Khóa luận Đánh giá hiệu quả tác dụng của một vài hợp chất tự nhiên chiết xuất từ thảo mộc trong điều trị bệnh phát sáng do Vibrio harveyi trên tôm sú (Penaeus monodon)

giai đoạn tiền ấu trùng (Zoae, Mysis) (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001). Dấu hiệu mô học Tôm bị bệnh nặng, soi dưới kính hiển vi mẫu xoang bạch huyết và mẫu ruột thấy dày đặc những vi khuẩn di động, cơ quan chủ yếu nhiễm khuẩn là gan tụy (Lý Thị Thanh Loan, 1999). Tôm giống dưới 45 ngày nuôi bị nhiễm bệnh phát sáng có biểu hiện tế bào ống bên trong gan tụy bị phá hủy. Chỗ lõm giữa các tế bào hình ống bị bịt kín bởi các bạch cầu và các tế bào sợi. Tế bào biểu mô bị hoại tử và vi khuẩn tập trung từng đám trong Lumen. Quan sát ở những tôm nhỏ hơn thì thấy sự phá hủy ở các mô nhiều hơn (Lý Thị Thanh Loan, 1999). 2.2.3. Điều kiện phát sinh bệnh Bệnh phát sáng trên tôm thường xảy ra trong tất cả các giai đoạn (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001).  Vibrio phát sáng xâm nhập vào bể ương qua trứng tôm, tôm mẹ, thức ăn và dụng cụ sản xuất. Bệnh có thể lây nhiễm từ các trại giống, ao ương sang ao nuôi thịt. Phát triển mạnh trong những ao có hàm lượng chất hữu cơ cao, chất thải đáy ao tích tụ nhiều. Thường thấy ở những vùng có độ mặn cao, phát triển mạnh nhất ở độ mặn 30 – 35‰. Ở dưới 5‰ hầu như không thấy bệnh này xuất hiện. Bệnh có thể xuất hiện ở pH từ 7,5 – 9, bệnh có thể xuất hiện khi mất tảo đột ngột hay do môi trường biến động mạnh... Các vi khuẩn gây bệnh có thể có trong nguồn nước cấp vào ao nuôi (Harris và ctv, 1996). 2.2.4. Khu vực phân bố bệnh Bệnh phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới. Đặc biệt tại các trại sản xuất tôm giống. Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa sông và vùng nước lợ. Điều này được chứng minh từ kết quả phân lập vi khuẩn của các mẫu nước cấp vào và thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao nuôi tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Fraser, 2005). Theo một số tài liệu của Phillipine, Thái Lan và Indonesia, Vibrio gây bệnh phát sáng cũng được tìm thấy trong nước biển vùng ven bờ, nhất là những nơi có hàm lượng chất hữu cơ cao và có nhiều xác động thực vật chết sau chu kỳ “nở hoa”. Số lượng vi khuẩn Vibrio thường tăng vọt trong và sau mùa mưa, nhất là các tháng 10 – 12. Vì vậy vùng gần bờ biển cũng được xem là nguồn nhiễm chính (Lavilla – Pitogo và ctv, 1998). 2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát sáng trên tôm 2.3.1. Phương pháp vi khuẩn học Nuôi cấy tăng sinh khối trong môi trường canh TSB, phân lập giống thuần trên môi trường TCBS, quan sát chọn những khuẩn lạc phát sáng trên đĩa cấy, cấy tăng sinh các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường BHIA, sau đó định danh vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa theo khóa phân loại Bergey (Jonh và ctv, 1994). Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy nhiên nó có nhược điểm là mất nhiều thời gian để thực hiện. 2.3.2. Phương pháp mô học Tìm thấy các vi khuẩn hình que trong các mẫu mô tôm bệnh khi quan sát dưới kính hiển vi. Phương pháp này đòi hỏi người thực hiện phải có chuyên môn và kỹ thuật cao (Lý Thị Thanh Loan, 1999). 2.3.3. Phương pháp miễn dịch học Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V. harveyi trên tôm. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể. Phương pháp này có thể xác định nhanh V. harveyi từ mẫu tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả các dòng V. harveyi (Robertson và ctv, 1998). 