Khóa luận Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm tại các tiệm ăn gần trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh

ngày hay một tuần sau khi mắc bệnh.  Phần lớn bệnh nhân cũng chẳng cần đến bác sĩ vì họ không biết mình bị nhiễm E.coli.  Ngoài ra, nhiều người bị nhiễm mà không có triệu chứng và cũng không mắc bệnh.[19] Khi bệnh nhân bị nhiễm E.coli nghiêm trọng (tức có thể làm rối loạn máu và suy thận), một số triệu chứng sau đây thường được ghi nhận: Da trở nên xanh xao Cảm lạnh Cảm thấy yếu cơ Có những vết thâm tím trên người Đi tiểu rất ít nước tiểu 2.2.5 Samonella spp. Salmonella được lấy tên từ nhà khoa học người Mỹ, Daniel Elmer Salmon- một nhà nghiên cứu bệnh lý động vật. Nhưng thực chất ông không phải là phát hiện đầu tiên mà là nhà khoa học Theobald Smith. D.E.Salmon đã công bố trước.T.Smith là bạn đồng nghiệp của D.E.Salmon, cùng làm việc ở Bureau of Animal Industry (BAI) vào năm 1884. T.Smith phát hiện ra khuẩn salmonella từ thịt vào năm 1885. 2.2.5.1 Hình thái cấu trúc Salmonella spp. là trực khuẩn gram âm, hiếu khí hoặc kị khí tuỳ nghi, không có nha bào, có khả năng di động (trừ S.gallinarum và S.pullorum), có kích thước 0,7 – 1,5 x 2 – 5 micromet. Nhiệt độ phát triển từ 15-45oC, thích hợp ở 37oC, pH thích hợp ở 7,6, nhưng nó có thể phát triển ở được ở pH từ 6-9. Với pH lớn hơn 9 hoặc nhỏ hơn 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt, khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: ở 50oC trong 1 giờ, ở 70oC trong 15 phút và 100oC trong 5 phút. Ở nồng độ muối 6-8% vi khuẩn phát triển chậm và ở nồng độ muối 8-19% thì sự phát triển của vi khuẩn bị ngừng lại. Tuy vậy với vi khuẩn gây ngộ độc thực ăn chỉ bị chết khi ướp muối với nồng độ bão hoà trong thời gian dài. Như vậy thịt cá ướp muối, các món ăn kho mặn chưa thể là an toàn đối với vi khuẩn Salmonella. Salmonella spp. hiện diện trong tất cả các loài thực phẩm: trứng, thịt, thuỷ hải sản, sữa, rau quả,… [17] Hình 2.3 Vi khuẩn samonella[16] 2.2.5.2 Khả năng gây bệnh Khả năng gây ngộ độc thức ăn của Salmonella spp. cần có 2 điều kiện: Thức ăn phải bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn vì khả năng gây ngộ độc của Salmonella yếu Vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn. vấn đề này phụ thuộc nhiều vào phản ứng cơ thể của từng người. điều này giải thích hiện tượng nhiều người cùng ăn một loại thức ăn như nhau nhưng có người bị ngộ độc có người không bị, có người nhẹ, có người bị nặng…Thông thường những người già, người yếu và trẻ em bao giờ cũng bị nặng hơn Salmonella spp. theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động xuống ruột non và sinh sản ở đó, một số khác đi vào hệ bạch huyết và tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết. Nhưng vì Salmonella spp. là vi khuẩn ưa môi trường ruột nên nhanh chóng trở về ruột. Sau đó, Salmonella spp. chui qua màng nhày và vào thành ruột. Nội độc tố sẽ được thoát ra khi vi khuẩn bị phân huỷ trong máu cũng như ở ruột, gây nhiễm độc cấp bằng một hội chứng rối loạn tiêu hoá khá nặng nề, nhưng chỉ sau 1-2 ngày bệnh nhân nhanh chóng trở lại bình thường không để lại di chứng, vì các tế bào niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Nhưng ở người già yếu và trẻ nhỏ có thể bị rối loại tiêu hoá nặng hơn, đôi khi bị tử vong.