Khóa luận Công nghệ sản xuất rượu vang nho

o thời tiết quá khô hoặc quá ẩm khi mưa lớn (ít xảy ra hơn). Nứt quả do sâu bệnh phá hại mà chủ yếu là các loại côn trùng và nhện làm rách bề mặt vỏ quả nho. Chế độ phân bón (dinh dưỡng) không cân đối, đặc biệt là bón thừa đạm hoặc tưới nước không đảm bảo. Bọ trĩ và nhện vàng là 2 đối tượng nguy hiểm. Bệnh gây vỡ quả chủ yếu là phấn trắng (Uncinula neccator).  Biện pháp xử lý: Phòng trừ sâu bệnh hợp lý, kịp thời, nên phòng trừ sớm ngay từ khi quả còn nhỏ là rất cần thiết. Đặc biệt chú ý bệnh phấn trắng (do nấm Uncinnula neccator), Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 22 bọ trĩ và nhện vàng. Hạn chế đến mức thấp nhất vết thương trên vỏ quả do các đối tượng trên tấn công, gây hại vào giai đoạn còn non. Cần cột cành, tỉa quả,… kịp thời nhằm tránh hiện tượng va chạm làm tổn thương vỏ quả nho. Cần bón cân đối dinh dưỡng, chú ý giai đoạn nho bắt đầu chín bói không nên lợi dụng phân đạm. Chế độ tưới nước phù hợp, tránh tình trạng để quá khô rồi mới tiến hành tưới nước cho vườn nho, nhất là giai đoạn quả lớn. Cần tỉa kịp thời các quả đã bị nứt, tránh sự lây lan. Có thể dùng chất điều hòa sinh trưởng, phân qua lá để phun nhằm giảm tỷ lệ nứt quả.Ví dụ, nho giống Cheema Sahebi phun N - 6 - benyl adenine 250 ppm, NA 50 ppm chống được sự nứt quả với kết quả rất tốt. 1.8. Thu hoạch và bảo quản nho: 1.8.1. Thu hoạch: Thu hoạch là một khâu rất quan trọng.Vì nho là loại trái mọng nên phương pháp thu hái không phù hợp có thể làm nho bị hư hỏng, bị thâm do ép chặt, bị va đập (do bị rơi hoặc do vật khác đập vào), hoặc bị chấn động (do bao gói lỏng lẻo trong quá trình vận chuyển). Do đó mà trong suốt quá trình thu hoạch nho, những yếu tố như hình dạng bên ngoài của nho,độ chín, thời gian thu hoạch, cách bao gói, vận chuyển, quan trọng là phải nhanh và đúng kỹ thuật để có thể hạn chế một cách tối đa việc thất thoát cũng hư hỏng do quá trình thu hoạch gây ra. Thời gian thu hái: vào lúc sáng sớm, nhằm tránh sự thoát hơi nước cho nho. Cách thu hái: dùng kéo hoặc dao cắt cuống chùm dài rời khỏi dây nho và dùng sọt nhựa có phủ lên trên một lớp vải sạch để chứa. Làm lạnh: nhiệt độ thấp làm hạn chế hoặc ngừng sự phát triển của vi sinh vật. Làm lạnh trước (làm lạnh ngay sau thu hoạch) là rất quan trọng đối với hầu hết các loại rau quả vì tốc độ hư hỏng của chúng trong 1 giờ ở nhiệt độ 320C, trong một ngày ở 100C, hoặc trong một tuần ở 00C là như nhau. Đối với nho thì làm lạnh Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 23 trước giúp làm giảm bớt lượng nhiệt trong sản phẩm nên cũng hạn chế được các vết thâm do va đập trong quá trình vận chuyển. Có các phương pháp làm lạnh nho trong quá trình bảo quản như: sử dụng phòng lạnh (dùng quạt, hoặc không khí lạnh), làm lạnh có nước, làm lạnh bằng cơ học. Rửa sạch và cắt tỉa: trước tiên cần dùng nước sạch rửa các dụng cụ như thùng chứa, thiết bị, đồ dùng thường xuyên tiếp xúc với quả nho, nhằm tránh sự phát triển và hoạt động của vi sinh vật. Rửa chùm nho bằng nước sạch 3-4 lần cho hết bụi, lá khô, vật lạ dắt vào chùm nho nếu có. Tiếp đó ta cần phải cắt tỉa, loại bỏ những quả không đạt yêu cầu, những quả bị sâu bệnh và côn trùng cắn phá. Lựa chọn và phân loại nho: việc lựa chọn bằng tay hoặc máy móc để loại bỏ những quả có dấu hiệu hư hỏng do trong quá trình thu hoạch. Những quả đạt yêu cầu được chia thành