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Hiện nay có thể dùng kỹ thuật khuếch đại DNA để chẩn đoán nhanh bệnh do Vibrio trong vài giờ mà không phải mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho V. harveyi (Ruiz và Smith, 2005) Tuy phương pháp này cho phép xác định nhanh tác nhân gây bệnh nhưng chi phí để thực hiện lại quá tốn kém và đòi hỏi phải đầu tư trang thiết bị cao. 2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm Ngày nay, việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm đã kéo theo các tác động xấu ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe của con người. Theo xu thế phát triển nghề nuôi tôm trong tương lai, vấn đề chất lượng sạch của tôm nuôi ngày càng được quan tâm đến, kéo theo là việc người ta phải tìm ra các phương pháp mới để thay thế cho các loại hóa chất và kháng sinh trong việc điều trị bệnh cho tôm. Từ rất lâu, ông cha ta đã biết sử dụng nhiều loại thực vật thuộc các loài thảo dược trong thiên nhiên trong việc trị bệnh cho người và các loài vật nuôi. Đây được xem là một nguồn cung cấp dược liệu quý và phong phú cho nền y học của nhân loại. Nhận thấy được tiềm năng của các cây thảo dược, nhiều nhà khoa học đã tập trung vào nghiên cứu các hợp chất chiết suất từ thảo dược với hy vọng tìm ra các bài thuốc mới dùng trong việc điều trị bệnh cho tôm. Thấy được tiềm năng thay thế cho các loại hóa chất và kháng sinh của thảo dược, nhiều công trình nghiên cứu bước đầu đã được tiến hành nhằm tìm ra các hợp chất thảo dược có khả năng ngăn chặn được bệnh phát sáng trên tôm do Vibrio. Năm 2003, Wijayati bước đầu đã sàng lọc và kiểm tra hoạt tính diệt khuẩn của các dịch chiết bằng methanol từ một số loài cây thảo dược đối với 2 loài V. paraheamotilicus và V. harveyi bằng phương pháp kháng sinh đồ. Kết quả cho thấy các dịch chiết bằng methanol của 3 loại thảo dược là cây sả (Cymbopogon citrates), cây Neem (Azadirachta Indica) và cây ổi (Psidium guajava) đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các mầm bệnh kể trên. Nồng độ tối thiểu chống lại V. harveyi của các dịch chiết từ lá của cây sả, cây Neem và cây ổi là 128 ppm, 512 ppm và 2,048 ppm. Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy cây sả, Neem và ổi có thể được sử dụng để điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Cũng trong năm này (2003), Sivaram và ctv đã tiến hành sàng lọc và đánh giá hiệu quả của một số dịch chiết bằng methanolic từ các loại thảo dược (như xuyên tâm liên (Andrographus panicullata), nhục đậu khấu (Myristica fragrans), hương nhu tía (Ocimum sanctum), cà dại quả đỏ (Solanum surattense), bàng hôi (Terminalia bellirica), sầu đâu (Azadirachta indica) và một số cây thảo dược khác) trong việc chống lại V. harveyi. Và kết quả đã cho thấy các dịch chiết từ hương nhu tía và nhục đậu khấu cho các vòng kháng khuẩn có thể so sánh với các chất kháng sinh thông dụng. Từ các kết quả nghiên cứu ban đầu, thảo dược trong tương lai có thể được xem là một trong những giải pháp hiệu quả và bền vững cho việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Tuy nhiên, đây chỉ là những kết quả ban đầu, để có thể đưa chúng vào sử dụng trong thực tế cần phải có những nghiên cứu khác kỹ hơn để đánh giá hiệu quả tác động của chúng trong thực tiễn sản xuất, cũng như nắm được cơ chế tác dụng và kiểm tra tính an toàn của chúng đối với tôm. Sau đây là đặc điểm của vài loài thảo dược mà bước đầu đã được nghiên cứu và xác định là có khả năng điều trị bệnh phát sáng trên tôm: 2.4.1. Nhục đậu khấu Nhục đậu khấu còn gọi là nhục quả, muscade (Pháp), nutmeg (Anh). Tên khoa học là Myristica fragrans thuộc họ Myristicaceae. Nhục đậu khấu thuộc loại cây to, cao 8-10m. Toàn thân nhẵn. Lá mọc so le, xanh tươi quanh năm. Màu hoa vàng