Khóa luận Đánh giá hàm lượng Axit Phytic ở một số giống lúa địa phương và một số giống lúa đột biến bằng phương pháp sinh hóa và Microsatellite

t và sự xác định gen thông qua con đƣờng phân lập các nhân bản cDNA trên bắp. Các nhân bản này có chuỗi mã di truyền giống với nhiều inositol photphat kinase từ động vật và nấm men. Ứng dụng kỹ thuật bất hoạt chèn đoạn mã đột biến (Mutator insertion knockout) để điều tra chức năng của gen. Sau khi bất hoạt những gen này, hàm lƣợng axit phytic trong hạt sẽ giảm, hạt sẽ tích lũy myo-inositol, inositol photphat và photphat tự do. Trong sự phát triển của hạt, axit phytic đƣợc tổng hợp từ quá trình đƣờng phân (Gluco-6-P). Enzym Ins(3) P1 synthase (MIPS) xúc tác quá trình Glucose-6- photphate để tạo ra Ins(3) P1. 13 Phân tích clone MIPS ở cây yến mạch (Avena sativa) cho thấy clone này chứa 1936 bp (accession no. AB059557) mã hóa cho polypeptid có số lƣợng amino axit là 510 và có tính tƣơng đồng cao với nhiều loại cây trồng khác. Theo Yoshida và ctv. cho thấy độ tƣơng đồng amino axit giữa protein MIPS ở cây yến mạch với protein MIPS của các cây khác vào khoảng 77 đến 88% (Yoshida và ctv..1999, Hageman và ctv.. 2001). Protein MIPS có trọng lƣợng 56.13 kD. Phân tích bằng phƣơng pháp Northern blot cho thấy gen MIPS biểu hiện cao trong suốt giai đoạn đầu trƣởng thành của hạt và giảm hoạt động ở cuối giai đoạn trƣởng thành. Nồng độ axit phytic cũng tăng từ từ cùng với sự trƣởng thành của hạt. RNA của gen MIPS ít đƣợc phát hiện thấy ở hoa và không phát hiện đƣợc ở thân và lá. Nồng độ RNA MIPS cao nhất đƣợc phát hiện ở những hạt giai đoạn chƣa trƣởng thành của hạt và giảm từ từ theo quá trình phát triển của hạt. Hình 2.5. Phân tích bằng phƣơng pháp Northern-blot ở cây yến mạch. A: biểu hiện của gen MIPS ở hạt chƣa trƣởng thành (1), lá (2) và thân (3) sau 5 ngày trổ hoa. B: Biểu hiện gen MIPS ở hạt đang phát triển lúc 0, 5, 10, 15 và 25 ngày sau khi trổ hoa. (Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm) 14 Hình 2.6. Sự thay đổi nồng độ P tổng, axit phytic và và P vô cơ sau khi trổ hoa ở cây yến mạch. (Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm) Phân tích hàm lƣợng P tổng số, axit phytic cho thấy nồng độ P tổng số ở hoa là 3,51 mg/g trọng lƣợng khô (DW), và tăng từ từ với sự trƣởng thành của hạt (Hình 2.6). Nồng độ P tổng số ở hạt trƣởng thành đạt 10,15 mg/g trọng lƣợng khô lúc 65 ngày sau khi ra hoa (giai đoạn trƣởng thành đầy đủ ). Axit phytic bắt đầu tăng ở giai đoạn đầu và tăng nhanh cùng sự trƣởng thành của hạt với nồng độ 5,97 mg/g trọng lƣợng khô. Nồng độ P vô cơ là 1,58 mg/g trọng lƣợng khô ở hoa và tăng đến 3,3 mg/g trọng lƣợng khô sau 30 ngày trổ hoa, sau đó giảm nhanh cùng với sự tăng lên của axit phytic. Những hợp chất chứa P khác ngoại trừ axit phytic và axit vô cơ thì nồng độ tƣơng đƣơng với nồng độ P vô cơ ở giai đoạn phát triển ban đầu của hạt. Hợp chất P khác chứa P tế bào đƣợc định nghĩa là những hợp chất đƣờng có chứa P, trọng lƣợng phân tử thấp tham gia vào thành phần cấu tạo của màng tế bào. Những hợp chất này là