hai hay nhiều loại dựa vào màu sắc, trạng thái, khuyết tật rồi mới phân loại cho phù hợp với nhu cầu của thị trường:  Nho dùng để ăn tươi  Nho dùng để xuất khẩu  Nho dùng để chế biến thành các sản phẩm khác nhau: rượu vang nho, mức nho, nước ép từ nho,… Bao gói và vận chuyển nho: nho sau khi thu hoạch sẽ được xử lý và đem đi đóng thùng, vận chuyển đến nơi tiêu thụ bằng nhiều phương tiện khác nhau. 1.8.2. Bảo quản bằng phương pháp hóa học: 1.8.2.1. Bảo quản bằng muối: Phun dung dịch NaCl 0.6% trước khi thu hoạch khoảng 10-12 ngày nhằm tăng thời gian bảo quản cho nho. Hoặc có thể phun dung dịch Nitrat canxi Ca(NO3)2 10 ngày trước khi thu hoạch để giảm tổn thất về dinh dưỡng và hỏng thối. 1.8.2.2. Bảo quản bằng cách sử dụng sunfit hóa: Sunfit hoá là phương pháp bảo quản quả bằng SO2 hoặc H2SO3. Khí SO2 và H2SO3 là một chất khử mạnh, có tác dụng diệt trùng mạnh, diệt các loại vi sinh vật, Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 24 nó có thể làm giảm hàm lượng oxy trong các tổ chức tế bào của nho. H2SO3 tan vào các phức chất protein, lipit của tế bào vi sinh vật làm chết tế bào, cản trở sự hô hấp của vi sinh vật, và tham gia vào việc kết hợp với các sản phẩm trung gian cản trở tới quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Vì thế kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí và kìm hãm hoạt động của men oxy hoá khử. Tác dụng bảo quản của SO2 và H2SO3 ở nhiệt độ bình thường là ở nồng độ 0,05% - 0,2% khối lượng sản phẩm có tác dụng tốt. Hiệu quả của SO2 và H2SO3 phụ thuộc vào nồng độ của chúng cao hay thấp và phụ thuộc vào nhiệt độ khi xử lý: - Ở t o = 75 0 C thì nồng độ SO2 là 0,05%. - Ở t o = 30 0 - 40 0 C thì nồng độ SO2 là 0,1 - 0,15%. Ngoài ra hiệu quả của nó còn phụ thuộc vào pH của môi trường tức là phụ thuộc vào nồng độ ion H+: - Ở môi trường pH = 7 thì nồng độ SO2 là 0,5% vi sinh vật vẫn hoạt động được. - Ở môi trường pH= 3.5 thì nồng độ SO2 là 0,03% - 0,05% đã khống chế được vi sinh vật. - Ở môi trường pH = 2,5 thì nồng độ SO2 chỉ cần 0.01% – 0.03% là ức chế được vi sinh vật. SO2, H2SO3 là những chất khử mạnh nên dễ làm thay đổi màu sắc của nho. Đặc biệt là màu đỏ, xanh của nho. Do đó khi bảo quản bằng SO2 phải có quá trình khử sunfua (Desunfit).  Kỹ thuật sunfit hóa: Có hai phương pháp sunfit hóa: khô và ướt - Kỹ thuật sunfit hóa ướt: Người ta dùng dung dịch SO2 đã được chuẩn bị sẵn trong nước lạnh với nồng độ 4.5% - 5.5% để hòa dần vào nho bảo quản. Số lượng tùy thuộc vào qui trình công nghệ với điều kiện sao cho đảm bảo nồng độ SO2 trong nho bảo quản là 0.12% - 0.2%. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 25 - Kỹ thuật sunfit hóa khô: Tức là xử lý nho đựng trong các hòm kín và thùng khô có chứa SO2 đặt trong các phòng kín có cấu tạo đặc biệt, hoặc có thể nạp trực tiếp khí SO2 từ các bình chứa vào trong phòng, hoặc đơn giản hơn là đốt lưu huỳnh trong phòng cũng sinh ra SO2.  