Khóa luận Đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai PB260 X RO44/268 bằng kỹ thuật RAPD

số vấn đề. Nguồn vật liệu giống ban đầu do Wickham sƣu tập rất giới hạn về mặt di truyền vì chỉ xuất phát từ một vùng nhỏ so với diện tích phân bố tự nhiên của cây cao su, do đó không đại diện đầy đủ cho nguồn gen của cây cao su (Wycherley, P.R. 1968). Nguồn di truyền hạn hẹp này còn bị xói mòn nghiêm trọng vì mục tiêu cải tiến giống chỉ nhằm vào sản lƣợng mủ. Bên cạnh đó, sự cận thân giữa các dòng vô tính vẫn còn tồn tại, khó tránh khỏi giao phối cận huyết ở những chu kỳ kế tiếp. Chính vì vậy, việc mở rộng biến lƣợng di truyền con lai thông qua công tác lai tạo giữa nguồn gen Wickham với nguồn gen hoang dại Amazon cũng nhƣ việc tăng cƣờng các nghiên cứu về di truyền phân tử hỗ trợ trong công tác lai tạo giống đã và đang đƣợc các Viện Nghiên cứu Cao su thế giới tiến hành nhằm chọn lọc ra các tổ hợp lai tốt, có giá trị cao về mặt di truyền. 11 2.2 NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ 2.2.1 Chỉ thị hình thái Về mặt nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đó do một locus kiểm soát mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hƣởng do tác động của môi trƣờng, có thể đƣợc dùng làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000). Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình nhƣng chúng lại có những hạn chế nhất định nhƣ cho kết quả sai lệch do tƣơng tác kiểu gen với môi trƣờng, số lƣợng marker có giới hạn, chỉ ở qui mô hình thái và chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). 2.2.2 Chỉ thị isozyme Trong nghiên cứu di truyền học phân tử, isozyme là một trong hai loại marker cơ bản. Isozyme là chỉ thị sinh hoá, chúng là những enzyme có cùng chức năng xúc tác cho một phản ứng (hoạt tính xúc tác tƣơng tự hoặc giống nhau) nhƣng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau. Hoạt tính của chúng đặc trƣng với một cơ chất và trợ enzyme nhất định. Về mặt di truyền có thể chia isozyme thành hai dạng (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997): - Isozyme đơn gen: các isozyme này chịu sự kiểm soát của một gen, mặc dù chúng chúng đều đƣợc hình thành từ chuỗi polypeptide đơn nhƣng có thể có các kiểu phân tử khác nhau (do sự khác nhau về thành phần và trật tự các acid amin), và do vậy có thể phân tách chúng bằng điện di. - Isozyme đa gen: các isozyme này đƣợc mã hoá bởi hai hay nhiều gen và chúng có thể đƣợc phân biệt bằng các đặc điểm hoá miễn dịch hoặc bằng đặc tính enzyme (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997). 12 2.2.3 Chỉ thị DNA Là những chỉ thị phân tử DNA đƣợc tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử. Ngày nay các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu di truyền học phân tử. Nó tạo ra số lƣợng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme, độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Ngày càng có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng trong các nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện các chỉ thị liên kết với tính trạng,… Các kỹ thuật này có thể chia ra làm 2 nhóm chính: - Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR - based) nhƣ: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP, (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). - Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non - PCR based): điển hình là RFLP (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.2.3.1 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes). Sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt toàn bộ bộ gen của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó sản phẩm cắt đƣợc nhận biết bằng cách lai với những probe phát huỳnh quang. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.2.3.2 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi cấu trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA di chuyển trên gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau. Sau khi thực hiện phản ứng 13 PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có quy trình thực hiện khó nhƣng kết quả có độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, STS là đoạn ngắn DNA giúp phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di (Nguyễn Thị Lang, 2002). Kỹ thuật này có nhƣợc điểm là phải biết trình tự gen của đối tƣợng nghiên cứu. 2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) Nguyên lý của kỹ thuật này là giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides đƣợc lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Điều quan trọng là phải biết đƣợc những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng giống. Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu đƣợc dùng để định danh những giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền (Nguyễn Thị Lang, 2002). 