Khóa luận Công nghệ sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành

và các chất hữu cơ khác không được quá 500 – 600 mg/l. Lượng vi sinh vật không được quá 20 – 100 con/ml nước. Đặt biệt không có vi sinh vật gây bệnh. 1.3.3 Phụ gia Nước màu Nước màu có tác dụng làm cho nước mắm được dịu ngọt, màu vàng đẹp. Cách làm nước màu: nấu đường đến độ ngả màu cánh gián, thử vào nước lã thấy vón cục là được, dùng vải lọc để lọc lấy nước màu và phối chế vào nước mắm. Quả thơm Dùng quả thơm chín cho vào quá trình ủ nước mắm để cho nước mắm sau này có hương thơm. Bảng 1.15 Chỉ tiêu của nước sử dụng trong thực phẩm Các chỉ tiêu Tiêu chuẩn Các chỉ tiêu lý và hóa học Mùi vị Không có mùi lạ Màu sắc Trong suốt 15mg/l Pt Độ đục 5 mg/l pH 6.0 – 8.0 Hàm lượng oxy hòa tan, tính theo oxy 6 mg/l Độ cứng, tính theo CaCO3 300 mg/l Tồng chất rắn hòa tan 1000 mg/l Hàm lượng ammoniac, tính theo nitơ 3 mg/l Hàm lượng hydrosunfua 0,05 mg/l Hàm lượng sắt tổng số (Fe2+ và Fe3+) 0,5 mg/l Hàm lượng mangan 0,5 mg/l Hàm lượng nhôm 0,5 mg/l Hàm lượng cyanua 0,07 mg/l Hàm lượng clorua 250 mg/l Hàm lượng nitrit, tính theo nitơ 1 mg/l Hàm lượng nitrat, tính theo nitơ 10 mg/l Hàm lượng chì 0,01 mg/l Hàm lượng asen 0,01 mg/l Hàm lượng đồng 1 mg/l Hàm lượng kẽm 3 mg/l Hàm lượng thuốc trừ sâu phân hữu cơ 0,01 mg/l Hàm lượng thuốc trừ sâu clo hữu cơ 0,1 mg/l Chỉ tiêu vi sinh vật Tồng số vi sinh vật hiếu khí 100 tế bào/cm3 Coliform tổng 2,2 MPN/100ml E.coli và coliform chịu nhiệt Không được có Vi sinh vật gây bệnh khác Không được có 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Lên men là dùng enzyme của vi khuẩn để thủy phân protein trong đậu nành và tinh bột trong gạo nếp thành nước mắm. Điều khác biệt giữa sự lên men và thối rữa là sau khi lên men xong không sinh ra mùi thối. Lên men cũng là một giai đoạn quan trọng, nếu xử lý nguyên liệu tốt, nuôi vi khuẩn đúng kỹ thuật mà lên men không đảm bảo thì nước mắm vẫn không đạt yêu cầu, hiệu suất không cao. Ba yếu tố ảnh hưởng quan trọng trong việc lên men là: nhiệt độ lên men, thời gian lên men và lượng nước cho vào nguyên liệu khi lên men. 1.4.1 Lượng nước cho vào trong quá trình lên men Lượng nước cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình thủy phân sẽ xảy ra nhanh hơn. Theo kinh nghiệm của các xí nghiệp sản xuất nước chấm cho thấy lượng nước cho vào quá trình thủy phân tốt nhất là 30 – 40 % so với nguyên liệu, khi cho nước vào nên cho 5 – 10 % muối NaCl và duy trì ở nhiệt độ thủy phân thích hợp trong suốt thời gian lên men. Để tính lượng nước cần thiết cho quá trình thủy phân, ta sử dụng công thức sau: W = (A*B) – C Trong đó: W: Lượng nước cần cho vào A: Khối lượng vi khuẩn không nước B: % khối lượng nước trộn vào C: Hàm lượng nước của vi khuẩn Ảnh hưởng của nước đến tốc độ của các quá trình thủy phân trong sản phẩm nước mắm được quyết định bởi các yếu tố sau: Sự phân bố của các chất tham gia phản ứng ở trong sản phẩm. Độ linh động của cơ chất do trạng thái tập hợp và cấu trúc sản phẩm quyết định. Hoạt độ nước 1.4.2 Nhiệt độ khi lên men Nhiệt độ lên men hết sức quan trọng vì nó tạo điều kiện cho enzyme của vi khuẩn xúc tác cho các quá trình thủy phân protein và tinh bột thành đường, các amino acid,... Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ nhất định. Do đó ta cần tạo một điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh trưởng. Trong quá trình chế biến, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng của các enzyme sẽ tăng. Nếu nhiệt độ tăng cao quá thì sẽ ức chế sự hoạt động của enzyme và quá trình thủy phân sẽ giảm, đồng thời làm cho sản phẩm có mùi khét, đắng. Nếu nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gian lên men, sản phẩm có màu nhạt và năng suất sản phẩm không cao. Nhiệt độ thích hợp cho các enzyme của vi