[1] 2.2.5.3 Triệu chứng Vi khuẩn Salmonella spp. là nguyên nhân thường gây ra bệnh tiêu chảy, nhưng cũng có thể nhiễm bệnh đến các bộ phận khác của cơ thể bao gồm máu (bệnh thương hàn hay phó thương hàn), xương và khớp xương (bệnh viêm khớp mãn tính). Thời gian ủ bệnh thường từ 12-24 giờ sau khi khuẩn Salmonella spp. vào cơ thể, có khi ngắn hơn hoặc kéo dài sau vài ngày. Các dấu hiệu đầu tiên là bệnh nhân thấy buồn nôn, nhức đầu choáng váng khó chịu, thân nhiệt tăng lên ít (37-38oC) sau đó xuất hiện nôn mửa, đau bụng quặn thắt, ỉa chảy nhiều lần, phân toàn nước, đôi khi có máu, đó là triệu chứng của viêm dạ dày ruột cấp tính. Đa số bệnh nhân trở lại bình thường sau 1 đến 2 ngày mà không để lai di chứng. Trong trường hợp đối với người già, trẻ em, người có hệ thống miễn dịch bị suy yếu do bị bệnh có thể có biểu hiện bệnh nặng hơn, như là bệnh thương hàn hay phó thương hàn, cảm cúm, nghĩa là sốt rất cao 39-40oC mệt mỏi toàn thân, đau ở vùng thắt lưng và cơ bắp. Nếu hội chứng này kéo dài nhiều tháng hay nhiều năm có thể dẫn tới bệnh viêm khớp mãn tính. Một số người khác bị nhiễm Salmonella spp. nhưng không có triệu chứng gì vẫn có thể truyền bệnh cho người khác. Ngoài ra khi Salmonella spp. gây bệnh thương hàn có thể có nhiều biến chứng sau: Biến chứng ở đường tiêu hóa: Xuất huyết tiêu hóa Thủng ruột Biến chứng đường gan mật : viêm túi mật, viêm gan - Các biến chứng khác : viêm đại tràng, viêm ruột thừa, viêm phúc mạc mật, viêm dạ dày, viêm tụy cấp, viêm lưỡi thường ít gặp. Biến chứng tim mạch : Viêm cơ tim Viêm tắc động mạch tĩnh mạch Viêm màng ngoài tim Biến chứng đường tiết niệu : Viêm vi cầu thận, hội chứng thận nhiễm mỡ Suy thận cấp Biến chứng nhiễm trùng khu trú cơ quan : hầu hết các cơ quan đều có thể tụ mủ bởi vi trùng thương hàn. Viêm màng não mủ Viêm họng, viêm tuyến mang tai có mủ Viêm đài bể thận, viêm bàng quang Viêm xương : xương sườn, xương sống Viêm gây nhọt ở tuyến vú Viêm hạch cổ. 2.2.5 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và đến năm 1884 được Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ. Staphylococcus thuộc họ Micrococcaceae. Tụ cầu vàng có rải rác trong tự nhiên như trong đất, nước, không khí, đặc biệt người là nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu là ở vùng mũi họng (30%), nách, âm đạo, mụn nước trên da, các vùng da trầy xướt và tầng sinh môn. Tỷ lệ mang vi khuẩn cao hơn ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu, có bệnh tiểu đường type 1, chích xì ke, nhiễm HIV, mắc bệnh da mãn tính. Sau 2 tuần nằm viện, tỉ lệ này lên đến 30%-50% và thường nhiễm chủng kháng thuốc.[7] 2.2.6.1 Hình thái cấu trúc Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tuỳ nghiHình cầu, gram dương.Có khả năng lên men và sinh acid từ đường mannitol, sucrose, trehalose. Mẫn cảm với novobiocine, có khả năng sống trong môi trường 15% NaCL. Có khả năng làm tan máu trong môi trường thạch máu. Nhiệt độ phát triển từ 15-450C, thích hợp ở 370C, pH thích hợp ở 7,6, nhưng nó có thể phát triển được ở pH từ 6-9. Với pH lớn hơn 9 hoặc nhỏ hơn 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt, khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: ở 500C trong 1 giờ, ở 700C trong 15 phút và 1000C trong 5 phút[7] Hình 2.4 Vi khuẩn staphylococcus aureus[7] 2.2.6.2 Khả năng gây bệnh Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn. Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa: chúng là các receptor cho các đại thực bào. Quá trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi đại thực bào. Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc. Ngoài coagulase và yếu tố kết cụm, tụ cầu còn sản xuất một số men quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này. Hyaluronidase: men này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tổ chức. Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào. Exfoliatine: là các men phá hủy lớp thượng bì. Men này gây tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu. Năm độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E) bền với nhiệt. Các độc tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm. Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta-lactamase). Men này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng.[7] 2.2.6.3 Triệu chứng Con đường xâm nhiễm thường nhất là da và các phần phụ của da, hay gặp trong các bệnh da mãn tính như chàm và vẩy nến, vết rách da do chọc chích hay trầy xướt các phần phụ của da như nang lông và móng. Ngoài ra, tụ cầu vàng còn có thể xâm nhập qua đường hô hấp sau khi hít sặc, tắc nghẽn hay giảm chức năng nhung mao trong viêm phế quản mãn hay nhiễm siêu vi cấp tính. Đặt nội khí quản cũng có thể đưa tụ cầu từ thường trú ở đường hô hấp trên đến đường hô hấp dưới. Nhiễm trùng da và mô mềm: Tụ cầu vàng là nguyên nhân gây nhiễm trùng da và mô mềm thường gặp nhất, các biểu hiện có thể gặp gồm: - Viêm nang lông. - Nhọt da: thường ở mông, mặt hay cổ. - Hậu bối: thường gặp ở vùng sau cổ, vai , hông và đùi, điển hình xảy ra ở đàn ông trung niên hay già yếu. - Viêm quanh móng. - Tróc bóng nước ở trẻ em. - Viêm mô tế bào: có khi do tụ cầu vàng nhưng thường do liên cầu tan huyết β gây ra hơn. Nhiễm trùng hô hấp: Tụ cầu vàng đến nhu mô phổi qua 2 đường hít từ đường hô hấp trên hay lan theo đường máu gây: - Viêm phổi, biến chứng tràn mủ màng phổi. - Viêm họng xuất tiết kèm phát ban và có thể gây nhiễm độc toàn thân. - Viêm khí quản ở trẻ em kèm theo biểu hiện nhiễm độc toàn thân. - Viêm xoang mãn. - Viêm xoang bướm. Nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương: - Abces não sau viêm nội tâm mạc. - Viêm màng não mủ. - Tràn mủ dưới màng cứng. - Abces ngoài màng cứng tủy sống hay trong não. - Viêm tắc tĩnh mạch nội sọ, nhiễm trùng sau viêm xoang, viêm xương chũm hay nhiễm trùng mô mềm ở mặt. Viêm tắc tĩnh mạch xoang hang biểu hiện bởi dấu hiệu thần kinh khu trú, đặc biệt là liệt các dây thần kinh sọ. Viêm tắc xoang tĩnh mạch dọc biểu hiện bởi yếu tay và chân, thay đổi tri giác. Nhiễm trùng tiểu: thường xảy ra sau khi soi bàng quang hay đặt thông tiểu. Còn trong các trường hợp khác nếu tìm thấy sự hiện diện của tụ cầu vàng trong nước tiểu dù cho số lượng ít chứng tỏ có tình trạng du khuẩn huyết và vi khuẩn đến thận bằng đường máu có hay không kèm theo abcès. Nhiễm trùng cơ xương: tụ cầu vàng là nguyên nhân thường gặp nhất của cốt tủy viêm cấp ở người lớn và cũng là một trong các nguyên nhân hàng đầu ở trẻ em. Ở người lớn vị trí hay gặp là thân đốt sống, ở trẻ em vị trí hay gặp là các hành xương dài giàu mạch máu. Ngoài ra, tụ cầu vàng cũng hay gây cốt tủy viêm mãn trên các vùng chấn thương hay vùng phẫu thuật cũ, gây viêm khớp nhiễm trùng ở người lớn, thường gặp ở khớp gối, hông và khớp cùng chậu, gây viêm mủ cơ (thường nhất là abces cơ chậu). Du khuẩn huyết: biến chứng của du khuẩn huyết do tụ cầu vàng bao gồm abcès các tạng trong ổ bụng, abcès não, viêm màng não, viêm khớp nhiễm trùng, cốt tủy viêm, abcès ngoài màng cứng, phình mạch nấm. Tỷ lệ tử vong là 11%-43%.