những tiền chất quan trọng trong sinh tổng hợp axit phytic và inositol photphat. P đƣợc hấp thụ bởi cây trồng sẽ đƣợc chuyển trực tiếp vào hạt và đóng vai trò quan trọng cho việc tổng hợp những hợp chất hữu cơ chứa P ở giai đoạn đầu của quá trình trƣởng thành. Những kết quả nghiên cứu này cho thấy enzym MIPS biểu hiện mạnh trong hạt và đóng vai trò sinh tổng hợp axit phytic trong suốt quá trình phát triển của hạt. 15 2.5. Đánh dấu siêu vệ tinh (Microsatellite) Đánh dấu siêu vệ tinh hay SSR đƣợc ứng dụng thành công từ năm 1995 (Mc couch và ctv., 1996). Đó là tập hợp các đoạn chuỗi mã rất ngắn từ 2-10bp. Các đoạn này xuất hiện trên chuỗi mã DNA đƣợc lặp đi lặp lại nhất định, sắp xếp ngẫu nhiên, rất khác nhau đƣợc phân tán khắp nơi trên bộ gen động vật thực vật và con ngƣời (Gunter Kahl, 2001). Những chuỗi mã ngắn này có thể ở dạng lặp lại của hai, ba hay bốn nucleotid và đƣợc xắp xếp ngẫu nhiên trên một dãy của 5-50 bản sao (copy) chẳng hạn nhƣ (AT)29, (CAC)16 hay (GACA)32. SSR xuất hiện rất nhiều trên bộ gen thực vật và có mặt trung bình sau mỗi 6-7kb (Cardle và ctv., 2000). Các đoạn này đƣợc khuyếch đại trong phản ứng PCR nhờ vào mồi xuôi và mồi ngƣợc. Sản phẩm PCR chứa các alen SSR đƣợc tách rời thông qua điện di trên gel agarose hay gel acrylamide. SSR hữu ích trong việc thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý và bản đồ chuỗi mã cơ bản (Sequence-based) trên cây lúa. Ngoài ra SSR còn cung cấp cho nhà chọn giống và nhà di truyền công cụ đáng tin cậy và hiệu quả để liên kết sự khác biệt giữa kiểu gen và kiểu hình . 2.6. Quá trình sinh tổng hợp axit phytic Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic có thể tóm tắt gồm 2 phần sau: sự cung cấp Ins và sự tổng hợp Ins polyphotphat sau đó. Nguồn tổng hợp vòng Ins duy nhất là enzym Ins(3) P1 synthase (MIPS). Enzym này chuyển Glc-6-P thành Ins(3) P1(Loewus và Murthy, 2000). Hoạt tính enzym Ins(3) P1synthase ở những hạt đang phát triển cung cấp Ins cũng nhƣ Ins(3)P1 (Yoshida và ctv., 1999) mà sau đó sẽ đƣợc chuyển thành axit phytic qua sự photphoryl hóa của hai hay nhiều enzym kinase (Biswas và ctv., 1978; Stephens và Irvine, 1990 ). Bƣớc photphoryl hóa Inositol đầu tiên đƣợc xúc tác bởi enzym Inositol kinase. Enzym này cũng xúc tác tạo ra Ins(3)P1 (English và ctv., 1966; Loewus và ctv., 1982). Con đƣờng tổng hợp axit phytic khởi đầu bằng cơ chất ban đầu là Ins, hoạt động của enzym Ins kinase và trải qua nhiều giai đoạn photphoryl hóa thông qua những hợp chất trung gian đã 16 đƣợc miêu tả lần đầu tiên thông qua những nghiên cứu ở nấm nha bào Dictyostelium discoideum (Stephens và Irvine, 1990) và những nghiên cứu sau này ở tập đoàn đơn bào Spirodela polyrhiza (Brearley và Hanke, 1996, 1996b. Con đƣờng sinh tổng hợp ở D. Discoideum tiến hành thông qua những hợp chất trung gian Ins(3) P1, Ins(3,6) P2, Ins(3,4,6) P3, Ins(1,3,4,6) P4, và Ins(1,3,4,5,6) P5. Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở S. Polyrhiza tiến hành thông qua những hợp chất trung gian Ins(3) P1, Ins(3,4) P2, Ins(3,4,6) P3, Ins(3,4,5,6) P4, và Ins(1,3,4,5,6) P5. Những con đƣờng này có điểm chung ở những hợp chất trung gian đầu và cuối. Những Ins photphat này vẫn chƣa đƣợc biết với vai trò là những chất truyền tín hiệu thứ cấp. Sự tổng hợp axit phytic cũng có thể tiến hành một phần qua những con đƣờng liên quan đến những chất truyền tín hiệu bao gồm photphatidylinositol (PtdIns), những photphat trung gian và Ins(1,4,5)P3 (Bƣớc 6 và 7; Van der kayy và ctv., 1995; York và ctv., 1999). Ins photphat bị photphoryl hóa ở mức độ cao hơn axit phytic nhƣ là InsP7 và InsP8, là những hợp chất đƣợc ghi nhận là xảy ra phổ biến ở tế bào eukaryotic (steps 12 và 13; Mayr và ctv., 1992; Menniti và ctv., 1993; Stephens và ctv., 1993; Brearley và Hanke, 1996c; Safrany và ctv., 1999) Những nghiên cứu còn cho thấy (Biswas và ctv., 1978b; Phillippy và ctv., 1994; Brearley và Hanke, 1996b) Ins(1,3,4,5,6) P5 còn đóng vai trò là chất Ins photphat sau cùng trong con đƣờng tổng hợp axit phytic ở tế bào eukaryotic. 17 Hình 2.7. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào eukaryo: (1), D-Ins(3)-P1 (or L-Ins[1]-P1) synthase; (2), D-Ins 3-phosphatase (or L-Ins 1-phosphatase); (3), D-Ins 3-kinase (or L-Ins 1-kinase); (4), Ins P- or polyP kinases; (5), Ins (1,3,4,5,6) P5 2-kinase hay phytic acid-ADP phosphotransferase; (6), PtdIns synthase; (7), PtdIns và PtdIns P kinases, theo sau bởi PtdIns P-specific phospholipase C, và Ins P kinases; (8), D- Ins(1,2,3,4,5,6) P6 3-phosphatase; (9) D-Ins(1,2,4,5,6) P5 3-kinase; (10), D- Ins(1,2,3,4,5,6) P6 5-phosphatase; (11), D-Ins(1,2,3,4,6) P5 5-kinase; (12), pyrophosphate-forming Ins P6 kinases; (13), pyrophosphate-containing Ins PolyP-ADP -phosphotransferases. Nguồn: 18 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1 thánh 8 năm 2005 tại phòng phân tích sinh hóa và phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Bộ Môn Di Truyền và Chọn Giống của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, quận Ô Môn, TP. Cần Thơ. 3.2. Vật liệu Tên của các giống lúa trong thí nghiệm Bảng 3.1. Tên các giống lúa đƣợc phân tích Số thứ tự Tên giống 1 2 3 4 5 6 OM 1490 dạng bố mẹ OMCS 2000 dạng bố mẹ OM 1490 đột biến OMCS 2000 đột biến Lúa mùa Lúa cao sản 3.3. Nguồn gốc vật liệu Các quần thể lúa đột biến, lúa mùa và lúa cải tiến trên đƣợc lấy tại ngân hàng lúa của viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong đó: OMCS 2000, OM 1490, AS996, NTCĐ-5 đƣợc Bộ môn di truyền Viện Lúa Đồng Bằng sông Cửu Long phát triển bằng phƣơng pháp lai tạo và tạo biến dị soma. 19 OM CS2000 đƣợc phát triển từ cặp lai OM1738/MRC19399 và OM 1490 đƣợc phát triển từ cặp lai OM606/IR44592-62-1-3-3 . Đây là hai giống đƣợc chọn số dòng nhiều để đánh giá và phân tích hàm lƣợng axit phytic . Quần thể lúa đột biến OM1490 và OMCS2000 đƣợc tạo ra bằng việc gây đột biến bằng tia gamma với 5 Kr và phát triển thông qua chọn lọc ở các thế hệ M0 M1 , M2, M3 và M4.... AS996 đƣợc phát triển từ phƣơng pháp lai xa và cứu sống phôi mầm IR 64/ O. Rufipogon và đƣợc phóng xạ bằng tia gamma với 3Kr Nàng thơm Chợ Đào -5 đƣợc đột biến bằng