Khóa luận Đánh giá hiệu quả phòng trừ sâu, bệnh hại bằng chế phẩm sinh học trên cây dưa leo trong nhà màng tại khu nông nghiệp công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh

chạp. Nhện gây hại làm lá cây chuyển thành màu hung đỏ. Tại nơi chúng sống có thể có một lớp mạng nhện bao phủ được tạo bởi các sợi tơ ngắn và mảnh. - Các loại nhện này đều sống trên lá, cuống lá, búp cây, dùng vòi hút dạng kim châm hút dịch cây làm cây sinh trưởng kém, búp cây bị mù xoè nhiều, lá cây bị hại biến màu nâu lốm đốm đến màu tím đồng, trên mặt lá có nhiều bụi bẩn màu trắng xám. Cây bị hại nặng mép lá non cong lên, lá rụng dần, năng suất bị giảm nghiêm trọng. Những năm gần đây một số vùng khô hạn, sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu, trồng nhiều giống chè mới nên tác hại của nhện có chiều hướng gia tăng. - Biện pháp phòng trừ tổng hợp: Trồng và chăm sóc cây khoẻ mạnh để có thể chống chịu được nhện hại như trồng cây che bóng và tủ gốc để tăng độ ẩm, bón phân cân đối và đầy đủ đáp ứng dinh dưỡng cho cây sinh trưởng phát triển mạnh, tưới nước dạng phun mưa cho cây trong mùa khô, thu hoạch đúng lứa, vệ sinh đồng ruộng và diệt cỏ dại. Loại bỏ các cây dại và trồng xa các cây là ký chủ của nhện như cây cao su, cây bông, cây có múi… Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 14 MSSV: 207111028 1.2.5. Bệnh phấn trắng ( Erysiphe cichoracearum) Hình 1.5: Bệnh phấn trắng - Bệnh phấn trắng: Là bệnh hại phổ biến ở nhiều vùng. Bệnh hại chủ yếu trên lá làm cho vàng, khô và rụng dẫn đến cây sinh trưởng, phát triển kém làm giảm năng suất, chất lượng . - Bệnh xuất hiện ở thời kỳ cây trưởng thành gây hại trên các bộ phận của cây như lá, thân quả. Trên lá, vết bệnh là các đốm màu xanh vàng không định hình nằm rải rác ở mặt trên lá. Vết bệnh có thể nằm dọc các gân lá, có màu nâu vàng gây cháy khô lá. Cây bị bệnh nặng, vết bệnh lan sang quả. Ở mặt dưới lá bị bệnh và bên trong quả bị nhiễm bệnh có lớp mốc trắng xám, hạt bị nhiễm bệnh thường bị lép và lớp bột màu trắng ở trên bề mặt. Hàm lượng dinh dưỡng cũng bị ảnh hưởng khi nhiễm nấm. - Nguyên nhân gây bệnh – Đặc điểm phát sinh, phát triển bệnh: Nấm gây bệnh là nấm Peronospora manshurica gây ra.Nguồn bệnh tồn tại trong quả, mô cây bệnh và tàn dư làm Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 15 MSSV: 207111028 ảnh hưởng đến vụ sau. Hạt được trồng trong đất ẩm và cằn cõi cây con dễ nhiễm bệnh từ lớp vỏ ngoài của hạt. - Bệnh phấn trắng thường phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ khoảng 200C. Bệnh gây hại nặng từ tháng 3 đến tháng 5 trong vụ đông xuân vào giai đoạn cây có từ 4 – 5 lá kép. - Bệnh phấn trắng thường phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ khoảng 200C. Bệnh gây hại nặng từ tháng 3 đến tháng 5 trong vụ đông xuân vào giai đoạn cây có từ 4 – 5 lá kép. Biện pháp phòng trừ: Sau khi thu hoạch xong thu gom sạch sẽ những tàn dư của cây , đem ra khỏi ruộng rồi tiêu hủy. Xử lý hạt giống trước khi gieo bằng thuốc bảo vệ thực vật.Ở những ruộng thường bị bệnh gây hại nên phun thuốc phòng trừ bệnh khi bệnh chớm xuất hiện bằng một trong các loại thuốc như: Aliette 80WP 0,25%, Cavil, Ridomil Gold 68 WP, Diboxylin 23 L, 4 SL, 8SL... 1.2. Phòng trừ sâu, bệnh hại trên cây dưa leo - Trước những năm 1990, công tác phòng trừ sâu, bệnh hại trên cây dưa leo chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học. Tuy nhiên, biện pháp hóa học đã gây nhiều ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người và môi trường sống. Vì vậy, hầu hết sản xuất dưa leo của các nước phát triển đang dần đi vào sản xuất an toàn (Caldwell và cộng sự ,2005).Một số loại thuốc hóa học gốc đồng và gốc lưu huỳnh được khuyến cáo sử dụng hợp lý trong chương trình phòng trừ bệnh cây. Đặc biệt, nấm đối kháng Trichoderma (Trichoderma harzianum) ,vi khuẩn đối kháng (Bacillus thuringiensis) được sử dụng rộng rãi để trừ bệnh hại dưa leo ở nhiều nước trên thế giới. Chế phẩm dầu neem cũng được sử dụng để trừ một số bệnh hại (Caldwell và cộng sự , 2005).Trong sản xuất dưa leo hữu cơ, các chế phẩm có nguồn gốc sinh học và thảo mộc được sử dụng rộng rãi để trừ các loài sâu hại như: Chế phẩm neem, dầu khoáng (bịt lỗ thở của sâu chích hút), nhóm cúc tổng hợp (Pytherin), Abamectin… ( Babadoost, M, (2006). Một số loài thiên địch được sử dụng trừ bọ trĩ hại dưa leo trong nàh kinh như: bọ xít đen nhỏ Orius spp, nhện nhỏ bắt mồi… Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 16 MSSV: 207111028 - Ở Việt Nam, việc phòng trừ sâu, bệnh hại trên cây dưa leo chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học. Nông dân phải phun nhiều loại thuốc và phun nhiều lần trong 1 vụ, từ đó gây ra ô nhiễm môi trường và tăng chi phí sản xuất. + Tại Sóc Trăng số loại thuốc trừ sâu sử dụng cho dưa leo là 15 loại và thuốc trừ bệnh là 13 loại , biện pháp phòng trừ chủ yếu là phun thuốc hoá học, nồng độ sử dụng tăng gấp 2-3 lần so với khuyến cáo. + Việc sử dụng thuốc BVTV quá liều lượng ,còn ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường ,trong quá trình phun thuốc có tới 50% lượng thuốc bị rơi xuống đất, một phần bị keo đất giữ lại ,một phần bị rửa trôi gây ra ô nhiễm môi trường nước.Việc sử dụng thuốc bảo vệ gây hậu quả xấu cho sinh quần như tính chống thuốc của dịch hại, sự suy giảm về quần thể sinh vật có lợi,xuất hiện các dịch hại mới. + Trong nghiên cứu về thành phần thiên địch của sâu hại dưa chuột, Hà Quang Hùng (2004) cho rằng, biện pháp sinh học trong quản lý dịch hại tổng hợp được coi là biện pháp bền vững. Trong nghiên cứu của mình về ruồi ăn rệp tác giả đã thu thập được 7 loài ăn rệp. Ấu trùng của ruồi ăn rệp họ Syphidae ăn tất cả các loài rệp muội, cả ấu trùng có thể tiêu thụ 253,86 rệp/6 ngày. + Theo Nguyễn Thị Kim Oanh (1996), rệp muội hại dưa leo có tới 20 loài kẻ thù tự nhiên, trong đó có 2 loài ruồi ăn rệp (Dẫn theo Hà Quang Hùng, 2005). + Để phòng trừ các bệnh hại dưa chuột (nhất là đối với hiện tượng bệnh sương mai giả có triệu chứng tương tự như triệu chứng lá cây đốm vàng, khô lụi) nên kiểm tra lại và chọn cách phòng trừ trước mắt như sau: + Kiểm tra ở giai đoạn cây con đến trước khi cây ra hoa: ở giai đoạn này trên cây dưa chuột trồng vụ xuân hè sớm và vụ thu đông thường bị bệnh sương mai giả. Chúng gây hại mạnh vào khoảng 20-30 ngày sau trồng. Cần theo rõi, phát hiện sớm, khi cần thiết có thể phun thuốc 1-2 lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày. + Ở giai đoạn từ khi ra hoa đến thu hoạch: Các loại bệnh nói trên thường phát sinh rộ, gây hại nặng, có mật độ nhiều, tỷ lệ bệnh cao ở thời điểm cây ra hoa, có quả rộ đến thu hoạch quả đầu tiên. Nếu điều kiện thời tiết thuận lợi cho bệnh trong vụ xuân hè, cần phun thuốc phòng trừ 2-3 lần, mỗi lần cách nhau 5-7 ngày Phun đúng loại thuốc Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 17 MSSV: 207111028 cho từng loại bệnh và phải ngừng phun thuốc để bảo đảm thời gian cách ly an toàn trước thu quả 10 ngày. Cách phun thuốc theo chỉ dẫn trên nhãn bao thuốc. + Thu gom tiêu hủy thân lá cây sau thu hoạch, cầy đất, phơi ải. Lên luống cao, rãnh thoát nước nhanh, chống đất quá trũng, ẩm ướt, đọng nước trước và sau khi trồng. + Luân canh với trồng nước như cây lúa, hoặc các cây họ thập tự bắp cải, su hào, hoặc các cây khác không bị các loài bệnh hại dưa chuột. - Cây dưa leo có khá nhiều sâu hại,vì vậy đã có nhiều biện pháp phòng trừ được nghiên cứu để có thể tạo ra được sản phẩm an toàn và hiệu quả, một trong những biện pháp đang được hướng tới cho các loại cây trồng nói chung là biện pháp phòng trừ tổng hợp. Theo J.E. Funderburk (1993), phòng trừ tổng hợp là một phương pháp phòng trừ dịch hại theo kiểu sinh thái (Dẫn theo Nguyễn Công Thuật, 1995). Trong phòng trừ tổng hợp các loài thiên địch của sâu bệnh hại giữ một vai trò rất quan trọng. Một số thiên địch của sâu hại rau như nhện sói, bọ rùa đỏ, ruồi ăn rệp, bọ xít … chúng có khả năng khống chế sự phát triển của một số loài sâu như sâu khoang, sâu tơ, rầy, rệp… Khi nghiên cứu về vai trò của ruồi ăn rệp muội (Syrphus ribessi Linne) H.V. Weem (1954) cho rằng khi mật độ quần thể sâu non của ruồi ăn rệp lên cao chúng co khả năng khống chế quần thể rệp từ 70- 100%. 1.3. Vài nét về chế phẩm Abamertin và Trichoderma 1.3.1. Chế phẩm Abamectin - Đáp ứng yêu cầu ngày càng tăng về nông sản sạch, việc sản xuất và sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) nguồn gốc sinh học càng ngày càng phát triển. Nhiều loại thuốc BVTV nguồn gốc sinh học thế hệ mới tiếp tục ra đời. Ngoài đặc điểm chung là có độ an toàn cao với người và môi trường, những loại thuốc thế hệ mới này cũng có một số đặc điểm mới so với các thuốc sinh học trước đây - Chất Abamectin và Amamectin + Là các chất được chiết xuất trong môi trường nuôi cấy loài xạ khuẩnStreptomyces avermitilis. Hai chất này có cấu tạo hóa học và tính chất gần giống nhau, trong đó Emamectin có hiệu lực diệt sâu mạnh hơn. Thuốc có tác động diệt sâu qua đường tiếp xúc, vị độc và có khả năng thấm sâu, hiệu lực diệt sâu nhanh và mạnh không thua kém Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 18 MSSV: 207111028 thuốc hóa học. Do hiệu lực mạnh nên lượng hoạt chất sử dụng rất thấp, chỉ từ 3-5 g/ha, trong đó Emamectin mạnh hơn Abamectin. Thuốc có phổ tác dụng rộng, phòng trừ được nhiều loại sâu miệng nhai, sâu chích hút và nhện hại cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt sử dụng cho rau, hoa cảnh, các cây ăn quả và cây công nghiệp có giá trị cao. + Ở nước ta hiện nay các hoạt chất trên được đăng ký với nhiều tên thương mại của nhiều đơn vị và được sử dụng rất phổ biến, trong đó có các thuốc Đầu Trâu Bi-sad, Đầu Trâu Merci, Proclaim… Thuốc Đầu Trâu Bi-sad 0,5ME chứa 0,5% Emamectin dưới dạng siêu nhũ, dùng phòng trừ rầy nâu, sâu cuốn lá lúa, sâu tơ bắp cải, sâu vẽ bùa cam… pha liều lượng 10-15ml/10l nước, hiệu lực diệt sâu sau 1 ngày đã đạt trên 75%. - Hỗn hợp Abamectin và dầu khoáng. + Dầu khoáng có tác dụng bít lỗ thở làm sâu ngạt thở mà chết, ngoài ra còn xua đuổi sâu trưởng thành không đến đẻ trứng và làm ung trứng. Chế phẩm dầu khoáng dùng hòa nước phun lên cây để trừ sâu (gọi là Petroleum Spray Oil) ngày càng sử dụng phổ biến. Đặc biệt trong phương pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây có múi, dầu khoáng được coi là sản phẩm chủ lực ở nhiều nước. Dầu không độc hại với người và môi trường. + Chất Abamectin hỗn hợp với dầu khoáng làm tăng hiệu lực diệt sâu do tác động bổ sung và khả năng loang trải, bám dính tốt của dầu, cũng được dùng để phòng trừ các loại sâu miệng nhai, sâu chích hút và nhện