Khử sunfua: Để khử khí sunfua ra khỏi thành phẩm, người ta có thể dùng nhiệt độ của hơi nước để xử lý trực tiếp bằng cách cho bán thành phẩm vào nồi, đáy nồi có hệ thống ống phun hơi nước, được nén ở áp suất 2-2.5 atm. Phương pháp này khử rất nhanh và sạch nhưng có nhược điểm là do hơi nước phun trực tiếp vào quả nên làm cho hàm lượng nước trong quả tăng lên và khi cô đặc thì tốn thời gian và có khi làm cho phẩm chất thành phẩm bị giảm. 1.8.2.3. Bảo quản bằng cách sử dụng Ozon(O3): Cơ chế: vi khuẩn là tế bào có nhân ở giữa và nước bao quanh, ngoài cùng là lớp màng bảo vệ rất mỏng. Ở điều kiện bình thường, áp suất của khí quyển tác dụng lên lớp màng bằng sức căng mặt ngoài của nước trong màng. Khi quanh tế bào có nước ozon, tức mật độ môi trường lớn hơn trong tế bào, sự cân bằng bị phá vỡ. Nước ozon sẽ tràn vào tế bào.Tế bào bị teo lại.Vi khuẩn bị tiêu diệt. Sau ba ngày, kể từ lúc chảy từ máy tạo nước amonit, ozon trong đó sẽ biến thành phân tử O2. Do đó nơi ở của vi khuẩn là vỏ trái cây hay phía trong vỏ trái cây một chút chỉ bị cách ly với không khí, mà thực chất là với O2 trong 3 ngày chứ không bị độc hại. Chính sự cách ly này đã làm chậm quá trình tự chín của nho vì sự "hô hấp" của nho bị giảm hẳn đi. Làm chậm sự tự chín của nho tới mức thấp nhất bằng cách đảm bảo nhiệt độ cân bằng giữa phần ruột của nho và môi trường. Độ ẩm của môi trường và trên mặt vỏ nho. Quan trọng nhất là quả phải bị cách ly với không khí, tức là cách ly với oxy. Muốn vậy phải luôn có nước ozon bao quanh nho hoặc khí trơ. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 26 1.8.3. Bảo quản bằng các phương pháp kỹ thuật: 1.8.3.1. Sấy khô: Trong quả chứa hàm lượng nước rất cao (70% – 90%). Thông qua quá trình làm giảm phần nước trong quả, giảm hoạt tính của nước nâng cao hàm lượng chất rắn có thể hòa tan của nguyên liệu khiến vi sinh vật khó tồn tại, nhằm bảo vệ quả. Phương pháp này gọi là sấy khô Sau khi tăng nhiệt, thành phần nước trên bề mặt của nho sẽ bốc hơi, nước trong quả sẽ đi ra ngoài.Trong quá trình sấy khô có 2 dạng khuếch tán: sự khuếch tán ra ngoài của nước (sự bốc hơi nước của bề mặt quả) và sự khuếch tán bên trong của nước (sự di chuyển của nước bên trong quả ra ngoài). Sấy khô chủ yếu có 2 dạng: sấy tự nhiên và sấy nhân tạo. + Sấy tự nhiên: tận dụng gió nóng và nhiệt bức xạ của mặt trời để làm khô. Chọn nơi thoáng, thông gió, bằng phẳng, rải nho lên trên bãi hoặc trước tiên phải trải chiếu, mền lên mặt đất rồi mới cho nho lên phơi dưới nắng gắt. + Sấy nhân tạo: đòi hỏi thiết bị tăng nhiệt và giữ nhiệt phải tốt, bảo đảm thông gió, hợp vệ sinh, tiện thao tác quản lý.Thường sử dụng lò sấy và phòng sấy. 1.8.3.2. Lạnh đông: Nhiệt độ thấp làm hạn chế hoặc ngừng sự phát triển của vi sinh vật, bởi ở nhiệt độ thấp các phản ứng hóa học bị chậm lại, các enzym không hoạt động. Do đó, nho ít bị hư hỏng. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 27 Sơ đồ bảo quản nho: Bảo quản Vận chuyển Người tiêu dùng Định lượng Đóng gói Thu hoạch Làm lạnh Phân loại Rửa Xử lý hóa học Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 28 1.9. Tìm hiểu về nấm men: 1.9.1. Hình dạng và kích thước: 1.9.1.1. Hình dạng tế bào nấm men: Nấm men thường có hình dạng khác nhau, thường có hình cầu, hình elip, hình trứng, hình bầu dục và cả hình dài. Một số loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (Mycelium) hay khuẩn ty giả (Pseudo mycelium). Tuy nhiên hình dạng của chúng không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy. 1.9.1.2. Kích thước tế bào nấm men: Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình: - Chiều dài: 9 – 10 m - Chiều rộng: 2 – 7 m Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. 