tế bào soma và tiếp tục đƣợc đột biến với tia phóng xạ gamma với cƣờng độ 5 Kr . Qui trình phát triển dòng đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ( Lang 2004) OM O OM 606 x IR44592 – 62 – 1 – 3 – 3 OM 1490 M0 M1 M2 M3 M4 Tia Gamma với 5 Kr OM 1738 x MRC 19399 OMCS 2000 M0 M1 M2 M3 M4 Tia Gamma với 5 Kr 20 3.4. Dụng cụ và hóa chất 3.4.1. Dụng cụ Cối nghiền gạo Đĩa 96 giếng Pipetman các loại Máy thanh trùng (autoclave), máy Waterbath, lò vi sóng Tủ lạnh 40 và -200 C Cân Máy ly tâm Máy chạy PCR Máy điện di nằm ngang (Gibco BRL model 4001-Life technologies) Máy chụp hình gel bằng tia UV 3.4.2. Hóa chất 3.4.2.1. Hóa chất phân tích sinh hóa HCL, H2SO4, Amonium Molybdate, Axit Ascorbic, K2HPO4 của Trung Quốc. 3.4.2.2. Hóa chất phân tích phân tử Các hóa chất ly trích DNA bao gồm: Cloroform : isoamylalcohol (24:1), Isopropanol, Etanol 100% và 70%, Dung dịch đệm ly trích DNA (xem phụ lục), SDS, CTAB, NaCl, TE thuộc hãng Merck của Đức Các hóa chất trong chạy điện di: Agarose (Mỹ), Dung dịch TAX 50X và TBE 10X. Các hóa chất chạy PCR : Dung dịch stock của dNTPs (5mM), dung dịch stock của PCR buffer (10X) 21 3.5. Xác định lƣợng photpho trong hạt bằng phƣơng pháp sinh hoá Dùng phƣơng pháp tách chiết từng hạt theo Chen và ctv (1956) thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng. 3.5.1. Phƣơng pháp thực hiện Chuẩn bị pha dung dịch Chen’s : Bảng 3.2. Thành phần các hóa chất trong dung dịch Chen’s Thể tích (theo tỷ lệ) Thành phần 1 1 1 2 6N H2SO4 2.5% Ammonium Molybdate 10% Axit Ascorbic H2O Chuẩn bị thang photpho chuẩn cho thí nghiệm 96 giếng. Thang photpho chuẩn này đƣợc thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng và dùng để so sánh với mẫu phân tích của các dòng lúa khác. Ngoài ra cần lƣu ý là dung dịch Chen’s và thang Photpho chuẩn phải đƣợc pha mới từng ngày. Thang chuẩn Photpho đƣợc pha theo 5 mức sau: Bảng 3.3. Thang photpho chuẩn theo 5 mức Mức µl 1mM K2HPO4 µl HCl 0.4M µl H2O 1 2 3 4 5 0 5 15 30 45 10 10 10 10 10 90 85 75 60 45 22 3.5.2. Tiến hành phân tích Tiến hành bóc hạt lúa để lấy hạt gạo bên trong của các dòng thuộc các giống trên và cho vào từng gói có đánh dấu riêng biệt theo từng dòng.Trong đó bao gồm có 185 dòng OM 1490 đột biến, 165 dòng OMCS 2000 đột biến, 2 dòng bố mẹ của OM 1490 và OMCS 2000, 150 dòng thuộc giống lúa mùa và cao sản. Ngoài những giống trên còn có thêm các giống khác nhƣ lúa hoang, golden rice, huyết rồng, Lpa-1, Lpa-2, Xie Q. Zao dùng làm đối chứng trong phân tích. Những dòng này đã đƣợc đột biến thành công về tính trạng axit phytic thấp. Bƣớc 1: Lấy mỗi dòng 8 hạt, nghiền riêng từng hạt và cho từng hạt đã đƣợc nghiền vào từng giếng theo hàng dọc. Bƣớc 2: Cho vào mỗi giếng 200 µl HCL 0.4M và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 3: Trích từ mỗi giếng 10 µl sang giếng mới, sau đó thêm vào 90µl H2O vào mỗi giếng. Thêm vào 100µl dung dịch Chen’s vừa mới pha. Bƣớc 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tiếng. Kết quả đƣợc so sánh với thang Photpho chuẩn. Hạt càng xanh đậm đƣợc đánh giá là hạt có hàm