2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos phát minh năm 1993, sau đó đƣợc Vos và ctv (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt giới hạn từ bộ gen của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002). 14 2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD là đoạn trình tự DNA ngắn, do sự tổng hợp một cách ngẫu nhiên, giúp phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002). Kỹ thuật RAPD cho phép tiến hành nghiên cứu di truyền phân tử mà không cần biết trƣớc về trình tự của chuỗi mã di truyền cần nghiên cứu. Một số ƣu điểm khác của kỹ thuật RAPD là: cho kết qua nhanh,thời gian để thực hiện phản ứng RAPD chỉ khoảng 14 giờ, cần một số lƣợng DNA mẫu rất nhỏ (25 ng), Kỹ thuật RAPD có thể dùng để nghiên cứu những trình tự có kích thƣớc nhỏ (10 kb). Tuy nhiên kỹ thuật RAPD lại có nhƣợc điểm là độ chính xác không cao. 2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1990 đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phƣơng pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000) Kỹ thuật PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, 15 tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát hiện mầm bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000) Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000). Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gel. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2000). Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ hình 2.1. 16 Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR. - Bƣớc 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C trong vòng 30 giây đến 1 phút. 17 - Bƣớc 2 (bắt cặp, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây. - Bƣớc 3 (kéo dài, elongation hay extension): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ phù hợp cho enzyme polymerase hoạt động là 72 C và thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tuỳ thuộc vào kích thƣớc của DNA cần khuếch đại và nồng độ Mg2+. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 1012 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm). Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR bao gồm: – DNA khuôn: DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA đƣợc dùng trong phản ứng PCR là một lƣợng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lƣợng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không nhƣ mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khuôn DNA có thể đƣợc thu nhận từ các mẫu không đƣợc bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần – Enzyme: Thông thƣờng, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao. Enzyme thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay là Taq DNA 18 polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã đƣợc phát hiện và đƣa ra thị trƣờng với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn nhƣ enzyme Tth polymerase từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động nhƣ một enzyme phiên mã ngƣợc thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA làm khuôn và ion Mn2+, nhƣng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. – Primer và nhiệt độ lai: Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: + Trình tự primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngƣợc, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer. + Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngƣợc không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần. + Các primer phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen. + Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc quá lớn, phản ứng PCR tối ƣu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb. – Các thành phần khác trong phản ứng PCR: + Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dƣơng tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. 19 + Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ƣu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thƣờng nồng độ tối ƣu này phải đƣợc xác định riêng cho từng phản ứng. – Số lƣợng chu kỳ phản ứng: Số lƣợng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thƣờng không vƣợt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân nhƣ sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lƣợng mẫu ban đầu. – Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR: Thiết bị cho phản ứng PCR nhƣ máy luân nhiệt (thermocycler) cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc thoát hơi nƣớc trong quá trình phản ứng. Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000). 