1.9.2. Cấu tạo tế bào nấm men: Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như sau: - Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau. Trong đó chủ yếu là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin, volutin,… - Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzyme permeaza… - Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó. - Nhân tế bào. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 29 1.9.3. Sự sinh sản của nấm men: Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: - Sinh sản bằng cách nảy chồi. - Sinh sản bằng cách phân đôi. - Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử. 1.9.4. Một số loài nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang: Sau đây là một số loài nấm men thường gặp trong nước quả có vai trò quan trọng trong nghề làm rượu vang. 1.9.4.1. Saccharomyces cerevisiae: Đây là tên hiện nay dùng phổ biến, trước đây người ta gọi là Saccharomyces cerevisiae Meyer hay là S. ellipsoideus theo Lodder là Saccharomyces vini. Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men. Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông. Nguồn dinh dưỡng cacbon của loại này là đường, cồn và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotinic, biotin, mezoinozit, thiamin và piridoxin. Đa số các tế bào của loài này hình ovan có, sinh sản theo lối nẩy chồi và tạo thành bào tử. Saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme invectara có khả năng khử đường sacaroza thành fructoza và glucoza, vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của nấm men này chỉ đạt được 8 – 10% so với thể tích. Ở giai đoạn cuối lên men Saccharomyces cerevisiae kết lắng nhanh và làm trong dịch rượu. Ở nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho vang có mùi vị đặc trưng riêng biệt. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 30 Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào Saccharomyces cerevisiae thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh. 1.9.4.2. Saccharomyces uvarum: Men này được tách từ nước nho, rượu len men tự nhiên. Về hình thái nó không khác với các loài khác. Khả năng sinh bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt. Các nòi của loài này có thể lên men 12 – 130 cồn trong dung dịch nước nho. 1.9.4.3. Saccharomyces chevalieri: Theo Lodder là Saccharomyces chevalieri Guilliermond. Nấm men này được tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang non được gây men nước dừa hoặc nước cọ. Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 160 cồn. Nó thường lẫn với Saccharomyces cerevisiae. 1.9.4.4. Saccharomyces oviformis: Theo Lodder là Sac. Beuanes saccardo. Được tách ra từ nước nho tự lên men, nhưng loại nấm men này ít hơn so với Sacch. vini. Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các loại nước quả khác, có khả năng chịu được đường cao, cồn cao, lên men kiệt đường và tạo thành tới 180 cồn. Các yếu tố sinh trưởng của loại này giống như Sacch. vini và có khả năng chịu được cồn cao. Dùng các nòi thuần chủng của giống này lên men dịch quả có hàm lượng đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt. Có hình dáng giống như Saccharomyces cerevisiae và có thể tạo thành 18% rượu trong quá trình lên men, giống này tạo thành màng trên dịch quả. S. oviformis lên men được glucose, fructose, mantose, saccarose, maltose và 1/3 rafinose, không lên men được lactose, pentose. Điều khác nhau cơ bản của S. oviformis với S. vini là S. oviformis không lên men được galactose và men nổi lên bề mặt dịch lên men tạo thành màng. Hai giống sản xuất rượu vang này (S. vini và S. oviformis) có nhiều nòi được dùng trong sản xuất. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 31 1.9.4.5. Hanseniaspora apiculate – Kloeckera apiculata: Kloeckera apiculata: kích thước tương đối nhỏ, có hình ovan – elip hoặc hình quả chanh, tế bào có một đầu nhỏ người ta thường gọi là nấm men hình chùy. Sinh sản bằng nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả chiếm đến 90% tổng số men khi bắt đầu lên men. Nó có thể lên men tạo thành 6 – 7 0 cồn, nhưng tạo ra một loạt các acid bay hơi cũng như các ester của chúng làm cho dịch có mùi tạp và nó còn kìm hãm các loài nấm men chính trong lên men, K. apiculata nhạy cảm với SO2. Trong nghề làm rượu vang người ta không mong muốn loài nấm men này phát triển, nếu có thì chỉ cần có trong giai đoạn đầu tạo được 3 – 4 0 cồn. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 32 Phần 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 33 2.1. Nuôi cấy vi sinh vật: 2.1.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men: 2.1.1.1. Nguyên tắc của việc chế tạo môi trường: Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật. Để so sánh đặc tính và tốc độ phát triển của chúng thì các giống phải được nuôi tăng sinh trong cùng điều kiện để có tính chất sinh lý giống nhau. Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường. Đảm bảo các điều kiện lý hóa cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Sơ đồ thực hiện: Cân Bình tam giác Nấu cách thủy Khử trùng (1210C, 15 phút) Nước cất Bột môi trường Bảo quản và kiểm tra môi trường Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 34 2.1.1.2. Thuyết minh sơ đồ: Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm men là môi trường Sabouraud, có công thức chế tạo như sau: Special peptone 10g/l Glucose 40g Dextrose 20g/l Nước 1 lít pH (25 0 C) 5.6-6.0 Cân môi trường nuôi cấy và hòa tan trong nước cất với hàm lượng xác định như sau: Bột môi trường 70g Nước cất 1000ml Cho hỗn hợp trên vào bình tam giác và nấu cách thủy để các thành phần trong môi trường hòa tan trong nước. Dùng bông gòn bịt kín miệng bình tam giác. Rửa sạch các đĩa Petri, ống nghiệm, pipette. Sau đó dùng giấy bịt kín để thanh trùng. Tiệt trùng môi trường, dụng cụ ở nhiệt độ 1210C trong thời gian 15 phút. Lấy môi trường và dụng cụ ra khỏi nồi tiệt trùng. Phân phối môi trường từ bình tam giác và dụng cụ. Đối với đĩa petri lượng môi trường phân phối vào có độ dày khoảng 2 mm. Đối với ống nghiệm lượng môi trường cho vào bằng 1/3 chiều cao của ống. Quá trình phân phối môi trường vào dụng cụ chứa phải tuân thủ một số nguyên tắc cơ bản sau: - Môi trường khi được phân phối phải ở trạng thái lỏng. - Các thao tác phân phối cần phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không bị dính lên miệng hay thành của dụng cụ chứa và phải hoàn thành trước khi môi trường hóa rắn. Bảo quản và kiểm tra môi trường Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 35 - Đối với môi trường chưa sử dụng, cần được bảo quản ở chỗ mát, nhiệt độ thấp (khoảng 20-25 0C), hạn chế tác dụng của ánh sáng và không để môi trường bị khô. - Trước khi sử dụng lại để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, ta thường đặt chúng vào chỗ ấm ở nhiệt độ 37 0 C trong 42-48 giờ, sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có vi sinh vật phát triển. 