lƣợng axit phytic càng thấp nghĩa là khoáng vi lƣợng càng cao. Hình 3.1. Thang photpho chuẩn 23 3.6. Đánh giá kiểu gen qua chỉ thị phân tử. 3.6.1. Phân lập DNA từ mẫu lá lúa (Nguyễn Thị Lang, 2002 ) Lấy mẫu lá: Mô lá lúa non, khỏe đƣợc lấy trên từng cá thể riêng lẻ sau khi đã gieo đƣợc 10 ngày cho vào ống tube, ghi nhãn cẩn thận và đƣợc đặt trong thùng đá. Ly trích DNA: Ở đây DNA đƣợc ly trích theo phƣơng pháp CTAB. Có thể tiến hành ly trích DNA theo những phƣơng pháp khác đơn giản hơn, tuy nhiên phƣơng pháp này cho ra kết quả tinh sạch hơn. Giới thiệu phƣơng pháp CTAB 1.Cắt lá nhỏ và nghiền trên cối. 2.Thêm 660µl dung dịch ly trích. 3. Đặt vào đá 30 phút. 4.Thêm 40µl của 20 % SDS. Ủ trong water bath khoảng 10 phút ở nhiệt độ 65oC (nhớ phải lắc). 5. Thêm 100µl của 5M NaCl và trộn thật kỹ . 6.Thêm 100µl CTAB, trộn kỹ. 7. Ủ trong water bath khoảng10 phút ở nhiệt độ 65oC. 8. Chuyển mẫu vào tube mới (1,5ml or 2 ml)(có thể không chuyển). 9. Thêm 900µl cloroform : isoamyl alcohol = 24 :1 và ly tâm 12000 vòng trong 3 phút. 10.Chuyển supernatant vào một tube mới 2.0 và thêm vào 600ul isopropanol. 11. Ly tâm 5 phút (12000rpm) 12. Bỏ supernatant chỉ giữ lại pellet. Rữa cồn 70% trong 2 lần và phơi khô 13. Thêm 50 µl TE vào DNA và trữ ở nhiệt độ -200 C 24 Vai trò của một số chất ly trích 1. Chất phá vỡ màng tế bào : Màng tế bào cấu tạo là lớp lipid kép đƣợc phá vỡ bằng chất tẩy. Ví dụ: SDS (sodium dodecylsulfat, lauryl sulfat, 2- mercaptoethanol. Trong đó 2- mercaptoehanol có tác dụng phá màng mạnh. Trong dung môi chiết luôn hiện diện 2 chất là EDTA và Tris. EDTA: có tác dụng gắn chặt ion Mg++. Vì các enzym nuclease muốn hoạt động cần Mg++làm cofactor, do đó EDTA gắn chặt với Mg++ làm bất hoạt enzym này góp phần bảo vệ DNA. Tris: có tác dụng đệm rất hiệu quả giúp dung môi luôn giữ ở pH 8 vì ở pH đó DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng acid purin rất dễ bị loại thải. 2. Chất loại tạp ( protein, polysaccharid…): Để loại bỏ tạp chủ yếu là protein sử dụng tác nhân biến tính protein ( dung dịch chloroform : isoamyl alcohol = 24:1). 3. Chất tủa DNA: DNA đƣợc thu ở dạng cô đặc vừa bảo vệ chúng khỏi sự phân huỷ của enzym vừa hòa tan lại chúng với nồng độ mong muốn. Có 3 cách tủa: Tủa trong ethanol: đƣợc thực hiện trong điều kiện nồng độ muối cao, thể tích ehanol cao ( 2 – 2,5 lần thể tích mẫu ) ở nhiệt độ thấp ( - 20oC ). Trong điều kiện này hầu hết toàn bộ acid nucleic đƣợc tủa. Tủa trong isopropanol: không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol thấp ( 0,6 thể tích mẫu ). Các DNA trọng lƣợng phân tử thấp không bị tủa do đó có thể loại bỏ chúng khi tủa bằng isopropanol. Tủa bằng CTAB ( cetyltrimethylammonium bromid): 25 CTAB là 1 chất tẩy cation dƣơng. Việc kết hợp CTAB với DNA gồm 2 bƣớc: (1) chất tẩy là ion dƣơng nên sẽ bám lên phần điện tích âm của DNA ( do gốc PO-4 tạo ra). Tác động tĩnh điện của CTAB lên DNA làm giải phóng 1 ion Na +. Vì vậy với nồng độ muối Na thấp hơn 0,7 M thì CTAB kết hợp với DNA, phức này tan trong dung dịch nồng độ muối cao. Ở nồng độ muối cao