Khóa luận Đánh giá đa dạng di truyền của giống Lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên bằng kỹ thuật RAPD

E) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen sẽ đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (đƣợc đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau. 21 Hình 2.3. Nguyên lí của phản ứng RFLP ( RFLP có ƣu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thƣớc DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lƣợng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ ngƣời nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lƣợng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp primer oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA đƣợc khuếch đại đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide. PCR - RFLP bỏ qua bƣớc lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phƣơng pháp RFLP. 22 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự primer, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. Thông thƣờng, enzyme cắt giới hạn sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thƣờng xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thƣờng xuyên (nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt). Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI - MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Primer của phản ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích. 23 Hình 2.4. Nguyên lí của phản ứng AFLP AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu, không cần biết trƣớc trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài (các primer thƣơng mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. 24 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên. PCR RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các primer đơn ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn. Các đoạn primer oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại đƣợc (dƣới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau sau khi khuếch đại. Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có một sự tƣơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và primer. Các primer dùng trong RAPD thƣờng ngắn vì vậy dễ dàng tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên mạch đơn DNA bộ gen. Do đó tính đa dạng thu đƣợc nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa primer và DNA mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn primer cũng nhƣ sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thƣớc đoạn DNA đƣợc khuếch đại. Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng nhƣ nguyên tắc phản ứng PCR thông thƣờng. Tuy nhiên, vì sử dụng primer ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của primer thấp để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt. Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 300C- 36 0C. Chính vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD thƣờng có độ lặp lại không cao và khó tối ƣu phản ứng. Đây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quả phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhƣ thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần Mg 2+ và chất lƣợng DNA bản mẫu), các thiết bị cũng nhƣ thao tác thí nghiệm. Ngoài ra RAPD là một marker trội do đó những gen điều khiển tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong điện di. 25 Hình 2.5. Nguyên lí của phản ứng RAPD ( Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gen eukaryote là những vùng có tính biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trƣng bởi số lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA. Microsatellite là các VNTR có số đơn vị trình tự lõi từ 1bp - 6bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần. Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp này là rất cao. 26 Hình 2.6. Nguyên lí của phản ứng microsatellite ( Dựa trên trình tự DNA microsatellite đƣợc bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế primer để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gen, trình tự primer sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide. Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bƣớc đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhƣợc điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ƣu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội. 2.5. Đánh giá sƣ ̣đa daṇg di truyền bằng phần mềm NTSYSpc và Winboot 2.5.1. NTSYSpc version 2.1 NTSYS là ứng dụng đƣơc̣ viết trên ngôn ngƣ̃ FORTRAN , bởi Trƣờng Đaị hoc̣ Kansas, 1966. NTSYSpc đƣợc phát triển dƣạ trên NTSYS v à trở thành phần mềm đƣơc̣ sƣ̉ duṇg phổ biến trong phân tích đô ̣đa daṇg di truyền của quần thể dƣạ vào viêc̣ thiết lâp̣ sơ đồ phân nhóm di truyền giƣ̃a các sinh vâṭ . 27 Hình 2.7. Giao diêṇ NTSYSpc 2.10m Kết quả của các kỹ thuâṭ sinh hoc̣ phân tƣ̉ nhƣ RAPD, RFLP, AFLP, microsatellite se ̃đƣơc̣ ma ̃hóa nhi ̣ phân : nếu xuất hiện phân đoạn DNA thì kí hiệu là 1, không thì kí hiệu là 0. Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây dƣṇg ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Dice (1979): Sij = 2a / (2a + u) Trong đó: i, j: tên của mẫu. a: tổng số vi ̣ trí mà cả i và j đều có band . u: tổng số vi ̣ trí mà chỉ i hoăc̣ j có band. Sij: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu i và j. Từ Sij ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa i và j: Dij = 1 – Sij Principal Component Analysis (PCA) (Sneath và Sokal , 1973) đƣơc̣ sƣ̉ duṇg để làm nổi bật sự khác biệt về các tính trạng hình thái trong quần thể , đồng thời để 28 miêu tả mối tƣơng quan giƣ̃a nhƣ̃ng đăc̣ điểm đƣơc̣ đánh giá . PCA đƣơc̣ thƣc̣ hiêṇ bằng chƣơng trình Eigen, Proj và Mxplot của phần mềm NTSYSpc 2.1. 2.5.2. Winboot Felsenstein (1985) đề nghị sử dụng phƣơng pháp boostrap ping để ƣớc lƣợng độ tin câỵ của sơ đồ phân nhóm di truyền . Bootstrapping đƣơc̣ xây dƣṇg dƣạ trên cở sở lăp̣ laị quá trình phân tích trên cùng môṭ dƣ̃ liêụ, nhằm xác điṇh sƣ ̣thay đổi của cây phân nhóm di truyền trong mỗi lần lăp̣ lại. Kết quả chính là xác suất tƣơng đồng về gen của tƣ̀ng cá thể đối với quần thể sau môṭ số lần l ặp lại nhất định. Số lần lăp̣ laị càng cao thì độ tin cậy càng cao . Winboot (Yap và Nelson , 1996) là chƣơng trình xây dựng bootstrap dựa trên dƣ̃ liêụ nhị phân của kết quả của các kỹ thuật sinh