hại cho nhiều loại cây trồng. Thuộc nhóm này có các chế phẩm Đầu Trâu Bihopper, Feat… Thuốc Feat 25EC chứa 0,5% chất Abamectin và 24,5% dầu khoáng, dùng phòng trừ bọ trĩ hại dưa hấu, dưa leo, dòi đục lá cà chua, nhện đỏ cam, quýt… pha liều lượng 12-15ml/10l nước. Cây cam, quýt được phun thuốc Feat cho trái bóng đẹp và chất lượng tốt hơn rõ rệt. v Cơ chế tác động - Thuốc có khả năng thấm sâu qua lớp biểu bì lá để diệt các loài sâu nhỏ nằm phía dưới lá như nhện đỏ, bọ trĩ, rầy, rệp, sâu vẽ bùa, dòi đục lá.. - Cơ chế chính : Avermectin tác động trên tế bào thần kinh và tế bào cơ, ngăn sự truyền tín hiệu từ những nơron trung gian đến kích thích những nơron vận động, do GABA là chất truyền thần kinh bị tắc nghẽn. Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 19 MSSV: 207111028 - Xảy ra trong những tế bào thần kinh và tế bào cơ yếu Avermectin cũng như Ivermectin liên kết đặc hiệu đến kênh glutamate-gated chloride mở kênh, gia tăng tính thấm của màng tế bào dẫn tới sự đi vào những Ion clo, dẫn tới sự phân phân cực của của tế bào cơ và tế bào thần kinh và không còn trả lời những kích thích đầu vào. - Kết quả sự phân cực dẫn tới tình trạng liệt và chết trực tiếp hoặc gián tiếp do đói. Vài kết quả nghiên cứu cho thấy rằng vai trò khử cực hơn là vai trò phân cực của Avermectin trên kênh glutamate-clorua . Hình 1.6: Cơ chế tác động của Abamectin Sự liên kết đặc hiệu của glutamate hay avermectin đến kênh glutamate-gated-clorua dẫn đến mở kênh và ion clorua đi vào gây nên sự phân cực . Hình 1.7: Cơ chế gây độc Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 20 MSSV: 207111028 1.3.2. Chế phẩm Trichoderma - Nấm đối kháng là những thành viên quan trọng trong hệ vi sinh vật ( pomch và công tác viên, 1920). Chúng thường tiết ra các men kháng sinh gây độc đối với các nâm gây bệnh hoặc nấm kháng cạnh tranh điều kiện sống với các nấm gây bệnh. Sự phân biệt của chúng dựa vào điều kiện địa lý, tình trạng đất , dinh dưỡng và các điều kiện về sinh trưởng và phát triển và thảm thực vật trong từng khu vực. Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự phát triển của nâm gây bệnh , giúp cây hồi phục sinh trưởng và phát triển. Một số loài nấm đối kháng được tìm thấy như: Penicillin axalicum, P.Vermiculata, P.Chregsogtum , Trichoderma sp, là đối kháng của nấm gây bệnh: Fusarium, Pythium Rhizoctonia solani...( Martin và các cộng tác viên ,1995) v Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma: - Sự đối kháng của nấm trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Vào năm 1932, Weidling đã mô tả hiện tượnh nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh nên đặt tên cho hiện tượng là “ giao thoa sợi nấm” ( cnyder,1976). Hiện tượng giao thoa gồm ba giai đoạn như : + Sợi nấm Trichoderma vây quanh nấm gây bệnh. + Sau sự bao quanh, sợi nấm trichoderma thắt chặt đấn các sợi nấm gây bệnh. + Cuối cùng sợi nấm Trichoderma đâm xuyên qua các sợi nấm gây bệnh làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bị phân hủy dẫn đến nấm bệnh bị chết. Sau này khi quan sát dưới kính hiể vi thì hiện tượng trên được mô tả như sau: tại những điểm nấm Trichodrma tiếp xúc với nấm gây bệnh đã làm cho nấm gây bệnh teo lại và bị chết ( Dubey,1995). Ngược lại ở những chỗ nấm không tiếm xúc với nâm gây bệnh thì nấm vẫn chết mặc dù không tiếp xúc với Trichoderma. Từ đó Agrowcal và các cộng sự (1979,1996) đã khẳng định rằng Trichoderma có khả năng tiết ra chất gây độc làm chết các loại nấm gây bệnh. v Các hệ enzyme trao đổi của Trichoderma - Trichoderma có thể sinh rất nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease, … để phân hủy xác thực vật và tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh của chúng. Sau đây là một số hệ enzyme điển hình ở Trichoderma. Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 21 MSSV: 207111028 · Hệ enzyme cellulase: - Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D-glucose nối nhau bởi liên kết beta-1,4- glycosidic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng carbon ở rất nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase. - Hệ enzyme cellulase ở Trichodermaspp được phân thành ba lớp: + Beta-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) giải phóng đơn vị cellobiosyl từ chuỗi cellulose. + Endo-1,4-D-glucanase phân cắt liên kết glucosidic bên trong cấu trúc cellulose. + Beta-1,4-D-glucanase phân cắt cello-oligosaccharide thành glucose khử. + Quá trình thuỷ phân cellulose có sự phối hợp của ít nhất 1 hai + Enzyme chlobiohydrolase, hai enzyme endoglucanase và một enzyme beta- glucosidase (Huiet al. 2001), Trichoderma reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellulase, Trichoderma hazianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả khi sử dụng để kiểm soát đối với Pythium, chủng này được biết cũng tạo nhiều loại enzyme cellulase. · Hệ enzymechitinase: - Chitin l polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu trúc polyme ở nấm và côn trùng, công thức hóa học: [C8H13NO5]n. - Công thức cấu tạo: + Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên, chitin là chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật. + Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, alcol, dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật. + Enzyme chitinase l thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2 đơn vị: beta-1,4-N-acetylglucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân thành 3 lớp (Sahai và Manocha, 1992): Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 22 MSSV: 207111028 + Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetylchitobiose. + Endochitinase: phân cắt liên kết bền trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacet lchitobi- - ose; endochitinase được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình kí sinh nấm. + Beta-1,4-N-acetylglucosaminedase: phân cắt chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose thành GlcNac monomer. + Glucosamine là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của nhóm amino. + Người ta đã tinh chế được rất nhiều enzyme chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N-acetyl-b-D-glucosaminidase có kích thước 70 – 73 kDa. Ngoài ra cũng có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz và cộng sự, 1992), chitobiosidase kDa (Harman và cộng sự, 1993), exochitinase 28 kDa (Dean và cộng sự, 1998), beta-1,4-N-acetylglucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong việc gây ra sự biểu hiện của các enzyme thủy phân chitin khác nhau nhưng chưa được tinh chế (Harman và cộng sự, 1995). + Enzyme chitinase của Trichoderma spp được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như beta- glucanase, sự phối hợp với các enzyme phân giai chitin và glucan đã dẫn đến sự tăng cường hoạt động thủy phân. Tuy nhiên, quan trọng hơn là chitinase làm tăng hiệu quả kháng nấm của các hợp chất không có bản chất enzyme. Theo báo cáo của Lorito và các cộng sự (1994), cho biết có sự phối hợp hoạt động giữa các enzyme thủy phân chititn với các hợp chất tự nhiên cũng như tổng hợp có ảnh hưởng lên màng tế bào (MAC). v Hệ enzyme beta - glucanase - Beta – glucan trong vách tế bào nấm thường ở dạng beta-1,3-glucan và phần nhánh là dạng beta-1,6-glucan, beta-glucanase cũng là một hệ enzyme quan trọng của Trichoderma spp trong đặc tính kí sinh nấm, gồm 2 lớp enzyme chính: beta-1,3-glucannase v beta-1,6- glucanase. Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 23 MSSV: 207111028 - Beta-1,3-glucanase:là enzyme phân cắt liên kết O-glycosidic của beta-1,3-glucan nhờ 2 cơ chế: - Exo-beta-1,3-glucanase phân cắt giải glucose ở cuối chuỗi liên kết polyme. - Endo-beta-1,3-glucanase cắt lin kết beta ở vị trí bất kì trong chuỗi polysaccharide, giải oligosaccharide. - Trichoderma spp. phân giải beta-1,3-glucan thường kết hợp giữa hai hoạt tính exo và endo-1,3-glucanase, beta-1,3-glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh và ký sinh nấm, ngoài ra beta-1,3-glucanse giúp thực vật chống lại mầm bệnh. - Các vách tế bào nấm bệnh khác nhau cho chất tạo ra những mức độ hoạt tính khác nhau của enzyme beta-glucanase, bằng chứng trực tiếp cho thấy sự liên quan của beta- glucanase đối với sự ký sinh đã được chứng minh bởi Lorito và cộng sự (1994), và đã tách chiết invitro được một endo-beta-1,3-glucanase 78 kDa có khả năng ức chế sự nảy mầm của một số bào tử khi phối hợp với một GlcNAcase. Ở một số chủng khác nhau như chủng T – 24, người ta cũng tách chiết được một endo-beta-1,3-glucanase có kích thước tương tự, có khả năng ức chế sự phát triển của Sclerotium rofsii khi kết hợp với một ensochitinase 43 kDa (El-Katatny v cộng sự, 2001), T. har CECT 2413 cho thấy có thể tạo ra ít nhất enzyme beta-1,3-glucanase ngoại bào, Lora và cộng sự (1995) đã tạo dạng gen và cDNA của một beta-1,6-endoglucanase có kích thước 43 kDa, có thể ức chế sự phát triển của nhiều nấm bệnh khi phối hợp với các enzyme thủy phân khác. - Beta-1,6-glucanase: trong điều kiện đặc biệt, Trichoderma spp tiết beta-1,6- glucanase, enzyme này phân cắt liên kết beta-1,6-glucan trong vách tế bào nấm. v Hệ enzyme protease - Theo Delgado và Jarana (2000) khi khảo sát trên Trichoderma harvey đã xác định nhiều loại protease khác nhau tùy thuộc điều kiện môi trường có pH thấp và bổ sung chitin, glucose, amon, … T.har tiết ra protease acid như là tác nhân điều hòa, để đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase, glucanase, cellulase, ngược lại protease có tính base hoặc trung tính được T.har sinh ra trong môi trường có nguồn C khó bị phân hủy như vách tế bào nấm. Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 24 MSSV: 207111028 - Người ta đã tách chiết được một protease 42 kDa không nhạy cảm với pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzyme cellulase từ T.reesei QM 9414 trong điều kiện tạo cellulase (Haab v cộng sự, 1990). - Trong một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000), một protease 73 kDa thuộc nhóm protease serin đã được tách chiết từ việc nuôi cấy T. har. - Protease của Trichoderma spp có vai trò trong việc tấn công ký chủ bằng cách thủy phân protein vốn l một phần của bộ khung vách tế bào. v Vai trò của nấm Trichoderma trong việc phòng trị bệnh cây · Mối tương tác giữa nấm Trichoderma và tác nhân gây bệnh cây - Trichoderma (giai đoan hữu tính là chi Hypocrea) là loại nấm sinh sản vô tính được tìm thấy trong đất của mọi vùng khí hậu. Loài nấm này có tốc độ sinh phân hủy vách tế bào (cell wall degrading enzymes, CWDEs) như: cellulases, chitinases, glucanases... đồng thời cũng là nhà máy sản xuất kháng sinh quan trọng. Đa số các dòng nấm Trichoderma sống quanh rễ được ứng dụng trong nông nghiệp đều có khả năng phân cắt Hình 1.8: Hoạt động tương tác giữa nấm ký sinh Trichoderma và nấm ký chủ. Giai đoạn 1: Nấm ký sinh tiết ra các hợp chất polymers tiến đến ký chủ. Giai đoạn 2: Các sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp (do vách tế bào ký chủ bị phân hủy) tiến đến ký chủ và hoạt hóa gene hoạt động của nấm ký sinh (trích từ Vinale &ctv., 2008). Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 25 MSSV: 207111028 các carbohydrates, chlor phenols và các loại nông dược chứa xenobiotic (Harman & Kubicek, 1998; Harman & ctv., 2004). Cơ chế tác động chính của nấm Trichoderma là ký sinh (Harman & Kubicek, 1998) và tiết ra các kháng sinh (Sivasithamparam & Ghisalberti, 1998) trên các loài nấm gây bệnh trưởng nhanh, sản sinh nhiều bào tử và là nguồn sản xuất các loại enzymes. - Quá trình ký sinh của nấm Trichoderma diễn ra khá phức tạp, bao gồm việc nhận ra ký chủ, tấn công, xâm nhập và tiêu diệt. Trong suốt tiến trình này, nấm Trichoderma tiết các enzymes phân hủy vách tế bào (CWDEs) thủy phân vách tế bào của nấm ký chủ thành các oligomers đơn giản hơn (Kubicek & ctv., 2001; Woo & ctv., 2006). Tác động này là do khả năng cảm ứng của chúng đối với các phân tử tiết ra từ sự hiện diện của ký chủ để tiết ra các enzymes phân hủy (Harman & ctv., 2004). - Các loài nấm Trichoderma spp. đối kháng hữu hiệu đều chứa nhiều loại enzymes phân hủy nên giử vai trò quan trọng trong việc phòng trừ sinh học (Harman và Kubicek, 1998; Kubicek & ctv., 2001). Lorito (1998) đã tinh chế và khảo sát đặc tính của các enzymes phân hủy vách tế bào (CWDEs) của các dòng nấm Trichoderma. Kết quả cho thấy dù thử nghiệm riêng lẻ hay phối hợp, các protein này đều có khả năng đối kháng các loài nấm bệnh với phổ rất rộng trên các chi Rhizoctonia, Fusarium, Alternaria, Ustilago, Venturia, Colletotrichum và ngay cả với các loài thuộc lớp Oomycetes như Pythium và Phytophthora (với vách tế bào bị thiếu chitin). - Việc áp dụng các loài vi sinh đối kháng để phòng trừ sinh học tõ ra có nhiều lợi ích trong nông nghiệp vì các tác nhân đối kháng này tiếp tục sinh sản và phát triển sau khi áp dụng. Tuy nhiên, việc áp dụng cần chọn các dòng chuyên biệt phù hợp cho môi trường phát triển như nhiệt độ, pH, ẩm độ… (Lorito và Scala, 1999). Các tác nhân này sẽ tiết CWDEs khi có nguồn carbon như mono-hay polysaccharides, keo chitin hay khi có tế bào nấm bệnh. Trong nhiều trường hợp, sự phối hợp giữa các loài Trichoderma mang nhiều enzyme đối kháng đã cho hiệu quả cao hơn trong việc phòng trị bệnh cây, ngay cả khi so với các loại thuốc trừ bệnh tổng hợp (Baek & ctv., 1999; Carsolio & ctv., 1999). - Ở nấm Trichoderma spp., người ta đã tìm được 18 loại kháng sinh do chúng tiết ra (Vinale & ctv., 2008). Các kháng sinh có trọng lượng phân tử cao và các peptaibols đều Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai Huỳnh Khắc Luyện 26 MSSV: 207111028 phân cực và có ảnh hưởng nhiều đến hoạt động tạo khuẩn ty của các vi sinh vật. Khi khảo sát loài T. harzianum tiết ra β-glucanases ký sinh trên nấm bệnh, Lorito & ctv. (1996) đã xác định được chất kháng sinh thuộc nhóm peptaibols ức chế khả năng tổng hợp β- glucans của nấm ký chủ, làm chúng không thể tái tạo được vách tế bào, giúp enzyme β- glucanases hoạt động hiệu quả hơn. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung thí nghiệm - Điều tra sâu tình hình sâu,bệnh hại