hơn 0.7 M, CTAB sẽ tạo phức với protein và polysaccharid mà không tạo tủa với DNA. Do đó CTAB rất hữu dụng trong quá trình tinh khiết DNA từ những cơ quan có nhiều polysaccharid (vd: thực vật, vài vi khuẩn Gram (-)) . Có 2 cách sử dụng CTAB:  Để tủa DNA bộ gen: CTAB đƣợc thêm vào dịch trích DNA với nồng độ muối > 0,7 M. Sau khi loại bỏ phức CTAB/polysaccharid/ protein bằng CHCl3 và phenol, DNA đƣợc phục hồi từ phần dịch nổi bằng cách tủa với isopropanol hoặc ethanol.  Sau khi tủa DNA đƣợc thu nhận lại bằng cách ly tâm, cặn đƣợc rửa bằng ethanol 70% để loại bỏ dấu vết muối, CTAB, isopropanol là những chất có thể ức chế phản ứng SSR. 3.6.2. Kiểm tra chất lƣợng DNA DNA đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng cách điện di trên gel agarose 0.8 %.  Gel 0,8% trong dung dịch TAE 1X, đƣợc nấu để hòa tan agarose, để nguội đến nhiệt độ 650C. Đổ gel vào khay có gắn sẵn lƣợc tạo giếng trên gel.  Khi gel cứng, lấy lƣợc ra khỏi gel và đặt gel vào khay điện di trong dung dịch TAE 1X.  Lấy 8-10 l dung dịch DNA trộn với 2-4 l dung dịch lắng (Loading buffer) bơm vào giếng trên gel.  Nhuộm gel trong dung dịch có ethidum bromide 0,5% khoảng 10-20 phút.  Chụp gel dƣới tia UV và đánh giá dựa trên các vạch trắng xuất hiện: Nếu DNA có chất lƣợng thì giống vạch lamda phage chuẩn. Nếu DNA lẫn tạp và bị gãy sẽ thấy có vệt trắng kéo dài trên gel. 26 Hình 3.2. Kết quả DNA đã ly trích đƣợc kiểm tra chất lƣợng trên gel agarose 0,8% 3.6.3. Phân tích SSR Microsatellite là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản, thƣờng xảy ra một cách ngẫu nhiên trong hầu hết các genome thực vật. Marker SSR đƣợc viết tắt từ chữ simple sequence repeats. Do đó SSR có thể đƣợc khuyếch đại trong ống nghiệm bằng phƣơng pháp PCR với tính phát triển của primer theo miền của hai bên trên một locus. Kỹ thuật ứng dụng SSR rẽ tiền hơn kỹ thuật RFLP. Do đó các nhà nghiên cứu tiếp tục dùng SSR thiết kế bản đồ gen trong di truyền, chọn lọc giống bằng SSR, đa dạng hoá các vật liệu di truyền. Phản ứng PCR cho SSR Giống nhƣ phƣơng pháp RAPD, một phản ứng PCR cho SSR baogồm các thành phần sau: 1. Một dung dịch gọi là buffer, chứa Tris-HCl, KCL và MgCl2 2. Bốn deoxynucleotide (dNTPs) 3. Hai oligonucleotide primers 4. DNA 5. Một DNA polymerase Thể tích cần cho một PCR của SSR có thể là 15-50 l là đủ. DNA có thể ly trích từ nhiều phƣơng pháp khác nhau. Tuy nhiên trƣớc khi dùng DNA, điều quan trọng là nồng độ DNA về số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng phải đƣợc kiểm tra. Nồng độ dùng cho SSR từ 25-30ng/ l. Nếu nồng dộ quá cao, chúng ta phải pha loãng trƣớc khi sử dụng. 27 3.6.3.1. PCR dùng cho một phản ứng Bảng 3.4. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR Thành phần Pha dung dịch Thể tích ( l) Nồng độ sau cùng Ghi chú H2O 12,5 PCR buffer 10X 2 1X dNTP 1mM 2 100 M Primerforward 5 M 1 0,25 M Primer reverse 5 M 1 0,25 M Tag polymerse 5unit/ l 0,5 2,5unit DNA 25ng/ l 1 25ng/phản ứng Tuỳ theo nồng độ DNA 3.6.3.2. Phƣơng pháp tiến hành Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: 1.Các thành phần dung dịch dùng thƣờng đặt trong tủ lạnh –200C hoặc –800C. 2.Ghi nhãn cẩn thận trên ống nghiệm 0,5ml hoặc trên micro tap (một loại đặc biệt dùng để chạy PCR ) 3.Chuyển 1 l của mẫu DNA vào ống nghiệm. 