khuẩn hoạt động là khoảng từ 37-500C. 1.4.3 Thời gian lên men Tùy theo lượng nước trộn vào và điều kiện nhiệt độ khi lên men mà thời gian lên men dài hay ngắn. Chúng ta cũng có thể căn cứ vào sự tăng giảm của N formol để quyết thời gian lên men. Sau khi thủy phân xong, căn cứ vào hàm lượng nước trong dịch thủy phân để tính hàm lượng muối và nước muối bổ sung vào cho đạt nồng độ quy định và số lượng nước chấm cần thiết lấy ra. 1.4.4 Ảnh hưởng của pH Mỗi hệ enzyme có pH tối thiểu khác nhau. Vì vậy phải xem loại enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất nước chấm, ta phải tạo độ pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động. Qua thực nghiệm cho thấy, pH = 4 – 5 thích hợp cho quá trình lên men. Đồng thời, ở pH này còn có tác dụng ức chế vi khuẩn gây thối phát triển. CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Các phương pháp xác định hình thái vi khuẩn 2.1.1 Nhuộm Gram Nguyên tắc dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và Iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram dương. Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có loại phức chất này thuộc Gram âm. Cách tiến hành : - Làm tiêu bản : Dùng que cấy lấy nước cất vô trùng làm vết bôi lên phiến kính (lấy một ít khuẩn lạc làm vết bôi). Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định trên ngọn lửa đèn cồn. - Nhuộm tiêu bản : Nhuộm tím kết tinh lên vết bôi để yên trong 1 phút. Sau đó rửa nước và thấm khô à nhuộm lugol trong 1 phút. Sau đó rửa nước và thấm khô à rửa vết bôi bằng cồn 96 trong 30 giây, rửa nước thấm khô à nhuộm với Fucshin trong 30 giây, rửa nước thấm khô vết bôi à quan sát dưới kính hiển vi ổ vật kính 100x Đọc kết quả : Tế bào bắt màu hồng (Gram âm). Tế bào bắt mảu tím (Gram dương). 2.1.2 Nhuộm bào tử Sự hình thành bào tử là một hình thức đổi mới tế bào khi gặp những điều kiện bất lợi trong chu trình sống (nhiệt độ, áp suất, pH…).Nguyên tắc nhuộm dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid). Trước hết xử lý để tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Sau đó tẩy màu tế bào chất của tế bào đi và nhuộm nó bằng một thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó, tế bào chất của bào từ và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Phương pháp nhuộm như sau: Làm vết bôi và cố định vết bôi tương tự như phương pháp nhuộm Gram đã trình bày ở trên. Sau đó nhuộm vết bôi bằng malachite trong vòng 10 phút, rửa nước và thấm khô à nhuộm vết bôi bằng Fucshin trong 30 giây, rửa nước thấm khô à quan sát dưới kính hiển vi. Đọc kết quả : Tế bào bắt màu hồng còn bào tử bắt màu xanh lục. 2.1.3 Nhuộm vỏ nhày Các bước tiến hành như sau : - Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính - Lấy một ít khuẩn lạc trộn đều tím kết tính đã có sẵn trên phiến kính, dàn đều vết bôi, nhuộm trong vòng 5 – 7 phút à rửa vết bôi bằng dung dịch CuSO4 20%, rửa nước thấm khô à quan sát dưới kính hiển vi Đọc kết quả: Tế bào có màu sẫm còn vỏ nhày có màu nhạt ở xung quanh. 2.2 Các phản ứng sinh hóa xác định vi sinh vật 2.2.1 Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc của thử nghiệm này nhằm xác định hiện diện của enzyme catalase của vi sinh vật. Cơ sở sinh hóa như sau: enzyme catalase hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí có hệ thống cytochrom. Những vi sinh vật kỵ khí như Clostridium có hệ thống peroxydase thay cho enzyme catalase. Tuy thế enzyme catalase hoạt động không chuyên biệt và chúng có thể can thiệp vào hoạt động của enzyme peroxidase. Phương pháp tiến hành thử nghiệm: Hóa chất sử dụng là H2O2 30%. Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối đặt lên lame, nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật, hoặc có thể thử trong ống thạch nghiêng và đĩa petri môi trường đặc, tương tự nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên sinh khối của vi sinh vật. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí, thử nghiệm (-) là không có hiện tượng sủi bọt. 2.2.2 Thử nghiệm khả năng sinh Indol Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của vi khuẩn có thể tạo Indol trong môi trường trypton. Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic, từ đó indol được hình thành thông qua quá trình khử amin, hình thành skatol (metyl indol) là quá trình khử carboxyl cùa acid indol acetic. Enzyme tryptophan xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng giữa phân từ này với thuốc thử chứa p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB). Nhân pyrrol của indol chứa nhóm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ. Cơ sở sinh hóa của thử nghiệm như sau: Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo ra sản phẩm chứa gốc indol. Phương pháp tiến hành: Vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường canh trypton trong khoảng 24 - 48 giờ, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s hoặc thuốc thử Erhlich, quan sát màu vài phút. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ cánh sen. Thử nghiệm (-) khi trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ. 2.2.3 Thử nghiệm Metyl Red Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bên trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hóa :thử nghiệm Metyl red dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là metyl red để nhận biết lượng ion H+ có trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Hàm lượng hai chất này lại tùy thuộc vào con đường chuyển hóa của từng loại vi sinh vật. Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, các vi sinh vật này đều tạo acid trong môi trường khi chúng bắt đầu phát triển. Đối với các vi sinh vật cho phản ứng Metyl red âm tính thì ngay ban đầu một lượng acid hình thành trong môi trường nhưng kéo dài thời gian nuôi cấy à chuyển hóa các sản phẩm acid này thành acetoin do đó làm pH môi trường trung tính. Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường MRPV, ủ trong khoảng 2 – 5 ngày, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử metyl red được pha theo tỷ lệ 0.1g trong 300ml cồn và cho vào nước định mức 500ml. Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Thử nghiệm (-) khi môi trường không đổi màu. 2.2.4 Thử nghiệm Voges-Proskauer Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetoin trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hóa: Thử nghiệm này nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đó có thể chia vi sinh vật thành 2 nhóm theo con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau : nhóm trao đổi không tạo thành 2,3-butanediol như E.coli à thử nghiệm (-) ; và nhóm tạo 2,3-butanediol như Klebsiella à thử nghiệm (+). Tuy nhiên thử nghiệm này nhằm xác định acetoin – tiền chất của 2,3-butanediol, vì là tiền chất nên quá trình nuôi cấy tích lũy rất ít, để dễ dàng phát hiện quá trình nuôi cấy thử nghiệm được tiến hành trong điều kiện hiếu khí, sau đó phát hiện acetoin trong môi trường bằng thuốc thử α-naphtol trong môi trường kiềm mạnh được tạo ra bằng KOH 40%. Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường MRPV ủ ở nhiệt độ 370C trong 2 – 5 ngày, sau đó nhỏ 2 giọt KOH 40% và 6 giọt α-naphtol rồi quan sát sự xuất hiện màu. Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm (-) khi môi trường không đổi màu. 2.2.5 Thử nghiệm Citrate Nguyên tắc: Nhằm xác định vi si sinh vật sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất Cơ sở sinh hóa: Năng lượng cung cấp cho vi sinh vật khi trong môi trường không có nguồn nguyên liệu để sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm lactic bằng cách sử dụng nguồn carbon duy nhất là citrate. Bước đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate, đây là hai sản phẩm trung gian cho quá trình đồng hóa citrate, còn sản phẩm nhận được của quá trình này phụ thuộc vào pH của môi trường. Nếu pH kiềm thì trong môi trường sẽ nhận được nhiều acetate và fomate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactatte, acetoin. Như vậy sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác các vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối amonium như là nguồn đạm duy nhất à sinh ra NH3 làm kiềm hóa môi trường. Trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối amonium sẽ làm tăng pH của môi trường thể hiện qua sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng trong thử nghiệm là Simmon citrate agar hay môi trường lỏng Koser. Cấy vi sinh vật lên môi trường thạch nghiêng Simmon citrate agar và ủ ở 370C trong 24 giờ lấy ra quán sát. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dương. Thử nghiệm (-) là môi trường không đổi màu. 2.2.6 Thử nghiệm trên môi trường KIA/TSI Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn carbonhydrat có mặt trong môi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas. Cơ sở sinh hóa: Môi trường KIA là môi trường rắn chứa lactose 1%, glucose 1%, TSI tương tự nhưng chứa thêm sucrose 1%. Có 3 trường hợp xảy ra khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường KIA : - Chỉ lên men glucose, lên men cả hai loại đường và không lên men cả hai nguồn trên. Nếu vi sinh vật chỉ sử dụng glucose sau 24 giờ nuôi cấy làm phần nghiêng có pH kiềm vì sau khi sử dụng hết lượng glucose thì vi sinh vật sử dụng pepton trong môi trường làm giải phóng NH3 nên môi trường phần nghiêng có pH kiềm, ở phần sâu môi trường có sự lên men kỵ khí glucose các sản phẩm thu được là acid hữu cơ làm môi trường pH acid à do trong môi trường có chứa chất chỉ thị pH (thường là phenol red) thì phần nghiêng của môi trường sẽ có màu đỏ và phần sâu có màu vàng. - Nếu vi sinh vật sử dụng cà hai nguồn đường nên phần nghiêng và sâu đều có tính acid nên cả môi trường màu vàng. - Trong trường hợp cả hai nguồn carbon không được sử dụng thì nguồn pepton được sử dụng và làm môi trường pH kiềm nên cả môi trường có màu đỏ. Trong môi trường nếu có tạo thành H2S thì môi trường có màu đen , có sinh gas thì gas sẽ tích tụ làm vỡ thạch hoặc tạo thành các bọt khí bên trong. Đối với môi trường TSI thì các phản ứng xảy ra tương tự, tuy nhiên trong trường hợp cả phần nghiêng và phần sâu có hiện tượng acid là do một trong hai hoặc cả hai nguồn sucrose và lactose được sử dụng. Trong trường hợp này cần làm thêm các thử nghiệm trên môi trường lactose và sucrose. Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật trên môi trường thạch nghiêng TSI hoặc KIA ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ, sau đó quan sát sự đổi màu môi trường Đọc kết quả: Môi trường phần nghiêng màu đỏ, phần sâu màu vàng à sử dụng glucose; phần nghiêng và phần sâu màu vàng à không sử dụng các nguồn đường trên; phần nghiêng và sâu màu vàng à sử dụng các nguồn đường trên. 2.2.7 Thử nghiệm tính di động trên môi trường thạch mềm Nguyên tắc: Nhằm xác định vi sinh vật có khả năng di động hay không. Phương pháp tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật trong môi trường có bổ sung 0.5 – 0.6% agar, ủ ở 370C sau 24 – 48 giờ sau đó quan sát. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi vi sinh vật mọc lan ra đường cấy và làm đục môi trường xung quang. Thử nghiệm (-) khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đường cấy và môi trường vẫn trong. 