học phân tử (RAPD, AFLP, RFLP, microsatellite): nếu xuất hiện phân đoạn DNA thì kí hiệu là 1, không thì kí hiệu là 0. Tƣ̀ đó, xác định khoảng tin cậy của sơ đồ phân nhóm di truyền và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Dice (1979): Sij = 2a / (2a + u) Trong đó: i, j: tên của mâũ. a: tổng số vi ̣ trí mà cả i và j đều có band . u: tổng số vi ̣ trí mà chỉ i hoăc̣ j có band. Sij: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu i và j. 29 Hình 2.8. Giao diêṇ chƣơng triǹh Winboot 2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Ở vào vùng nhiệt đới, TP.HCM cùng với các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ phù hợp với nhiều loại phong lan, địa lan. Ngoài việc nhập nội, lai tạo, nhân giống các loại lan mới, chúng ta còn sở hữu nhiều nguồn gen quý hiếm, độc đáo, mới lạ. Cùng với đội ngũ nghệ nhân, doanh nhân tích lũy ngày càng nhiều kiến thức, kinh nghiệm, đang trực tiếp sản xuất - kinh doanh, còn có các cơ sở khoa học, các trƣờng đại học, viện nghiên cứu, các thành phần kinh tế... vào cuộc, góp phần khai thác tiềm năng, mở ra các khả năng, triển vọng sản xuất, kinh doanh và phát triển các loại phong lan, địa lan… nhằm đáp ƣ́ng nhu cầu về loài hoa này ngày càng lên cao trong và ngoài nƣớc. Đến nay, nghề trồng hoa lan của thành phố đã phát triển ở hầu hết các quận, huyện; đạt diện tích 50ha (năm 2004), 80ha (2005); trong đó, Mokara và Dendrobium đƣợc trồng nhiều nhất vì điều kiện khí hậu phù hợp, lợi nhuận cao (1 ha có thể đạt thu nhập 1 tỉ đồng/năm). Tuy vậy, thành phố chỉ mới đáp ứng khoảng 15% nhu cầu; còn lệ thuộc vào nguồn giống từ nƣớc ngoài. Quy mô sản xuất nhỏ, lẻ; trình độ sản xuất thấp, chƣa tạo ra khối lƣợng sản phẩm đủ sức cạnh tranh trên 30 thị trƣờng xuất khẩu và nội địa. Rõ ràng nghề trồng lan phát triển chƣa tƣơng xứng với khả năng và tiềm lực của một thành phố lớn. Trong quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng , vâṭ nuôi, nhằm nâng cao hiêụ quả kinh tế nông nghiêp̣ sắp tới , Thành phố chủ trƣơng đẩy mạnh chƣơng trình phát triển hoa , cây cảnh , cá cảnh , trong đó phong lan là sản phẩm mũ i nhoṇ . Phấn đấu mở rôṇg diêṇ tích lên 200ha vào năm 2010. Đƣa vào nghiên cƣ́u khảo nghiêṃ các giống mới, lạ, đep̣ phù hơp̣ với khí hâụ nhiêṭ đới ; ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuâṭ và công nghê ̣cao tƣ̀ khâu nhân giống , thiết kế vƣờn , xây dƣṇg nhà lƣới , giá thể cho đến trang bi ̣ tƣới phun , tƣới gioṭ kết hơp̣ bón phân, phòng trừ sâu bệnh thích hơp̣ với tƣ̀ng loaị hoa lan . Tổ chƣ́c hê ̣thống thông tin , tƣ vấn thi ̣ trƣờng, dịch vụ hỗ trơ ̣ngƣời t rồng hoa . Mở thêm các cuôc̣ thi , hôị chơ ,̣ triển lam̃ về hoa lan . Kết hơp̣ các trƣờng Đại học , Viêṇ nghiên cƣ́u , cùng các hội chuyên ngành đà tạo , huấn luyêṇ, bồi dƣỡng kiến thƣ́c chuyên môn , phổ biến kinh nghiêṃ cho ngƣời trồng và kinh doanh hoa lan . Ngoài ra, thành phố đang xúc tiến quy hoạch các vùng chuyên canh về hoa kết hơp̣ du lic̣h sinh thái ở các quâṇ ven và các huyêṇ ngoaị thành . Áp dụng các chính sách ƣu đãi về đầu tƣ (đất đai , cơ sở ha ̣t ầng, vốn, thuế…). Hình thành một trung tâm tổng hợp về hoa lan , bao gồm sản xuất giống , sản xuất hoa thƣơng phẩm, dịch vụ đầu vào , đầu ra. Trong đó sản xuất giống là khâu có ý nghiã quyết điṇh. Tuy nhiên , cho đến bây giờ tì nh hình nghiên cƣ́u khoa hoc̣ trong nƣớc trên đối tƣơṇg này vâñ chủ yếu tâp̣ trung vào các đăc̣ tính nông hoc̣ với các đề tài có hàm lƣơṇg đầu tƣ khoa hoc̣ và công nghê ̣chƣa cao chỉ xoay quanh môṭ số vấn đề bao gồm phát triển các kỹ thuật chọn , tạo, nhân giống (nuôi cấy mô , nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng…), nuôi trồng (chọn giá thể , liều lƣơṇg phân bón… ), liêṭ kê, phân loaị hình thái, tác dụng y học của phong lan và một số rất ít các đề tài nghiên cứ u về khía cạnh sinh học phân tử. Đa số các đề tài nghiên cƣ́u vâñ chƣa chú ý đến công tác bảo tồn, phát huy nguồn giống mặc dù lan bản địa Việt Nam có sự đa dạng sinh học cao và sở hữu nhiều đặc tính quý. 31 2.6.2. Tình hình nghiên cƣ́u ngoài nƣớc Orchidaceae rất đa dạng, có khoảng 25000 - 30000 giống thuần và hơn 150000 giống nhân tạo. Dendrobium là giống phổ biến nhất và đƣợc các nhà khoa học quan tâm đến nhiều do giá trị sử dụng của loài hoa này không chỉ dung làm hoa trang trí mà còn có giá trị dƣợc liệu (Dendrobium loddigesii). Với kỹ thuật công nghệ sinh học phát triển mạnh, các nhà khoa học Singapore, Đài Loan, Thái Lan đã đẩy mạnh nghiên cứu về đối trƣợng này. Nghiên cứu “Phát hiện SSR marker và ứng dụng trong xác định giống lan Dendrobium” của G. H. Yue, L. T. Lam-Chan và Y. Hong là công trình gây đƣợc nhiều sự chú ý. Các tác giả đã xây dựng đƣợc 19 SSR primer cho các giống lan Dendrobium và bƣớc đầu thử nghiệm thành công trên 42 dòng Dendrobium lai. Ngoài ra, công trình còn đề cặp đến việc phân tích mối quan hệ gần gũi của các giống có cùng nguồn gốc để xác minh lại nguồn gốc các giống hiện có ở Singapore. Trong tất cả các primer nhân bản vùng SSR thì primer OA12 cho độ đa hình cao nhất với 33 alleles và OA07 cho độ đa hình thấp nhất với 6 alleles. Kết quả kiểm tra trên 42 dòng thì có 14 SSR marker hoạt động tốt, còn lại 4 primer cho kết quả không ổn định. Cũng cùng nhóm tác giả này, công trình phát triển AFLP vào năm 2003 đã cho thấy kết quả sơ đồ phân nhóm di truy ền giữa phƣơng pháp AFLP và phƣơng pháp SSR là giống nhau. Tuy nhiên, phƣơng pháp SSR cho phép nhận diện những giống lai tốt hơn phƣơng pháp AFLP. Hơn thế nữa, việc ứng dụng lại qui trình để nhận diện giống bằng marker thì phƣơng pháp SSR tốn ít thời gian và dễ dàng thực hiện hơn so với phƣơng pháp AFLP, nghĩa là tính tái sử dụng của phƣơng pháp SSR cao hơn phƣơng pháp AFLP. Bên cạnh sử dụng marker phân tử SSR trên đối tƣợng Dendrobium, cũng có nhiều công trình thực hiện dựa trên kỹ thuật marker RAPD nhƣ công trình của nhóm nghiên cứu Ge Ding trên chi Dendrobium officinale và dựa trên marker ISSR của nhóm Shen J. (trƣờng đại học Nanjing Normal- Trung Quốc) cũng thực hiện trên chi Dendrobium officinale. 