4.Chuẩn bị pha dung dịch cocktail cho phản ứng PCR. 6.Dùng pipette lấy 19 l cho mỗi phản ứng trong ống nghiệm có chứa sẵn DNA. 7.Lấy một giọt dầu (mineral oil) phủ trên dung dịch. 28 8. Đặt ống nghiệm vào máy PCR, đậy nắp máy và khởi hành cho máy hoạt động. 9.Chu trình hoạt động của máy nhƣ sau: Bảng 3.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Chƣơng trình Kiểu Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian 1 94 0 C 5phút 2 Chu kỳ 94 0 C 1phút 550C 1phút 720C 2phút 35 3 72 0 C 5phút 4 4 0 C 10.Lấy mẫu ra khỏi máy,khi hoàn thành chu kỳ 11.Dự trữ ở nhiệt độ 4oC 12.Phân tích mẫu trên gel agarose 3% hay gel acrylamide 3.6.3.3. Phân tích mẫu trên gel Agarose Giống nhƣ các phƣơng pháp RAPD, STS. Agarose đƣợc nấu cho tan, với nồng độ 3%. Tùy theo thể tích của khung điện di mà tính toán số lƣợng agarose cho phù hợp. Các bƣớc thực hiện:  Cân 7,5g agarose cho vào bình tam giác thể tích 500ml.  Pha dung dịch TBE 1X  Cho 300ml TBE 1X vào bình tam giác và đun sôi đến thể tích 250ml 29 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá tính trạng axit phytic thấp qua phản ứng sinh hóa 4.1.1. Quần thể lúa mùa và lúa cao sản Qua phân tích 20 cá thể thuộc quần thể lúa mùa, kết quả ghi nhận chỉ có giống nếp trung quốc (nếp tóc) và giống Tám Xoan biểu hiện tính trạng axit phytic thấp. Tuy nhiên mức biểu hiện thấp hơn mức 3 theo thang photpho chuẩn (Hình 4.1 và hình 4.2) Phân tích với 130 giống lúa cao sản để đánh giá hàm lƣợng axit phytic. Kết quả 6 giống có biểu hiện tính axit phytic thấp là OM 2490, OM 4498 , OM 2718 và OM 5731-5 , OM 5731-7, DS 2002. Hình 4.1. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị phosphate tự do (HIP) trên quần thể lúa địa phƣơng và lúa cao sản . Kết quả hình 4.1 cho thấy các cá thể OM 2490, OM 4498 , OM 2718 và OM 5731-5 , OM 5731-7 đều tạo phức màu xanh tƣơng đƣơng với giếng chuẩn thứ 3. Sự biểu hiện này đƣơng đối đồng nhất, tuy nhiên so với các giống đối chứng nhƣ lúa hoang thì sự biểu hiện màu này còn thấp hơn rất nhiều 30 Hình 4.2. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do trên quần thể lúa mùa và lúa cao sản. Các cá thể đƣợc ghi nhận là có hàm lƣợng axit phytic thấp là Nếp Trung Quốc, DS 2002, OM 5731. Các cá thể làm đối chứng là : Lpa-1, Lpa-2, Xi Q. Zao, Lúa Hoang, Golden rice. Qua kết quả phân tích ở hình 4.2, cá thể nếp Trung Quốc có 1 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 2 theo thang photpho chuẩn, 7 hạt còn lại biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3. Cá thể OM 5731có 4 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 3 và 4 hạt còn lại tƣơng đƣơng mức 2. Cá thể DS 2002 do phân tích lập lại 3 lần tuy nhiên nhìn chung mức biểu hiện nhƣ sau: 2 hạt thể hiện mức 2, còn 6 hạt còn lại thể hiện ở mức 3. 31 4.1.2. Quần thể lúa đột biến 4.1.2.1. Quần thể lúa đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ở thế hệ M3. Hình 4.3. Kết quả phân tích sự biểu hiện chất chỉ thỉ photphate tự do (HIP).Trong đó cá thể 54; 77; 78; 80; 154 thuộc quần thể đột biến OM1490. Các cá thể 202; 210 thuộc quần thể đột biến của OMCS2000. Qua kết quả hình 4.3 cho thấy cá thể số 77 đƣợc ghi nhận có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3, 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể 78 có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3, và ba hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể 80 có 5 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 210 có hai hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và hai hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 154 có 5 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 54 có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3. Cá thể số 202 có bốn hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Các cá thể này sau đó đƣợc trồng ở nhà lƣới và tiếp tục đƣợc phân tích ở các thế hệ tiếp theo. 32 Hình 4.4. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do (HIP). Trong đó cá thể 341, 348 thuộc quần thể đột biến OMCS2000. Qua hình 4.4 cho thấy cá thể 348 thể hiện tính axit thấp với 2 hạt trong 8 hạt đƣợc phân tích. Hai hạt này thể hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng ở mức 2 theo thang photpho chuẩn.Tƣơng tự cá thể 341 cũng có 2 hạt có biểu hiện tính axit phytic thấp, tƣơng đƣơng ở mức 2 theo thang photpho chuẩn. Hai cá thể này sau đó đƣợc tiếp tục trồng ở nhà lƣới để tiếp tục đƣợc kiểm tra ở các thế hệ tiếp theo. Hình 4.5. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do (HIP).Trong đó cá thể 165; 6; 3 biểu hiện đặc tính axit phytic thấp. 33 Từ kết quả hình 4.5 chúng tôi ghi nhận kết quả nhƣ sau: cá thể số 165 có một hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 theo thang photpho chuẩn. Cá thể số 6 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng ở mức 3 và hai hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 3 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 16 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 14 có 4 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 tƣơng đƣơng với thang photpho chuẩn. Tuy nhiên các cá thể này biểu hiện tính trạng axit phytic thấp vẫn chƣa đồng nhất và mức biểu hiện tính axit phytic thấp so với đối chứng lúa hoang và Lpa-1 còn thấp rất nhiều. Vì vậy các cá thể này sau đó đƣợc đem ra nhà lƣới và tiếp tục đƣợc chọn ở các thế hệ tiếp theo. Hình 4.6. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị Photphat tự do. Các cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp là :164; 162;168; 1; 81; 170 và cá thể dùng làm đối chứng là lúa vàng và lúa hoang. Các cá thể này thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M3. Kết quả hình 4.6 trên cho thấy cá thể số 1 biểu hiện tính axit phytic thấp nhất và tƣơng đối đồng nhất. Cá thể số 1 có 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 5 hạt còn lại biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 trong 8 h