2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU Marker phân tử dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã đƣợc sử dụng rộng rãi trên cây cao su gồm có RAPD (Varghese và ctv, 1997; Venkatachalam và ctv, 2002), AFLP (Safiah, 2004) và microsatellites (Seguin và ctv, 2001; Lekawipat và ctv, 2003). Trong đó khả năng nhận dạng di truyền của microsatellites là mạnh nhất (Seguin và ctv, 2001). Tuy nhiên, chi phí cho phân tích microsatellites hiện nay còn khá đắt nên trong giai đoạn đầu nghiên cứu, ngƣời ta thƣờng sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền và việc sử dụng nhiều primer đƣợc khuyến khích để tăng độ tin cậy khi phân tích RAPD. Do tính chất đồng trội nên các marker phân tử có thể sử dụng để kiểm tra phả hệ của con lai và thiết lập bản đồ gen cây cao su (Seguin và ctv, 2001). Bên cạnh đó, các marker phân tử còn là công cụ hỗ trợ thiết yếu trong việc phân tích QTL cho một số tính trạng nông sinh học trên cây cao su nhƣ: tính trạng kháng bệnh SALB 20 do nấm Microcyclus ulei (Lespinasse và ctv, 2000), tính trạng kháng bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Sumarmadji and Darmono, 2004), tính trạng kháng bệnh rụng lá do nấm Phytophthora và tính trạng thấp cây (Venkatachalam và ctv, 2001 và 2004). RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) là các đoạn DNA đƣợc khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR nhờ sử dụng các mồi (primer) ngẫu nhiên (Williams và ctv, 1990). Các giống của cùng một loài, nếu có kiểu gen hoàn toàn giống nhau sẽ đƣợc khuếch đại những đoạn DNA có kích thƣớc giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR. Ngƣợc lại, nếu có sự khác nhau về kiểu gen thì các đoạn DNA đƣợc khuếch đại sẽ cho kích thƣớc hoàn toàn khác nhau thể hiện trên các băng DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose. Marker RAPD có thể sử dụng rất hiệu quả trong nhận dạng di truyền cây cao su (Varghese và ctv, 1997; Venkatachalam và ctv, 2002) Năm 2001, Venkatachalam và ctv đã sử dụng thành công marker RAPD trong việc nhận dạng tính trạng lùn cây ở các con lai của RRII118 với các dòng vô tính mang tính trạng lùn tự nhiên (Venkatachalam và ctv, 2001). Năm 2005, An Zewei và ctv đã sử dụng marker RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền và nhận dạng 34 dòng vô tính cao su tại Trung Quốc (An Zewei và ctv, 2005). Năm 2006, Lại Văn Lâm và công sự cũng đã sử dụng marker RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền của 69 kiểu di truyền cao su trong quỹ gen tại Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam (Lại Văn Lâm và ctv, 2006). Viện Nghiên Cứu Cao su Indonesia (IRRI) cũng đang tiến hành thử nghiệm một số marker RAPD cho tính trạng kháng bệnh rụng lá Corynespora, đƣợc qui định bởi sự tƣơng tác át chế giữa 2 gen lặn (Sumarmadji và Darmono, 2004). Ngoài ra, các marker phân tử còn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu sự biểu hiện gen và chức năng của bộ gen cây cao su. 21 22 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1.1 Vật liệu di truyền DNA của 20 con lai giữa nguồn di truyền Wickham truyền thống và Amazon hoang dại (PB260 x RO44/268) trên vƣờn TNLK 04 đã đƣợc đánh giá phân nhóm thành tích sinh trƣởng (vanh thân) và sản lƣợng tuyển non năm 2006 (sau 28 tháng tuổi) theo bảng phân cấp của Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam. (Bảng 4.7). 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm 3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA RNase (Invitrogen). Ethanol 70% và Ethanol 90% (Invitrogen). Sodium Acetate 3M (Invitrogen). TE 1X (Tris-HCl 1M + EDTA 0,5M). DNA extraction buffer. Phenol:chloroform:isoamyl ancohol (25:24:1) (Invitrogen). Isopropanol lạnh (Invitrogen). 3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật RAPD 10X PCR buffer (Invitrogen). 50mM MgCl (Invitrogen). 10mM dNTP’s (Invitrogen). 23 9μM Primer (A18 và OPB12) (Invitrogen). Agarose (Invitrogen). TAE 0,5X (20mM Tris-HCl, 10mM Acetate, 1mM EDTA) (Invitrogen). Loading dye 6X (Promega). Ethidium bromide (Invitrogen). 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm Chày và cối nghiền mẫu. (Đức) Cân điện tử. Eppendorf các loại. Pipette các loại. Đầu típ các loại. Máy ly tâm lạnh. Tủ sấy. Tủ ủ mẫu. Tủ lạnh sâu. Tủ hút khí độc. Tủ cấy vô trùng. Máy điện di nằm. Máy vortex. Nồi hấp khử trùng. Máy đo mật độ quang. Máy khuếch đại DNA. Máy chụp ảnh kỹ thuật số. 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4/2007 đến tháng 7/2007. 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, xã Lai Hƣng, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng. 24 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và ly trích DNA - DNA của các con lai đƣợc tách chiết từ mẫu lá tƣơi (lá còn non, ở giai đoạn có màu xanh nhạt). Các mẫu lá đƣợc lấy trên vƣờn TNLK 04, ghi chú cẩn thận tên giống, ngày lấy mẫu và đƣợc lƣu giữ trong điều kiện lạnh. Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá tƣơi cây cao su dựa trên phƣơng pháp CTAB của Doyle và Doyle (1987) đã đƣợc Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam sửa đổi cho phù hợp với cây cao su đƣợc trồng trong điều kiện ở Việt Nam. 3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu Sau khi ly trích DNA các con lai, tiến hành định tính và định lƣợng DNA mẫu để đánh giá hàm lƣợng cũng nhƣ độ tinh sạch của DNA mẫu nhằm đảm bảo cho việc thực hiện thành công phản ứng PCR. - Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose: nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên dƣới tác động của dòng điện một chiều, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Bên cạnh đó, tính linh động của phân tử còn phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử và nồng độ chất cấu thành gel. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hoá chất có tên là ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Mặt khác, để ƣớc lƣợng khối lƣợng phân tử nucleic acid trong gel agarose, ngƣời ta sử dụng Molecular Weight Ladder (MWL), là một tập hợp các trình tự DNA có khích thƣớc đã biết nên còn gọi là thang DNA (DNA Ladder). - Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang: phƣơng pháp này không thật chính xác nhƣng cho phép ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi đã ly trích. Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang (OD: optical density) ở bƣớc sóng 260 nm cho phép xác định 25 nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tƣơng quan: một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với nồng độ 50 g/ml cho dung dịch DNA sợi đôi, 40 g/ml cho dung dịch DNA sợi đơn. Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid có độ tinh sạch cao. Vì vậy, để kiểm tra độ tinh sạch ngƣời ta đo thêm giá trị OD ở bƣớc sóng 280 nm. Ở bƣớc sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Tuy nhiên, các protein cũng sẽ hấp thụ một phần ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các nucleic acid và do đó sẽ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Thông thƣờng, một dung dịch nucleic acid đƣợc xem là sạch (không tạp nhiễm nhiều protein) khi tỷ số OD260nm/OD280nm = 1,7 – 2,0. Khi đó ta cũng có thể tính nồng độ nucleic acid trong mẫu bằng công thức: DNA (ng/µl) = [(62,9*OD260) – (36,0*OD280) ]* độ pha loãng. 3.3.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA DNA của các con lai và bố mẹ chúng sau khi đƣợc ly trích và kiểm ta độ tinh sạch sẽ đƣợc khuếch đại bằng máy khuếch đại DNA theo tỷ lệ, nồng độ các hóa chất và chu trình nhiệt của Venkatachalam và ctv (2001) Đã đƣợc Bộ Môn Giống - Viện Nghiên Cứu Cao su Việt Nam sửa đổi. 3.3.4 Phƣơng pháp điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại DNA các con lai sau khi đƣợc khuếch đại sẽ đƣợc điện di trên gel agarose bằng máy điện di nằm. Các băng DNA xuất hiện sau khi điện di sẽ đƣợc chụp lại bằng máy chụp gel, các băng DNA sẽ đƣợc ghi nhận, mã hóa sang hệ nhị phân (có mặt hay không có mặt băng DNA) và đƣợc phân tích đánh giá bằng các phần mềm chuyên dụng. 3.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết quả Kết quả phân tích RAPD của các kiểu di truyền đƣợc chuyển đổi sang cơ sở dữ liệu dạng nhị phân (1 hoặc 0 tƣơng ứng với sự có mặt hoặc không có mặt đoạn DNA đƣợc khuếch đại). Các số liệu đƣợc phân tích bằng phần mêm NTSYSpc 2.1 (Numerical Taxonomy System). Biểu đồ ƣớc lƣợng khoảng cách di truyền và phân 26 nhóm di truyền đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp phân nhóm đa biến (Cluster analysis) dựa trên khoảng cách di truyền của Nei (1972) (Nei and Li, 1972) theo phƣơng pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean). Chƣơng 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 LY TRÍCH DNA Nhằm xem xét đánh giá hàm lƣợng cũng nhƣ độ tinh sạch của DNA mẫu, sau khi ly trích, các mẫu DNA đƣợc kiểm tra định tính và định lƣợng để đảm bảo cho việc thực hiện thành công phản ứng PCR. Nhìn chung, các mẫu DNA ly trích đều có độ tinh sạch tƣơng đối cao, đạt yêu cầu cho việc khuếch đại bằng phƣơng pháp RAPD. 4.1.1 Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA trên gel agarose 1% cho thấy phần lớn các mẫu DNA ly trích đều có lƣợng DNA tổng số cao. Điều này đƣợc thể hiện qua hình ảnh so sánh những vạch sáng DNA giữa DNA chuẩn (nồng độ 50 µg/µl) và DNA ly trích từ các con lai xuất hiện trên gel sau khi điện di (Hình 4.1). Hình 4.1: Định tính DNA tổng số sau khi ly trích bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. M 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 229 27 4.1.2 Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang (Optical Density) Các mẫu DNA sau khi ly trích đƣợc pha loãng trong dịch pha loãng DNA (TE) với hệ số pha loãng là 101. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng DNA của bố mẹ và các con lai cho thấy các mẫu DNA ly trích có độ tinh sạch tƣơng đối cao, đảm bảo cho việc phân tích RAPD bằng kỹ thuật PCR với giá trị OD260/OD280 biến thiên từ 1,52 đến 1,81 (ngoại trừ một mẫu có gi