trắng. Quả hạch, hình cầu hay quả lê, màu vàng, đường kính 5-8cm, khi chín nở theo chiều dọc thành 2 mảnh, trong chứa một hạt có vỏ dày cứng, bao bọc bởi một áo hạt bị rách màu hồng. Nhục đậu khấu là loại cây ưa khí hậu nóng ẩm, được trồng nhiều ở vùng nhiệt đới. Trong cây có chứa một loại tinh dầu thơm, dễ bay hơi, trong đó Myristicin (C11H12O3) chiếm 4% thành phần hóa học của tinh dầu này. Về mặt cấu trúc hóa học, Myristicin giống tương tự 3 loại ether thơm khác là eugenol, isoeugenol và safrol. Hợp chất này được xem là một chất dược liệu quý trong y học Trong y học nhân gian, cây nhục đậu khấu được dùng làm thuốc chống nôn mửa, điều hòa hoạt động của ruột, dùng để trị các bệnh nhiễm khuẩn, lao và sốt (Gotke và Maeshwari, 1990) 2.4.2. Cây Neem Cây Neem có tên khoa học là Azadirachta Indica, thuộc họ Meliaceae, có nguồn gốc từ Ấn Độ. Do khả năng chịu hạn cực kỳ tốt nên nó thường được trồng ở một số quốc gia nằm cận xích đạo, như Senegal chẳng hạn. Hình 2.2. Lá và hạt cây Neem (Ranajit và ctv, 2002) Trong thành phần hóa học của tinh dầu thu từ hạt Neem có chứa các chất có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm như: Nimbin, Nimbolide, Azad irachtin và Mahmoodin. Theo một số tài liệu khoa học, toàn thân cây Neem là nguồn dược liệu quý, cây càng già thì dược tính càng cao (tuổi thọ của Neem có thể đến 200 năm) có thể bào chế để chữa nhiều chứng bệnh như thủy đậu, tiểu đường, loét dạ dày, lao, phong (Ranajit và ctv, 2002)… 2.4.3. Hương nhu tía Hương nhu tía, É tía, tên khoa học là Ocimum sanctum, thuộc họ Hoa môi - Lamiaceae. Là loại cây thảo cao gần 1 mét. Thân cành màu đỏ tía, có lông. Lá mọc đối, mép khía răng, thường có màu nâu đỏ, có lông ở cả hai mặt; cuống lá dài. Cụm hoa là chùm đứng gồm nhiều hoa màu trắng hay tím, có cuống dài, xếp thành vòng 6 – 8 chiếc. Quả bế nhỏ. Toàn cây có mùi thơm dịu. Đây là một loài cây cổ sống ở nhiệt đới, thường được trồng lấy lá làm rau ăn, nhưng chủ yếu để làm thuốc. Thành phần hóa học có tinh dầu với tỷ lệ 0,2 – 0,3% ở cây tươi và 0,5% ở cây khô; thành phần chính của tinh dầu là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên 12%) và b- caryophyllen. Trong y học, eugenol được dùng làm thuốc tê tại chỗ, thuốc sát trùng chống bệnh hoại thư và bệnh lao phổi. Eugenol rất thông dụng trong nha khoa (làm chất hàn răng tạm eugenat, làm thuốc điều trị viêm ngà, viêm xương ổ răng, làm toả bạc khi tráng bạc trên răng), trong việc điều trị răng mòn, tê buốt (Chatterjee và ctv, 1982). 2.4.4. Cây sả Sả hay còn gọi là Mao hương có tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc họ Lúa - Poaceae. Sả là cây thảo sống lâu năm, mọc thành bụi, phân nhánh nhiều, cao khoảng 1,5m. Thân rễ trắng hoặc hơi tím. Lá dài đến 1m, hẹp, mép hơi ráp; bẹ trắng, rộng. Cụm hoa gồm nhiều bông nhỏ không cuống. Là một loài liên nhiệt đới mọc hoang và được trồng lấy củ, lá làm gia vị và làm thuốc. Hình 2.3. Cây sả (Shahi và ctv, 2005) Thành phần hoá học: Củ Sả chứa 1 – 2% tinh dầu màu vàng nhạt, thơm mùi chanh, mà thành phần chủ yếu là citral (65 – 85%), geraniol (40%). Ngoài công dụng dùng làm gia vị, Sả đã được dùng làm thuốc trong nhân dân. Sả được dùng để chữa: cảm mạo, nóng sốt đau đầu, đau dạ dày, ỉa chảy, phong thấp tê đau, đòn ngã tổn thương… Người ta còn dùng toàn cây Sả chưng cất tinh dầu; tinh dầu Sả dùng khử mùi hôi tanh, xua ruồi muỗi. Dùng xoa ngoài chữa cúm và phòng bệnh truyền nhiễm (Shahi và ctv, 2005). 2.4.5. Cây ổi Ổi có tên khoa hoc là Psidium guajava, thuộc họ Sim - Myrtaceae. Cây cao khoảng 5 – 10m. Vỏ nhẵn, mỏng, khi già bong từng mảng lớn. Cành non vuông, có nhiều lông mềm, về sau hình trụ và nhẵn. Lá mọc đối, thuôn hay hình trái xoan, gốc tù hay gần tròn, gân lá nổi rõ ở mặt dưới. Hoa trắng, mọc đơn độc hay tập trung 2 – 3 cái thành cụm ở nách lá. Quả mọng hình cầu, chứa rất nhiều hạt hình bầu dục. Ðài hoa tồn tại trên quả. Hình 2.4. Cành và quả ổi (Arima, 2002) Cây ổi có gốc ở châu Mỹ nhiệt đới được trồng rộng rãi ở nhiều nơi. Có khi gặp ở trạng thái hoang dại. Thu hái các bộ phận của cây quanh năm và phơi khô. Thành phần hoá học: Lá ổi chứa tinh dầu (0,31%) trong đó có dl-limonen. Còn có sitosterol, acid maslinic (acid cratagolic), acid guijavalic. Trong lá ổi non và búp non còn có 7 – 10% tanin pyrogalic, khoảng 3% nhựa. Nhựa cây ổi chứa acid d-galacturonic (72,03%), d-galactose (12,05%) và l-arabinose (4,40%). Cây, quả ổi có pectin, vitamin C; trong hạt có tinh dầu với hàm lượng cao hơn trong lá. Vỏ thân chứa acid ellagic. Ổi có vị ngọt và chát, tính bình; có tác dụng cầm ỉa chảy, tiêu viêm, cầm máu. Vỏ ổi cũng có vị chát, lá cũng vậy. Do có nhiều chất tanin nên nó làm săn niêm mạc ruột, làm giảm tiết dịch ruột, giảm nhu động ruột, còn có tác dụng kháng khuẩn (Arima, 2002) 2.5. Các hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc ngăn chặn dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai Ngày nay, với những thành tựu vượt bậc của mình, công nghệ sinh học đang dần dần chiếm lĩnh một vị trí quan trọng trong thế giới loài người. Có thể nói vai trò của công nghệ sinh ngày càng trở nên không thể thiếu, nó chính là một công cụ đắc lực giúp cho con người tìm hiểu và khám phá ra được những điều bí mật trong thế giới sinh học nhằm cải thiện chất lượng cuộc sống và hoạt động sản xuất của con người ngày càng tốt hơn. Những lĩnh vực như nông nghiệp, y tế, thực phẩm… có sự tham gia của công nghệ sinh học đang từng bước được hoàn thiện. Chính vì thế, trong tương lai, đây sẽ là một lĩnh vực được con người chú ý đến nhiều nhất, thế kỷ XXI sẽ là một thế kỷ của công nghệ sinh học. Trong lĩnh vực nông nghiệp nói chung, cũng như hoạt động sản xuất thủy sản nói riêng, công nghệ sinh học đã và đang thể hiện vai trò của mình trong việc nghiên cứu và ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào các vấn đề như kỹ thuật sản xuất, chất lượng giống, việc kiểm soát dịch bệnh… nhằm cải thiện việc sản xuất cũng như chất lượng của sản phẩm, góp phần thúc đẩy nền kinh tế của xã hội loài người phát triển đi lên một cách bền vững. Từ khi dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm bùng nổ, đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm kiểm soát và ngăn chặn dịch bệnh này, trong đó đã có nhiều kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng vào trong hoạt động sản xuất thực tiễn. Các nhà khoa học nhìn nhận trong thời gian sắp tới việc ứng dụng của công nghệ sinh học vào việc giải quyết vấn đề bệnh phát sáng trên tôm sẽ tập trung vào hai hướng chính đó là: các phương pháp chẩn đoán phát hiện bệnh và các sản phẩm để ngăn chặn, kiểm soát dịch bệnh. 2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn đoán phát hiện bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Các kỹ thuật chẩn đoán phát hiện bệnh trên tôm ngày nay đã có nhiều tiến bộ nhờ việc áp dụng các thành tựu nghiên cứu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh học phân tử. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện bệnh trên tôm đã trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi. Các kỹ thuật như ELISA và PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh phổ biến trên tôm, đặc biệt là các bệnh do virus như bệnh đốm trắng do WSSV, bệnh đầu vàng… Ưu điểm của các phương pháp này là tính chính xác và rút ngắn được thời gian phát hiện. Đã có mhiều đề xuất về sử dụng các kỹ thuật như ELISA và PCR cho việc phát hiện nhanh bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm. Việc tìm các đoạn DNA và tạo ra các kháng thể bắt dính kháng nguyên đặc trưng của Vibrio đã được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu. Năm 1998, Robertson và ctv đã nghiên cứu tạo ra một kháng thể đa dòng từ thỏ có thể dùng để phát hiện nhiều dòng V. harveyi. Theo các phương pháp này thời gian phát hiện bệnh được rút ngắn rất nhiều. Tuy nhiên, hiện nay tại nhiều nơi trên thế giới, người ta vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn để phát hiện bệnh phát sáng do chi phí để thực hiện phương pháp này thấp hơn các phương pháp ELISA và PCR. Do hạn chế về tính kinh tế nên đây sẽ là một hướng không khả thi trong thời gian sắp tới. 2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ra các chế phẩm dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Kinh nghiệm nuôi tôm cho thấy việc phòng ngừa bệnh là một giải pháp hữu hiệu nhất giúp phát triển bền vững nghề nuôi tôm. Vì thế đây sẽ là một hướng hứa hẹn có nhiều triển vọng trong tương lai, chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu tìm ra các vaccine và chế phẩm sinh học để ngăn chặn dịch bệnh. Theo những hiểu biết từ trước đến nay, tôm sú là động vật bậc thấp có hệ miễn dịch không đặc hiệu. Điều này có nghĩa là việc sử dụng vacxin ở tôm sẽ không hiệu quả (Đào Văn Trí và ctv, 2001). Một đối tượng khác trong hướng nghiên cứu này là chế phẩm sinh học. Hiện nay trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại chế phẩm sinh học có khả năng ức chế các loài Vibrio như Zymetin, Dikaku, Biodream… Sự ra đời của các chế phẩm sinh học sẽ giúp hạn chế được việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm. Trong chế phẩm sinh học, tính cạnh tranh ức chế của các loài sinh vật giữ một vai trò rất quan trọng quyết định tới hiệu quả của loại chế phẩm đó. Điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tập trung tìm ra các loài sinh vật có khả năng ức chế Vibrio. Và hiện nay, đối tượng nghiên cứu đang được tập chung vào các sinh vật sống ở biển có khả năng ức chế Vibrio gây hại. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có một dòng vi khuẩn ở biển là Pseudomonas I-2 có thể tạo ra các hợp chất ức chế chống lại các Vibrio gây bệnh trên tôm bao gồm V. harveyi, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. damsela và V. vulnificus. Đây là một hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, bền với nhiệt, có thể hòa tan trong chloroform và chịu được các enzyme phân giải protein. Người ta tiến hành tách chiết chất này từ vi khuẩn bằng chloroform và tiến hành thử nghiệm, kết quả cho thấy dịch chiết đã làm giảm mật độ V. harveyi trong nước xuống khi dùng ở nồng độ 20 µg/µl và không ảnh hưởng tới ấu trùng của tôm thậm chí ở nồng độ 50 µg/µl. Vì vậy dòng Pseudomonas I-2 này sẽ có tiềm năng ứng dụng vào việc kiểm soát các Vibrio gây bệnh trên tôm trong các hệ thống sản xuất thủy sản (Karunasagar, 2001). Alteromonas sp. P7 là một vi khuẩn gram âm, di động, hình que, có cytochrome oxidase, có khả năng tổng hợp chất sắc tố trong môi trường nước biển. Chúng có khả năng phát triển ở nồng độ muối NaCl 6% và không phát triển trên môi trường agar có chứa sucrose, muối mật, thiosulphate citrate, trên môi trường Mac Conkey, hoặc trên môi trường không có NaCl. Vi khuẩn này không có khả năng phát sáng, không có enzyme amylase, gelatinase, catalase, urease và không khả năng tạo vòng indole cũng như biến đổi nitrate. Alteromonas sp. P7 có thể sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất và không có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác như là arabinose, dextrose, galactose, lactose, mannitol, sorbitol và sucrose. Với những đặc điểm này, người ta đã xếp vi khuẩn này vào loài Alteromonas và được chỉ định là Alteromonas sp. P7 (Abraham, 2004). Người ta đã phân lập Alteromonas sp. P7 từ các ấu trùng Fabricius của tôm sú và nhận thấy chúng có khả năng chống lại V. harveyi. Tất cả các dòng V. harveyi phân lập được bị ức chế theo các mức độ khác nhau bởi Alteromonas sp. P7 ở trong phòng thí nghiệm. Hợp chất kháng khuẩn được tạo ra bởi Alteromonas sp. P7 có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ và bám dính chặt lên bề mặt của các tế bào vi khuẩn và hợp chất này không bị phân hủy khi xử lý bằng trypsin (Okereke và Montville, 1991). Từ đó, người ta cho rằng hợp chất này có thể không phải là các protein có trong tự nhiên mặc dù các dòng Alteromonas xác định đã được báo cáo là sản xuất các hợp chất protein kháng khuẩn (Mc Carthy, 1994). Các chất kháng khuẩn được thải ra ngoài là sản phẩm của quá trình biến dưỡng thứ cấp. Người ta cho rằng các chất kháng khuẩn này có thể là một pyrole hoặc quinolinol hoặc tyrosol và isatin hoặc là một đường đa có khả năng tan trong ethyl acetate (T. J. Abraham, 2004). Các thí nghiệm được tiến hành đã chỉ ra rằng Alteromonas sp. P7 giúp giảm rõ rệt tỷ lệ chết ở ấu trùng tôm sú in vivo từ V. harveyi M3 bằng cách ngăn chặn sự phát triển và sinh sản của các vi khuẩn gây bệnh (Abraham, 2004). Gần đây, tại nhiều nơi trên thế giới đã nổi lên các đề tài nghiên cứu về khả năng ứng dụng của phage trong lĩnh vực thủy sản. Fraser (2003) và một số nhà khoa học khác đã nghiên cứu và phát hiện một loại phage có khả năng gây sinh tan chuyên biệt cho V. harveyi. Việc sử dụng các bacteriaphage chuyên biệt chống lại V. harveyi ngay từ đầu trong quy trình sản xuất sẽ giúp giảm tối thiểu mật độ hiện diện của V. harveyi trong nước, chất cặn và trong ruột vật nuôi và như thế sẽ ngăn chặn được sự phát sinh của dịch bệnh. Tuy nhiên việc sử dụng phage có các mặt hạn chế như tạo ra các dòng vi khuẩn mới kháng lại phage, hoặc bản thân các phage đó khó có thể kiểm soát được, cũng như tính độc của các phage đó cần phải xác định rõ ràng. Trước khi đưa vào ứng dụng trong thực tiễn, chúng ta cần phải tiếp tục tiến hành nhiều nghiên cứu khác để bảo đảm tính hiệu quả và an toàn của phage trong sản xuất. Tóm lại, hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc sản xuất ra các loại chế phẩm dùng để ngăn chặn dịch bệnh phát sáng sẽ có nhiều triển vọng trong thời gian tới. Tuy nhiên vẫn còn tồn tại một mặt hạn chế của các loại chế phẩm này, đó là giá thành của nó quá cao, điều này giải thích vì sao hiện nay nhiều hộ nông dân nuôi tôm vẫn còn cử dụng hóa chất và kháng sinh để xử lý bệnh tôm. Điều này thúc đẩy các nhà sản xuất nghiên cứu, tìm ra một kỹ thuật, một quy trình sản xuất mới để có thể sản xuất đại trà với số lượng lớn nhằm hạ giá thành sản phẩm, đáp ứng được nhu cầu và nguyện vọng của người nuôi tôm. Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Từ 21/03/2005 đến 26/06/2005. 3.1.2. Địa điểm Phòng Bệnh học Thủy sản – Trung tâm Quan trắc – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Trại Thực nghiệm nuôi Thủy sản Thủ Đức – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu Hợp chất chiết xuất từ các thảo dược ký hiệu là B2 thuộc họ Fabaceae, L, L2 và M thuộc họ Asteraceae. 3.2.2. Đối tượng nghiên cứu Tôm sú không mang các mầm bệnh để bố trí thí nghiệm, trọng lượng bình quân từ 15 – 20 g/con. Giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng, phân lập từ tôm bệnh. 3.2.3. Dụng cụ và hóa chất 3.2.3.1. Dụng cụ Dụng cụ bố trí thí nghiệm: bể nuôi, hệ thống sục khí, vợt thùng, thau... Dụng cụ thu mẫu: kim tiêm (1 ml), đèn cồn, que cấy, bông thấm, găng tay, bao thùng xốp, chai lọ. Dụng cụ phân tích vi khuẩn: ống nghiệm các loại, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pipet, đầu típ, tủ lạnh, tủ ấm, tủ cấy, nồi hấp autoclave... Dụng cụ quan sát, thử nghiệm kháng sinh đồ: thước đo vòng kháng khuẩn, đĩa giấy tẩm hợp chất chiết xuất làm kháng sinh đồ. Dụng cụ kiểm tra chất lượng nước: nhiệt kế thủy ngân 0 – 1000C, pH kế, bộ test NH3, DO, COD... 3.2.3.2. Môi trường và hóa chất Đĩa giấy tẩm các hợp chất cần thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar): môi trường đặc trưng dùng để chọn lọc V. harveyi. TSB (Tryptone Soya Broth): môi trường tăng sinh, phục hồi cho vi khuẩn. Môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar): môi trường dùng để tăng sinh, làm thuần vi khuẩn. Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): môi trường đặc trưng dùng làm kháng sinh đồ khảo sát tác dụng kháng khuẩn của hợp chất thử nghiệm. Các môi trường và hóa chất thử nghiệm đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. Ngoài ra còn có nước biển (15‰) và một số hóa chất khác dùng trong thí nghiệm. 3.3. Phương pháp tiến hành Nội dung tiến hành đề tài có thể chia thành 2 giai đoạn thử nghiệm: 3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm Tiến hành thử nghiệm tác dụng của các hợp chất B2, L, L2 và M theo phương pháp kháng sinh đồ. Mục tiêu là sàng lọc các chất có hiệu quả và xác định các mức nồng độ có ý nghĩa của chất đó đối với vi khuẩn V. harveyi trong phòng thí nghiệm. Gồm các bước sau: Phân lập dòng thuần V. harveyi từ tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn Thử nghiệm sinh hóa để xác định V. harveyi Thử nghiệm tác dụng của các chất bằng phương pháp kháng sinh đồ Xác định nồng độ có hiệu quả kháng vi khuẩn Sơ đồ 1. Bố trí thử nghiệm tác dụng của các hợp chất 3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2-3 con tôm nuôi ao có dấu hiệu nhiễm khuẩn. Lấy máu tôm: mỗi con 0,1 ml, sau đó nhỏ lên các đĩa cấy chứa môi trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên 1 đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc phát sáng trên môi trường TCBS cấy chuyền sang môi trường BHIA (có bổ sung 2% NaCl). Ủ trong tủ ấm ở 300C, 24 giờ để thuần hóa và tăng sinh V. harveyi. Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hoá của V. harveyi: khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, malnose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hoá; khả năng phân giải Gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin (Jonh, 1994). 3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ theo phương pháp Mc Farland (Bauer và Kirby, 1997) Nguyên tắc Khả năng ức chế của các hợp chất thảo dược được xác định dựa vào đường kính vòng vô khuẩn hình thành do sự khuếch tán các hợp chất xung quanh đĩa giấy tẩm hợp chất. Hiệu quả kháng khuẩn được xác định dựa vào đường kính của các vòng ức chế vi khuẩn. Cách tiến hành Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Mc Farland. Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí nghiệm Mc Farland Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl2 1%(ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 H2SO4 1%(ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 Tb/ml(x 108) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Chuẩn bị vi khuẩn để thử nghiệm kháng sinh đồ: giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng. Vi khuẩn được cấy tăng sinh trên môi trường BHIA +