2.1.2. Phân lập nấm men: 2.1.2.1. Mục đích: Trong dịch lên men, vi sinh vật tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn). Muốn nghiên cứu những đặc tính sinh lý, sinh hóa hoặc sử dụng một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Phân lập nấm men là quá trình tách riêng các chủng nấm men từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Nấm men ở dạng thuần khiết là giống nấm men được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 36 Sơ đồ thực hiện: Nho Tạo khuẩn lạc trên đĩa Petri Tách ròng và nuôi cấy vào ống nghiệm Cấy truyền Nhân giống trong ống nghiệm Nước nho Phối chế (pH = 4 – 4.3 ; Brix = 22) Thanh trùng bằng NaHSO3 (122mg/l) Nhân giống trong bình tam giác Xử lí Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 37 2.1.2.2. Thuyết minh sơ đồ: Nho sau khi xử lí rửa sạch, dùng dao cắt đôi thành hai miếng. Để một nửa trái trên bề mặt của đĩa petri đã được phân phối môi trường vào, lắc nhẹ cho nửa quả nho chạy đều trên bề mặt đĩa. Lấy nửa trái nho ra. Lật úp đĩa và đặt vào tủ ủ vi sinh ở nhiệt độ 370C trong 24 đến 48 giờ cho khuẩn lạc xuất hiện. Xác định các chủng nấm men bằng cách quan sát; + Hình dạng, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc (bằng mắt thường). + Quan sát hình dạng và kích thước của tế bào nấm men dưới kính hiển vi. Chọn ra giống nấm men tiêu biểu đem cấy vào ống nghiệm là giống có khuẩn lạc trắng trong, tế bào hình trứng lớn. Lưu ý : Mọi thao tác trên phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng: + Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ sấy được khử trùng bằng cồn. + Không khí trong tủ được khử trùng bằng tia UV. + Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn. Kiểm tra độ thuần khiết của giống mới vừa phân lập bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào nấm men dưới kính hiển vi. Cấy truyền để bảo tồn giống vừa phân lập: tay trái cầm hai ống nghiệm (một ống giống và một ống môi trường), tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ que cấy. Sau đó, dùng ngón cái và ngón trỏ xoay nhẹ nút ống nghiệm ra . Tiếp theo hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng hai ống nghiệm. Đợi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống nghiệm. Kế tiếp rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống nghiệm chứa môi trường, lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu hình chữ zic zắc. Cuối cùng, rút que cấy ra, khử trùng lại phần không khí nơi miệng hai ống nghiệm rồi đậy nắp ống lại và khử trùng lại que cấy sau khi sử dụng xong. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 38 Nhân giống trong ống nghiệm và trong bình tam giác để phát triển sinh khối để khảo sát tốc độ lên men của giống nấm men và để giữ giống. 2.1.2.3. Phương pháp thực hiện: Nho sau khi loại bỏ cuống, rửa sạch cho vào máy ép lấy dịch quả và xác quả. Tách riêng phần xác quả, lấy dịch trong mang đi phối chế. Sau đó đem đi thanh trùng bằng NaHSO3 120mg/l, khi NaHSO3 phân hủy hoàn toàn (sau khoảng 30 phút), cho nấm men vào. + Phối chế: dùng pH kế và chiết quang kế để điều chỉnh dịch quả pH và độ Brix đạt yêu cầu, nếu chưa đạt bổ sung đường và acid citric cho đat yêu cầu. + Bổ sung nấm men với hàm lượng 2% giống. + Khuấy đảo đều, sau đó phân tích mẫu ban đầu N0. Sau khi đã phân tích mẫu ban đầu, dịch quả đem đi phân phối vào một số chai thủy tinh