2.2.8 Thử nghiệm Urease Nguyên tắc: Nhằm xác định vi sinh vật có khả năng phân hủy urea thành amonia và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi sinh vật tiết ra. Cơ sở sinh hóa: urea là một hợp chất carbamide rất dễ thủy giải, sự thủy giải của urea dưới sự xúc tác của urease sẽ giải phóng hai phân tử ammonia. Khi có cơ chất urea hiện diện trong môi trường, urease được tổng hợp và phóng thích ra môi trường bên ngoài tế bào xúc tác phản ứng thủy giải urea. Các sản phẩm sau phản ứng làm môi trường hóa kiềm và làm chuyển màu chất chỉ thị pH Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật vào môi trường urea có chứa chất chỉ thị là phenol red ủ ở 370C trong 12 – 18 giờ, sau đó quan sát sự đổi màu. Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển sang màu dỏ hồng. Thử nghiệm (-) khi môi trường không đổi màu. 2.3 Phương pháp phân lập giống Bacillus subtilis và xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. 2.3.1 Phân lập giống Giống Bacillus subtilis được phân lập từ nguồn natto của Nhật Bản và cỏ khô. Mẫu được cắt nhỏ cho vào bình tam giác, cho nước máy vào bình, đem đi đun sôi khoảng 15 phút. Sau đó đem đi ủ ở 370C trong vòng 48 giờ. Sau 48 giờ, ta sẽ thấy một lớp váng xám, nhăn xuất hiện trên bề mặt. Ta sẽ đem đi pha loãng đến độ pha loãng thích hợp, rồi cấy trang ra đĩa petri, đem ủ ở 370C trong 24 giờ để tạo ra các khuẩn lạc Bacillus subtilis riêng rẽ. Sau khi tạo được các khuẩn lạc riêng rẽ phải kiểm tra lại độ thuần của giống bằng cách pha giống với nước muối sinh lý dùng kỹ thuật cấy ria sau đó quan sát sự thuần khiết của khuẩn lạc cũng chính là sự thuần khiết của giống. Kiểm tra và chọn khuẩn lạc tốt đem đi cấy truyền vào ống thạch nghiêng để giữ giống. 2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme protease Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease tren cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme protease. Hóa chất Dung dịch đệm phosphate - pH 7- 0,1M Dung dịch tyrosin chuẩn 1µmol/ml Dung dịch casein 1% Dung dịch TCA (trichloracetic acid) 5% Na2CO3 0,4M Thuốc thử folin (pha loãng 5 lần) Dung dịch NaOH 0,5N Dung dịch HCl 0,1M Cách tiến hành Dựng đường chuẩn tyrosin Số ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Tyrosin ( ml ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HCl 0,1M ( ml ) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Na2CO3 0,4M ( ml ) 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử folin (ml) 1 1 1 1 1 1 Lắc đều, để ổn định dung dịch trong 20 phút ở 370C Đo hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660nm Mẫu đối chứng: Lấy dung dịch HCl 0,1M thay cho dung dịch tyrosin và tiến hành như trên. Xác định hoạt tính enzyme protease Chúng ta sẽ hút 1ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm và đem ủ ở 370C trong 10-15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme đã được pha loãng (10 lần) vào và lắc đều, rồi đem đi ủ ở 370C trong 60 phút. Sau đó cho vào hỗn hợp này 2ml dung dịch TCA, để ổn định dung dịch trong 25 phút, đem dung dịch đi lọc để loại tủa. Hút 1ml dịch lọc vào ống nghiệm khác và cho tiếp 5ml dung dịch Na2CO3 vào, thêm 1ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh thì đem đi đo quang ở bước sóng 660nm. Mẫu đối chứng: Lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành như trên. Kết quả Hoạt tính của enzyme protease được tính dựa vào định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100µg Tyrosin trong 1ml dung dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease (DVHT/g) = (A – A0) * F * n * 1/100 A: Độ hấp thụ của mẫu A0: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng F: Lượng Tyrosin từ đường chuẩn n: Hệ số pha loãng của enzyme 2.3.3 Xác định hoạt tính enzyme amylase Nguyên tắc Hoạt tính enzyme amylase xác định theo phương pháp Smith và Roe (1996). Hoạt tính amylase biểu thị cho khả năng của amylase xúc tác thủy phân bột đến dextrin trong 1 phút ở 500C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đó