[7] 2.2.7 Listeria monocytogenes Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, bệnh Listeriosis do vi khuẩn L.monocytogenes gây ra thường hay được người ta nhắc đến Ca đầu tiên của bệnh Listériosis đã được nói đến cách nay 70 năm, nhưng phải đợi đến những năm 1980, vi khuẩn L.monocytogenes mới được chính thức xác nhận là tác nhân gây ra bệnh ngộ độc từ thực phẩm[17] 2.2.7.1 Hình thái cấu trúc Đây là vi khuẩn gram (+), không bào tử, yếm khí (anarobic) và có thể phát triển trong tế bào. Trong số bảy loại Listeria được biết đến, chỉ có L.monocytogenes mới là tác nhân thật sự của những ca nhiễm khuẩn từ thực phẩm (infection alimentaire). Có tất cả 11 chủng huyết thanh (serotypes) trong đó 90% trường hợp bệnh Listeriosis ở người đều do các serotype 1a, 1b và 4b gây nên. Trong ba nhóm vừa kể, thì 4b là serotype độc hại nhất. [18] Hình 2.5 Vi khuẩn Listeria monocytogenes[18] Khả năng gây bệnh Vi khuẩn L.monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng được thấy trong đất cát, trong nước, trong phân thú vật và cả trong phân người. Rau cải, salade, có thể bị nhiễm từ nước bẩn và từ phân gia súc. Thú vật có thể chứa vi khuẩn nhưng không bị bệnh. Chúng có thể lây nhiễm vào tất cả thực phẩm như thịt, sữa, fromage, thịt nguội Khác với đa số vi khuẩn khác..., L.monocytogenes có thể tăng trưởng chậm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C Nấu nướng thực phẩm và hấp khử trùng sữa đều diệt được vi khuẩn. Tuy nhiên, đối với một số thức ăn làm sẵn (ready to eat products) như thịt gà, cua và thịt nguội như hot dog, deli meats, luncheon meats, v.v…chúng cũng có thể bị nhiễm vào sau giai đoạn nấu nướng và trước khi được đóng gói. Vi khuẩn L.monocytogenes không có sản xuất ra độc tố, nhưng gây bệnh bằng cách sinh sản và phát triển trong cơ thể. Nhiệt độ tối hảo để vi khuẩn L.monocytogenes phát triển là từ 30°C đến 37°C, nhưng nguy hiểm hơn nữa là chúng vẫn có thể phát triển trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C. Đây là điểm khác biệt với phần lớn các loại vi khuẩn khác. [18] 2.2.7.3 Triệu chứng Đối với những người có sức khỏe bình thường, lúc nhiễm khuẩn L.monocytogenes thì họ sẽ cảm thấy mệt mỏi, đau nhức như bị cảm cúm vậy. Có thể có sốt nhẹ, nhức đầu, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy và đôi khi bị chóng mặt. Bệnh có thể xuất hiện từ 2 ngày đến 30 ngày sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm. Ở trẻ sơ sinh, bệnh rất nguy hiểm và có thể có tử số lên đến 30%... Sản phụ nếu bị nhiễm trong ba tháng đầu của thời gian mang thai thì có thể bị xảo thai, nếu bị nhiễm trong giai đoạn cuối, sẽ đẻ ra thai chết hoặc hài nhi rất bệnh hoạn… Đối với các cụ lớn tuổi, bệnh sẽ nặng hơn như có thể bị viêm màng não tủy và nhiễm trùng huyết, sốt, nhức đầu, viêm mắt, abcès gan và viêm phổi. Ít thấy có hiện tượng miễn nhiễm sau khi khỏi bệnh nhưng bệnh nhân vẫn có thể thải vi khuẩn ra ngoài trong nhiều năm. Tử số cao, thường từ 25% đến 35%. Bệnh càng trầm trọng hơn đối với những ai đang có sức miễn dịch bị suy yếu sẵn vì một chứng bệnh nào khác như cancer, tiểu đường.