32 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Nội dung, thời gian và địa điểm 3.1.1. Nội dung Đề tài đƣợc thực hiện với 5 nội dung chính sau: - Điều tra các giống lan rừng Dendrobium tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái . - Tối ƣu phƣơng pháp ly tríc h DNA tổng số tƣ̀ mâũ lá tƣơi cho đô ̣tinh sac̣h và ổn định cao. - Xây dƣṇg quy trình PCR dƣạ trên kỹ thuâṭ RAPD cho tính đa hình cao . - Phân tích sƣ ̣đa daṇg di truyền của các giống lan rƣ̀ng Dendrobium dƣạ trên primer RAPD. - Phân tí ch sƣ ̣đa daṇg di truyền của các giống lan khảo sát bằng phần mềm NTSYSpc version 2.1 và Winboot. 3.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến 9/2007, tại Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng thuộc Trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Các giống lan Dendrobium thí nghiệm Lan Dendrobium có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Dendrobium có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng, hoặc có đốm to hay nhỏ v.v… Cây có thể mọc ở nhiều vùng địa lý khác nhau ví dụ nhƣ vùng đất rừng thấp nhiệt đới hay đồi núi cao nên vừa chịu khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu khí hậu khô hạn, nhiệt độ trung bình từ 250C đến 380C, trong đó điều kiện khí hậu lí tƣởng nhất cho việc nuôi trồng loài hoa này là từ 280C - 330C. Đề tài đƣợc thực hiện trên 10 giống lan rừng đuợc thu thập từ Nam Cát Tiên và thành phố Hồ Chí Minh: 33 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) Hình 3.1. Các giống lan Dendrobium nghiên cứu trong đề tài a) D. primulinum (Long Tu). b) D. anosmum (Giả Hạc). c) D. farmeri (Thủy Tiên trắng vàng). d) D. thyrsiflorum (Thủy Tiên vàng). e) D. lindleyi (Vẩy Rồng). f) D. chrysotoxum (Kim Điệp). g) D. moschatum (Thái Bình). h) D. heterocarpum (Nhất Điểm Hoàng). i) D. densiflorum (Thủy Tiên mỡ gà). j) D. fimbriatum (Long Nhãn). 34 3.2.2. Thiết bị - dụng cụ - Cối sứ và chày giã (Đức). - Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ). - Cân phân tích 4 số (Ohaus - Mỹ). - Tủ hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc). - Pipet các loại (Nichiryo – Nhật). - Đầu tuýp các loại (Đức). - Máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức). - Máy PCR (Biorad – Thụy Điển). - Máy điện di (Cosmo Bio Co. – Nhật). - Geldoc (Biorad – Mỹ). - Lò Viba (Electrolux – Thụy Điển). - Máy định ôn (Memmert – Đức). - Tủ lạnh các loại (Sanyo – Nhật). 3.2.3 Hóa chất thí nghiệm Primer Bảng 3.1. Primer Primer Tm ( 0 C) Trình tự primer (5’-3’) OPB08 34 GTCCACACGG OPAC10 34 AGCAGCGAGG OPAH13 32 TGAGTCCGCA OPAF16 34 TCCCGGTGAG OPB01 32 GTTTCGCTCC U693 34 GACGAGACGG T3_650 32 TCCACTCCTG V20_1100 34 CAGCATGGTC U109 34 TGTACGTGAC S1384 32 AGGACTGCTC 35 Các hóa chất dùng trong li trích DNA - Dịch trích DNA (extraction buffer EB), 100mL EB bao gồm of 2g CTAB, 28mL 5M NaCl, 20mL 0.5M Tris-HCl, 4mL 0.5M EDTA, 1mL Mercapto ethanol, nƣớc cất 2 lần khử ion đã hấp khử trùng. - TE buffer, bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) và 1mM EDTA (pH 8.0). - 24V chloroform: 1V isoamylalcohol. - Phenol: chloroform (1:1). - Isopropanol. - Sodium acetate. - Ethanol 70% và 100%. - Nitơ lỏng. - Nƣớc khử ion, hấp khử trùng. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR - 10X PCR buffer. - 25mM MgCl2 . - 10mM dNTP. - Taq DNA polymerase. - DNA mẫu (li trích từ lá lan Dendrobium). - Nƣớc khử ion, hấp khử trùng (pH = 8.0). Các hóa chất dùng trong điện di - TAE buffer, 100ml dung dịch TAE 50X gồm: 24.2g Tris, 5.71ml acid acetic, 10ml EDTA 0.5M pH=8. - Agarose. - DNA mẫu (li trích từ lá lan Dendrobium). - Loading dye. - Ethidium bromide. 36 3.3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của đề tài là DNA đƣợc li trích từ lá của 10 giống lan rừng Dendrobium thu thập từ Nam Cát Tiên và thành phố Hồ Chí Minh (số mẫu: mỗi vùng thu thập 10 giống, mỗi giống 1 cây, tổng cộng 20 cây) (Bảng 3.2). *Cách thức lấy mẫu nhƣ sau: Cách chọn mẫu: Chọn những lá tƣơi tốt (nên chọn lá còn non). Lấy mẫu sao có độ đồng nhất cao về vị trí lấy lẫn tuổi thọ mẫu. Chỉ lấy mẫu trƣớc khi tiến hành li trích, mỗi giống lấy khoảng 2 – 5 lá, cho vào nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá . Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây đƣợc lấy mẫu theo phiếu thu thâp̣. Cách bảo quản mẫu đƣa về phòng thí nghiệm: Mẫu sau khi lấy đƣợc cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Nôị dung 1: Điều tra và thu thập các giống lan rừng Dendrobium tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên dƣạ trên đăc̣ điểm hiǹh thái Tiến hành điều tra 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium đƣơc̣ trồng taị Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên . Thu thâp̣ thông tin về các giống theo phiếu soaṇ sẵn qua phỏng vấn trƣc̣ ti ếp 20 chủ nhà vƣờn tại Thành phố Hồ Chí Minh và vùng vành đai rƣ̀ng Nam Cát Tiên. Các nội dung điều tra gồm: - Tên của giống lan thu thâp̣. - Nguồn gốc của giống lan thu thâp̣. - Thời gian các hô ̣đa ̃trồng các giống lan này . - Đặc điểm hình thái của các giống lan . Chỉ tiêu theo dõi: - Các đặc trƣng về lá: chiều dài, chiều rôṇg, số gân lá, màu sắc, dạng lá. - Các đặc trƣng về giả hành: kiểu thân, chiều dài, hình dạng thân. 37 Bảng 3.2. Các giống lan thu thập từ Tp. Hố Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên Mã số Giống lan Nguồn gốc D1.1 Long tu Tp. Hồ Chí Minh D1.2 Giả hạc Tp. Hồ Chí Minh D1.3 Thủy tiên trắng Tp. Hồ Chí Minh D1.4 Thủy tiên vàng Tp. Hồ Chí Minh D1.5 Vẩy rồng Tp. Hồ Chí Minh D1.6 Kim điệp Tp. Hồ Chí Minh D1.7 Thái bình Tp. Hồ Chí Minh D1.8 Nhất điểm hoàng Tp. Hồ Chí Minh D1.9 Thủy tiên mỡ gà Tp. Hồ Chí Minh D1.10 Long Nhãn Tp. Hồ Chí Minh D2.1 Long tu Rừng Nam Cát Tiên D2.2 Giả hạc Rừng Nam Cát Tiên D2.3 Thủy tiên trắng Rừng Nam Cát Tiên D2.4 Thủy tiên vàng Rừng Nam Cát Tiên D2.5 Vẩy rồng Rừng Nam Cát Tiên D2.6 Kim điệp Rừng Nam Cát Tiên D2.7 Thái bình Rừng Nam Cát Tiên D2.8 Nhất điểm hoàng Rừng Nam Cát Tiên D2.9 Thủy tiên mỡ gà Rừng Nam Cát Tiên D2.10 Long nhãn Rừng Nam Cát Tiên Nôị dung 2: Tối ƣu phƣơng pháp ly trích DNA tổng số tƣ̀ mẫu lá tƣơi cho độ tinh sạch và ổn định cao Chọn ngẫu nhiên 4 giống lan rừng Dendrobium thu thập từ Nam Cát Tiên và thành phố Hồ Chí Minh, lấy mẫu lá để khảo sát 3 quy trình li trích DNA. Từ kết quả thu đƣợc, ta tuyển chọn quy trình cho kết quả tốt nhất để tiến hành li trích các giống lan còn lại. Thí nghiệm tiến hành 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức thực hiện với 4 38 thí nghiệm ngẫu nhiên, và mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di và kết quả đo OD. Qui trình 1: Li trích DNA từ mẫu lá tƣơi theo quy trình cải tiến của Doyle & Doyle có cải tiến (Huỳnh Chấn Khôn, 2006). 