với hàm lượng 250ml/chai. + Dùng bông gòn đậy kín chai. + Quan sát quá trình lên men cứ sau 12h lấy mẫu ra phân tích. Mỗi chai được lấy đem đi phân tích theo thời gian, điều này không gây nhiễm vào các mẫu khác khi lấy mẫu. . pH: đo bằng pH kế. . Tỉ trọng . . Hàm lượng CO2. . Độ cồn. . Độ Brix: đo bằng chiết quang kế. . Tế bào nấm men. + Đếm bằng kính hiển vi. + Cấy trên đĩa petri đếm khuẩn lạc. 2.1.3. Phương pháp nhân giống nấm men: Cần bổ sung Zn và N. Môi trường giống khởi động càng giống môi trường lên men chính càng tốt. Sục khí hoặc lắc đóng vai trò quan trọng Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 39 Môi trường YEPG: yeast extract 5g/l; pepton 10g/l; glucose 20g/l 2.2. Đo độ đường: 2.2.1. Khái niệm: Lượng đường trong quả nho hoặc nước nho, hoặc vang chiếm phần lớn lượng chất rắn hòa tan (90 – 94%) có trong nước ép nho. Vì vậy việc đo tổng lượng chất rắn hòa tan được coi như là đo lượng đường. 2.2.2. Phương pháp: Có thể dùng hydrometer (đo tỷ trọng của dung dịch) hoặc refractometer (đo độ phản xạ của ánh sáng khi đi qua dung dịch) để đo chỉ tiêu này.Đơn giản nhất là dùng refractometer mặc dầu vẫn có sự khác biệt về giá trị đo giữa hai dụng cụ. Các thiết bị đo các chỉ tiêu theo tính chất vật lý cần sử dụng ở 20oC. 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ: - Hydrometer hoặc Refractometer (0 – 35oBrix). - Ống đong 250ml. - Nhiệt kế. Ống thạch nghiêng (rửa bằng môi trường vô trùng) 10ml môi trường YEPG – 24h, 20C 100ml môi trường YEPG – 3 ngày lắc, 25C 2l môi trường YEPG – 3 ngày sục khí, 25C 20l dịch đường – 3 ngày sục khí, 25C Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 40 - Phễu lọc. - Beaker. 2.2.4. Hóa chất: - 300ml (được lấy ngẫu nhiên từ các vị trí khác nhau rồi trộn lại). - Cồn 70%. - Dung dịch sucrose 20%. - Giấy lau kính. 2.2.5. Phương pháp tiến hành: 2.2.5.1. Hydrometer: Cho mẫu (đã làm lạnh đến 20 o C) vào ống đong sạch và khô. Đặt nhẹ nhàng hydrometer vào, không để cho hydrometer chạm vào thành và đáy của ống đong. Để yên vài phút cho dụng cụ đo ổn định. Đọc kết quả. Dùng nhiệt kế đo lại nhiệt độ của mẫu. Tính kết quả. Chú ý: làm sạch dụng cụ sau khi sử dụng. 2.2.5.2. Refeactometer: Làm sạch lăng kính bằng cồn 70 o trước khi sử dụng. Lau khô bằng giấy lau kính. Chú ý, mỗi lần thay dung dịch kiểm tra, đều phải làm sạch và khô lăng kính. Chỉnh refractometer vào vị trí có thể quan sát được tốt nhất. Nhỏ nước cất vào lăng kính (tương đương 0Brix). Nhỏ dung dịch sucrose vào lăng kính (tương đương 20Brix). Nhỏ dung dịch cần đo vào lăng kính. Đọc kết quả. Chú ý: không được để lẫn bọt khí vào dịch đo trong quá trình chỉnh dụng cụ và quá trình đo. 2.2.5.3. Đơn vị đo: Mỗi vùng sử dụng một đơn vị khác nhau để đo lượng đường. Đức, Áo, Thụy Sĩ dùng Oechslé. Pháp, Ý, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Úc, New Zealand dùng Baumé. Độ Brix (hoặc Balling) được sử dụng tại phần lớn các nước còn lại. Công nghệ sản xuất rượu vang nho SVTH: VŨ THỊ HOÀNG TIÊN 41 Cần chú ý rằng độ chính xác của phép đo phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ của mẫu chất lỏng. Do vậy cần chỉnh lý kết quả đo nếu nhiệt độ đo khác với 20C. Lượng cồn tiềm tàng là lượng cồn có thể chuyển hóa từ lượng đường tương ứng có trong quả. Được tính theo khả năng chuyển hóa đường thành cồn: 16,83g đường/L tương đương với 1% alcohol. 2.3. Đo độ cồn rượu vang: