/l 30-60 khá 2.2. Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh 2.2.1. Phân loại Ø Lịch sử phân loại: Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm. Nhưng chỉ có bốn loài Sâm thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax gingseng C. A. Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây thuốc quý. Năm 1968, KS. Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5. Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của Ban dân y Khu 5 do DS. Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là Sâm Đốt Trúc với tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae) (Nguyễn Minh Đức, 2003). Tên khoa học của cây được công nhận là Panax vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm Araliaceae, công bố tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt tên (internet 4). Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên Ø Phân loại: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Bộ: Apiales Họ: Cam Tùng (Araliaceae) Chi: Panax Loài: Panax Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng). Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng. Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh 2.2.2. Đặc điểm hình thái Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m. Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất. Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vàm ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến. Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 m mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường. Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2 - 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ. Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Hoa nhiều màu lục vàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân. Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy. Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt. Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9. Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh 2.2.3. Sinh thái và phân bố Ø Đặc điểm sinh thái: Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng. Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ khoảng 15-18 0C, lượng mưa khoảng 3000 mm/ năm. Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước. Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa hoa quả từ tháng 5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau, Sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt. Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ. Mỗi năm từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá. Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm. Ø Đặc điểm phân bố: Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào 1973. Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học. Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’ – 108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi. 2.2.4. Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh Cây có vùng phân bố rất hẹp và mọc rất rải rác. Do là loài Sâm quí hiếm nên số lượng cá thể giảm sút nhanh chóng, hiện đang nằm trong 250 loài quí hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện Sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ. Để bảo vệ và phát triển cây dược liệu quí hiếm, hiện đã có những dự án để duy trì và bảo tồn giống tại hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum: Năm 1979: Uỷ Ban Nhân Dân Tỉnh Quảng Nam đã cho thành lập Trại dược liệu Trà Linh. Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, Trại dược liệu đã có 223.000 cây con. Trại đã xây dựng quy trình trồng cây Sâm Ngọc Linh và phổ biến cho nhân dân trong vùng thực hiện. Năm 1995: Sở Khoa học, Công nghệ và Môi trường tỉnh Quảng Nam đã đầu tư nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhằm bảo vệ và phát triển cây Sâm Ngọc Linh. Nhằm hình thành vùng nguyên liệu Sâm Ngọc Linh và đưa cây Sâm trở thành loại cây trồng mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân trong vùng dự án, Sở đã chủ trì thực hiện dự án “Ứng dụng kỹ thuật tiến bộ xây dựng mô hình phát triển vùng nguyên liệu sâm khu Năm tại xã Trà Linh”. Năm 2003: Viện Dược liệu Hà Nội phối hợp với Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường Kon Tum thực hiện dự án vùng trồng cây Sâm Ngọc Linh. Cây Sâm đã được nhân giống trong năm 2003 và trồng tập trung ở xã Ngọc Lay, huyện Đắk Tô. Năng suất hàng năm ước tính khoảng 50.000 cây. Mục đích của dự án là quy hoạch vùng có điều kiện thích hợp cho cây sâm Ngọc Linh phát triển và tìm ra phương pháp canh tác thích hợp nhất nhằm bảo tồn loài cây đặc hữu của vùng và giúp xóa đói giảm nghèo ở Kon Tum. Sâm Ngọc Linh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới. Trong đó bước đầu tiên là hiện đại hóa việc canh tác. Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến có thể ứng dụng tốt cho sản xuất sản phẩm Sâm Ngọc Linh. 2.2.5. Thành phần hóa học 2.2.5.1. Hợp chất saponin: Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Việt Nam cũng như của các loài Sâm khác trên thế giới. Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 49 hợp chất saponin, gồm 25 saponin đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1-R24. Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8. Bảng 2.3: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ( Đã trừ độ ẩm): Nguyên liệu Hàm lượng saponin chính (%) G-Rb1 GRd G-Ry1 R2 Tổng cộng Đầu mầm 0.943 0.898 1.359 2.859 6.059 Sâm 2 tuổi 0.979 0.426 1.235 1.868 4.236 Sâm 3 tuổi 0.846 0.678 1.419 2.409 5.352 Rễ củ 4 tuổi 0.818 0.396 1.696 3.141 6.051 Rễ củ 5 tuổi 1.721 0.518 2.219 3.816 8.674 Rễ củ 6 tuổi 1.824 0.632 2.285 4.166 9.474 Thân rễ 4 tuổi 1.518 1.778 2.432 2.946 8.674 Thân rễ 5 tuổi 1.565 0.981 1.652 4.276 8.494 Thân rễ 6 tuổi 2.716 0.840 3.648 5.342 12.546 Bảng 2.4: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp. trồng trọt: Loại aglycon Panax ginseng Panax notoginseng Panax quinquefolius Panax vietnamensis 20(S)–ppd 2.9 2.1 2.7 3.1 20(S)–ppt 0.6 2.4 1.2 2.0 Ocotillol – – 0.04 5.6 Oleanolic acid 0.02 – 0.07 0.09 Hiệu suất toàn phần (%) 3.5 4.5 4.0 10.8 ( Ghi chú: 20(S)-ppd: 20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol) Bảng 2.5: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol: Tên Kiểu R1 R2 R3 Hiệu suất (%) G-ReI (I) -H- -Glc2-Rha -Glc- 0.17 20-glc-G-Rf (I) -H- -Glc2-Glc -Glc- 0.01 G-Rg1* (I) -H- -Glc2-Glc -Glc- 1.37 G-Rh1 (I) -H- -Glc- -H- 0.008 N-R1* (I) -H- -Glc2-Xyl -Glc- 0.36 N-R6 (I) -H- -Glc- -Glc6- 0.01 G-R4 (I) -Glc2-Glc -H- -Glc- 0.004 G-R12 (K) -H- -Glc- -H- 0.005 G-R15 (J) -H- -Glc- -Glc- 0.003 G-R17 (K) -H- -Glc- -Glc- 0.002 G-R18 (K) -H- -Glc- -Glc- 0.002 G-R19 (L) -Glc2-Glc -H- -Glc- 0.006 Bảng 2.6: Acid Oleanolic: Tên Kiểu R1 R2 Hiệu suất (%) G-R0 (O) -Glc2-Glc -Glc- 0.038 H-Ma (O) -Glc2-Glc-Ara(p) -Glc- 0.05 Bảng 2.7: Ocotillol: Tên Kiểu R1 R2 Hiệu suất (%) PG-RT4 (M) -Glc- -CH3 0.065 24(s)-PG-F11 (M) -Glc2-Rha -CH3 0.005 M-R1* (M) -Glc2-Glc -CH3 0.14 M-R2* (M) -Glc2-Xyl -CH3 5.29 G-R1 (M) -Glc2-Rha-Ac6 -CH3 0.033 G-R2 (M) -Glc2-Xyl-Ac4 -CH3 0.014 G-R6 (M) Glc -CH3 0.006 G-R14 (M) -Glc2-Xyl -CH2OH 0.02 G-R10 (N) -Glc- -CH3 0.007 2.2.5.2. Hợp chất polyacetylen Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chính yếu. Hai hợp chất mới là 10 acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4-6-diyn-3,10-diol. 2.2.5.3. Thành phần acid béo Bảng 2.8: Các axid béo được tìm thấy: STT Số Carbon của hợp chất % Tên 1 8 C Vết 2 10 C Vết 3 11 C Vết 4 12 C 0.22 5 13 C 0.31 6 14 C 1.33 7 15 C 0.40 8 15 C1= 0.31 9 16 C 29.12 Acid palmitic 10 16 C1= Vết 11 17 C 1.13 12 17 C1= Vết 13 18 C 4.48 Acid stearic 14 18 C1= 13.26 Acid oleic 15 18 C2= 40.04 Acid linoleic 16 18 C3= 2.61 Acid linolenic 17 20 C 1.51 2.2.5.4. Thành phần acid amin Bảng 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu: STT Acid amin Acid amin (%) Acid amin thủy giải (%) 1 Tryptophan 10.20 - 2 Lysin 17.90 5.29 3 Histidin 1.02 2.59 4 Arginin 46.66 12.90 5 Acic aspartic 7.60 10.38 6 Threonin 1.20 5.19 7 Serin 5.12 5.19 8 Acid glutamic 2.05 6.49 9 Prolin 3.07 15.58 10 Glycin 4.10 5.19 11 Alanin - 5.19 12 Cystin 1.53 Vết 13 Valin 0.51 1.29 14 Methionin 0.51 Vết 15 Isoleucin 1.02 2.59 16 Leucin 1.02 5.19 17 Tyrosin 0.51 6.49 18 Phenylanin 0.51 6.49 2.2.5.5. Các nguyên tố vi lượng Bảng 2.10: Các nguyên tố vi lượng: STT Nguyên tố vi lượng Hàm lượng (ppm) 1 K 9349.19 2 Ca 2844.74 3 Mg 1950.19 4 Fe 491.21 5 Sr 169.87 6 Ti 120.65 7 B 140.00 8 Rb 91.62 9 Mn 68.10 10 Zn 26.11 11 Br 17.27 12 Ni 10.61 13 Cu 6.23 14 Cr 4.10 15 Y 1.51 16 I 0.24 17 Co 0.15 18 As 0.10 19 Se 0.05 20 Hg 0.04 2.2.5.6. Các thành phần khác Hợp chất Sterol: β-Sitosterol và daucosterin (β- Sitosteryl-3-o- β-D-glucopyranosid). Hợp chất glucid: Đường tự do: 6.19% Đường toàn phần: 26.77% Tinh dầu: 0.05- 0.10% Sinh tố C: 0.059% 2.2.5.7. Tác dụng dược lý- Lâm sàng Sâm Ngọc Linh được các dân tộc thiểu số cũng như giới khoa học biết đến với nhiều công dụng hữu ích đối với sức khỏe. Tác dụng trên hệ thần kinh: làm gia tăng sự vận động tự nhiên, trí thông minh và sự nhanh nhẹn khéo léo. Tăng sinh lực: cải thiện tình trạng suy nhược của cơ thể chống mệt mỏi. Chống trầm cảm. Chống oxy hóa. Tác dụng trên hệ miễn dịch: kháng viêm, giảm đau. Hồi phục máu. Các dược lý khác: tăng cường nội tiết tố, hạ đường huyết, điều hòa hoạt động của tim, bảo vệ gan, ức chế vi khuẩn phát triển,… Ø Về tác động lâm sàng: Các kết quả cho biết các bệnh nhân đều có sự tăng trọng, các chế phẩm đều giúp bệnh nhân ăn ngon, ngủ tốt, tăng cường thể trạng, giảm mệt mỏi, không thể hiện độc tính trong suốt thời gian sử dụng. CHƯƠNG III. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 3.1. Nuôi cấy mô sẹo (Dương Tấn Nhựt và cs) 3.1.1. Nguyên liệu: Các mẫu lá và cuống lá. 3.1.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra còn bổ sung: 1.0 mg/l 2,4-D và 0.2 mg/l TDZ. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5.8. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm. 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun. 3.1.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel. Dung dịch xà phòng loãng. 3.1.5. Qui trình thực hiện Chọn mẫu. Cắt mẫu lá có kích thước khoảng 1.0*1.0 cm. Cuống lá bổ dọc và cắt đoạn khoảng 1.0 cm. Rửa nhẹ mẫu bằng bông tẩm nước Javel. Rửa sạch sơ bộ mẫu bằng nước. Lắc mẫu trong cồn 700/ 30 giây. Rửa bằng nước cất 4-5 lần. Lắc mẫu trong dung dịch HgCl2 0.1 % có nhỏ vài giọt Tween-20 trong 5 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 5-6 lần. Khử trùng dụng cụ. Đặt mẫu vào môi trường Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi. 3.1.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75 - 80 %. Hình 3.1: Mô sẹo Sâm Ngọc Linh 3.2. Tái sinh chồi từ mô sẹo (Dương Tấn Nhựt và cs) 3.2.1. Nguyên liệu: Các mô sẹo đã hình thành. 3.2.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra còn bổ sung: 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA và 50 g/l sucrose và 5.0 g/l than hoạt tính. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5.8. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm. 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun. 3.2.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel 3.2.5. Qui trình thực hiện Khử trùng dụng cụ. Cắt nhỏ mô sẹo khoảng 0.5*0.5 cm đặt vào môi trường. Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi. 3.2.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75- 80 %. Hình 3.2: Chồi Sâm Ngọc Linh 3.3. Nuôi cấy rễ (Dương Tấn Nhựt và cs) 3.3.1. Nguyên liệu: Sử dụng các mô sẹo đã hình thành. 3.3.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra còn bổ sung: 3.0 mg/l NNA. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5.8. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm. 3.3.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun. 3.3.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel. 3.3.5. Qui trình thực hiện Khử trùng dụng cụ. Cắt nhỏ mô sẹo khoảng 0.5*0.5 cm đặt vào môi trường. Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi. 3.3.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2500- 3000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75- 80 %. Hình 3.3: Rễ Sâm Ngọc Linh 3.4. Nuôi cấy sinh khối (Dương Tấn Nhựt và cs) 3.4.1. Nguyên liệu: Các mô sẹo đã hình thành 3.4.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra bổ sung 1.0 mg/l 2.4 D và 0.2 mg/l TDZ. 3.4.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lắc để nuôi cấy gồm hệ thống bình tam giác 250 – 300 ml, hay các hệ thống nuôi cấy bioreactor, máy lắc, máy lạnh, đèn chiếu sáng. Phòng thu, tách chiết hoạt chất. 3.4.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel. 3.4.5. Qui trình thực hiện: Cắt nhỏ các mô sẹo Cho vào môi trường. Đậy nắp chai, bao giấy. Ghi ngày tháng, tên môi trường, giống. Đem đi lắc lỏng (3 tháng). Sau thời gian này ta thấy khối lượng tế bào được nhân lên rất nhiều và có thể đem đi lọc để lấy tế bào nhằm thu sinh khối hay nhân sinh khối. 3.4.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2.500- 3.000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75- 80 %. Thời gian lắc lỏng: 3 tháng. Số vòng: 100 – 120 vòng/ phút. Hình 3.4: Nuôi cấy trong Bioreactor 3.5. Tái sinh cây qua con đường tạo phôi soma (Nguyễn Ngọc Dung) 3.5.1. Nguyên liệu: Các mẫu lá non hay đầu mẫu thân, rễ. 3.5.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp với từng giai đoạn phát triển. 3.5.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun. 3.5.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel. 3.5.5. Qui trình thực hiện: Xử lý mẫu sơ bộ. Cắt mẫu. Vô trùng mẫu. Đặt mẫu vào môi trường cảm ứng mô sẹo có bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D và 0.2 mg/l TDZ. Chuyển sang môi trường có mặt 2 ppm 2iP và 1.5 ppm NAA. Để phôi tiếp tục phát triển, cấy chuyển qua môi trường chứa 0.2-1 ppm gibberellin và BA. Tạo cây con hoàn chỉnh có rễ trên môi trường có mặt 2 ppm IBA và 0.5 ppm kinetin ở nồng độ thấp. 3.5.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux. Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75- 80 %. Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm Ngọc Linh 3.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất khử trùng: Đối với Sâm Ngọc Linh bộ phận thí nghiệm là đầu (mầm, thân, rễ). Chọn chồi mọc thẳng