trong 1g mẫu. Khi phản ứng phân hủy tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod và được đem đi đo quang. Hóa chất Dung dịch đệm phosphate 1/15M, pH 6.2 Dung dịch tinh bột 1% Dung dịch Lugol Dung dịch HCl 1N Dung dịch NaCl 3% Cách tiến hành ống chuẩn ống thử 1 ml nước cất 1 ml dung dịch enzyme các mẫu 1 ml dung dịch đệm 1 ml dung dịch đệm 1 ml tinh bột 1 ml tinh bột 0,5 ml NaCl 0,5 ml NaCl Tất cả đem ủ ở 500C trong 30 phút và sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml HCl để kìm hãm ngay sự hoạt động của enzyme. Sau đó nước cất vào mỗi ống nghiệm đến 10 ml. Cho tiếp vào mỗi ống 1 giọt Lugol. Đo OD ở bước song 595 nm. Kết quả UI = [(E0 – E1) * C * L] / (E0 * T) E0: Mật độ quang học của ống chuẩn E1: Mật độ quang học của ống thử C: Lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (10mg) L: Hệ số pha loãng T: Thời gian phản ứng (30 phút) 2.4 Nhân giống Nhân giống trên môi trường dịch sữa đậu nành bổ sung thêm các chất khoáng. Thành phần môi trường nhân giống như sau: Dịch sữa đậu nành 100ml Sacharose 3% K2HPO4 0,1% MgSO4 0,1% NH4NO3 0,1% NaCl 0,5% 2.5 Giữ giống Môi trường giữ giống là môi trường cao thịt-peptone. Thành phần môi trường như sau: Peptone 1g Meat extract 1g NaCl 0,5g Argar 2g Nước 100ml Hoặc cũng có thể giữ giống trên môi trường nước chiết đậu Thành phần môi trường như sau Dịch chiết đậu 100ml Sacharose 3g Agar 3g NaCl 0,5g Giữ giống bằng các phương pháp 2.3.1 Phương pháp cấy chuyền Sau khi giống đã mọc tốt, ta cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3 - 4 0C và sau đó cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới. Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Để kéo dài thời gian bảo quản giống, ta nên phủ 1 lớp parafin trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. 2.3.2 Bảo quản lạnh Giữ giống ở nhiệt độ 2-50C trong tủ lạnh. 2.6 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa sinh Xác định độ ẩm Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hết nước tự do có trong thực phẩm. Cân trọng lượng trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước trong thực phẩm. Cách tiến hành: Cân đĩa petri đã sấy khô Cân 10g mẫu đã chuẩn bị sẵn, cho vào đĩa petri Cho tất cả vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C, sấy khô cho đến trọng lượng không đổi ( thường là khoảng 6h ). Sấy xong đem làm nguội trong bình hút ẩm 25 – 30 phút, đem mẫu đi cân. Cho lại vào tủ sấy trong 30 phút, đem ra để nguội trong bình hút ẩm, cân lại cho đến khi trọng lượng mẫu không đổi. Kết quả giữa 2 lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,5g. Tính kết quả: Độ ẩm = ( trọng lượng mẫu khô * 100 ) / trọng lượng mẫu tươi 2.6.2 Phương pháp xác định đạm tổng số Nguyên tắc: Hàm lượng protein thô được tính gián tiếp bằng cách xác định hàm lượng nitơ tổng. Trước tiên vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao với chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2 Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O; còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch: 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4. Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO,... Giai đoạn chưng cất giải phóng NH3 : tạo môi trường kiềm đuổi nitơ ra khỏi dung dịch dưới dạng NH3. ( NH4 )2SO4 Na2SO4 + NH3 + H2O NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0.1N. 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O Hóa chất H2SO4 đậm đặc NaOH 40% H2SO4 0.1N chuẩn NaOH 0.1N chuẩn Thuốc thử Tasiro Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) Tiến hành Vô cơ hóa mẫu Hút 1ml nước mắm cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa). Cho thêm chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch. Cất đạm Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống ng