1. Nghiền 0.5g lá với 1ml dung dic̣h li trích (2% (w/v) CTAB, 1.4M NaCl, 0.2% (v/w) -mercaptoethanol, 20mM EDTA (pH 8.0), 100mM Tris-HCl (pH 8.0)) đa ̃đƣơc̣ đun nóng ở 65oC. 2. Mâũ đƣơc̣ ủ trong 1 giờ ở 65oC. Ly tâm, chuyển phần dịch qua eppendorf mới. 3. Sau đó thêm vào 500μl phenol/chloroform, lắc nhẹ và đều. 4. Ly tâm trong 15 phút 11.000 vòng/phút ở 4oC. 5. Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào isopropanol (dịch nổi: isopropanol = 1:1), để ở -20oC trong 1giờ (hoặc để qua đêm). 6. Rửa lại DNA bằng 400µl ethanol 70o 7. Ly tâm trong 5 phút 11.000 vòng/phút ở 4oC và để khô. Sau đó hòa trong 50µl dung dịch TE 1X. 8. Bảo quản mẫu ở -20oC. Qui trình 2: Li trích DNA từ mẫu lá tƣơi theo quy trình của Doyle & Doyle (1990). 1. Nghiền 0.5g lá tƣơi với 1ml dung dịch li trích ( 2% (w/v) CTAB, 1.4M NaCl, 0.2% (v/w) -mercaptoethanol, 20mM EDTA (pH 8.0), 100mM Tris-HCl (pH 8.0)) đã đƣợc ủ ở 650C. 2. Lấy dịch nghiền đem ủ ở 650C trong 1 giờ. 3. Thêm vào 500µl chloroform: isoamyl alcohol (24:1), li tâm 8000 vòng/phút, 10 phút, 40C. 4. Chuyển dịch trong, thêm 2/3 thể tích isopropanol lạnh, lắc đều, ủ -200C trong 1 giờ (hoặc để qua đêm). Li tâm 8000 vòng/phút, 10 phút, 40C. 5. Thu lấy kết tủa, rửa lại bằng ethanol 70%, li tâm, phơi khô. 6. Thêm 50µl TE 1X (10mM Tris-HCl (pH 8.0) với 1mM EDTA (pH 8.0)). 7. Giữ mẫu ở -200C 39 Qui trình 3: Li trích DNA từ mẫu lá tƣơi theo quy trình của Doyle & Doyle có cải tiến. 1. Nghiền 0.5g lá tƣơi trong nitơ lỏng. Cho mẫu vào eppendoft 1.5ml. 2. Cho 1ml dịch li trích (2% (w/v) CTAB, 1.4M NaCl, 0.2% (v/w) - mercaptoethanol, 4% (w/v) Polyvinylpyrollidone (PVP), 20mM EDTA (pH 8.0), 100mM Tris-HCl (pH 8.0)) đã ủ ở 650C vào, vortex cho hỗn hợp đồng nhất, ủ mẫu ở 650C trong 60 phút. 3. Li tâm mẫu ở 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. 4. Hút 800µl dịch trên bề mặt cho vào một eppendoft mới. Cho thêm 500µl dung dịch phenol-chloroform-isoamyl alcohol vào eppendoft. Lắc nhẹ và đều. Li tâm 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. 5. Hút 500µl dung trên bề mặt cho vào eppendoft mới. Lặp lại bƣớc 4. 6. Hút 300µl dịch trên bề mặt cho vào eppendoft mới. Cho thêm 20µl sodium acetate và 640µl ethanol 100%, lắc đều và để -200C trong 60 phút. 7. Ly tâm thu tủa ở 5000 vòng/phút, trong 30 phút, ở 4oC. 8. Đổ bỏ dịch bề mặt và hòa tan tủa bằng 300µl TE 1X, ủ ở 370C, trong 1 giờ. 9. Thêm 300µl isopropanol lạnh, lắc đều, ủ -200C trong 1 giờ (hoặc để qua đêm). Li tâm 5000 vòng/phút, 30 phút, 40C. 10. Thu lấy kết tủa, rửa lại bằng 400µl ethanol 70%, li tâm 5000 vòng/phút, trong 20 phút, ở 40C. Đổ bỏ dịch bề mặt. 11. Lặp lại bƣớc 10. Phơi mẫu thật khô. 12. Thêm 50µl TE 1X (10mM Tris-HCl (pH 8.0) với 1mM EDTA (pH 8.0)). 13. Giữ mẫu ở -200C. 40 Bảng 3.4. Điểm khác nhau giữa 3 quy trình li trích Quy trình Quá trình nghiền Đệm tách chiết Tác nhân biến tính protein Tác nhân tủa DNA 1 Nghiền trong dung dịch EB CTAB/NaCl Phenol/chloroform (1:1) Isopropanol 2 Nghiền trong dung dịch EB CTAB/NaCl/ - mercaptoethanol Chloroform/isoamyl alcohol (24:1)