[18] 2.3 Hiện trạng một số tiệm ăn trong phạm vi gần trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. HCM Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. HCM tọa lạc tại 144/24, Điện Biên Phủ, phường 25, quận Bình Thạnh, Tp. HCM. Thuộc khu Văn Thánh Bắc, cổng trước thông với đường Điện Biên Phủ, cổng sau thông với đường D2. Khu vực cổng sau là nơi có nhiều sinh viên ra vào nhất. Gần trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. HCM còn có trường Đại học Văn Hiến, Đại học Giao Thông Vận Tải Tp. HCM. Ngoài ra khu vực này cũng là nơi tập trung nhiều công ty, và là nơi tập trung dân cư đông đúc. Chính vì thế, các dịch vụ ăn uống cũng theo đó phát triển theo, Đặc biệt là các tiệm cơm. Vai trò của các tiệm ăn Đáp ứng nhu cầu ăn nhanh của thực khách đặc biệt là sinh viên, công nhân viên là những đối tượng không có điều kiện hoặc không có thời gian nấu ăn. Giá cả tại các tiệm ăn bình dân ở khu vục gần trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. HCM phù hợp với túi tiền của nhiều đối tượng. Tại các tiệm ăn phục vụ nhiều món có thể đáp ứng với nhu cầu của nhiều người 2.3.2 Hiện trạng Bên cạnh những tiệm ăn diện tích thoáng mát, sạch vẫn còn không ít tiệm có những đặc điểm đáng chú ý. - Các tiệm ăn có diện tích nhỏ, không gian chật hẹp. - Hầu hết các tiệm ăn kinh doanh mang tính quy mô nhỏ, không chuyên nghiệp, đội ngủ nhân viên không chuyên. - Khu bếp thường rất nhỏ, và nằm chung với khu rửa bác, đĩa… Thậm chí có tiệm diện tích quá chật hẹp nên khu vực vệ sinh dụng cụ liền kề toilet. - Khu vục vệ sinh bác, đĩa nằm gần miệng cống thoát nước…. Chương III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Địa điểm và thời gian Địa điểm thực hiện 3.1.2.1 Địa điểm lấy mẫu Mẫu thực phẩm lấy tại 3 tiệm ăn gần trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM: Tiệm 1: Quán cơm L25. đường D2, khu Văn Thánh Bắc, quận Bình Thạnh Tiệm 2: Quán cơm Duyên. 38 đường D2, khu Văn Thánh Bắc, quận Bình Thạnh Tiệm 3: Quán cơm 999.134/5 Lô X, đường D2, khu Văn Thánh Bắc, quận Bình Thạnh. Địa điểm thực hiện Thực hiện phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm vi sinh của trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM 3.1.2 Thời gian thực hiện đề tài: Ngày 01 tháng 4 năm 2009 đến ngày 30 tháng 6 năm 2009 3.2 Vật liệu 3.2.1 Mẫu Năm loại mẫu thực phẩm phân tích Đậu hủ nhồi thịt Xíu mại Chả thịt chưng Cá basa kho Hến sào 3.2.2 Hóa chất, môi trường Saline pepton water (SPW) (Ấn Độ) Plate count agar pH 7,0 ± 0,2(PCA) (Ấn Độ) Tryptone Soya Agar ( TSA) (Ấn Độ) Violet Red Bile Agar ( VRB) (Ấn Độ) Brilliant Green Bile Lactose broth ( BGBL) (Ấn Độ) Eosin methyl blue ( EMB) (Ấn Độ) Canh Tryptone (Ấn Độ) Canh Methyl red Voges-Proskauer ( MR-VP) (Ấn Độ) Thạch Simmon Citrate (Ấn Độ) Thuốc thử Kovac,s Thuốc thử Methyl red Thuốc thử 1α-napthol 5% KOH 40 % NaCl Cồn 70 % và cồn 96 % Nước cất 3.2.3 Dụng cụ Ống nghiệm có nấp Đĩa petri vô trùng Pipette 5ml, 10ml Cân điện tử Bình tam giác Cốc thủy tinh Kéo Đũa khuấy Túi nylon vô khuẩn Đèn cồn Que cấy vòng Que cấy thẳng Bình chứa môi trường Khăn giấy Bông y tế Bông không thấm nước 3.2.4 Thiết bị Autoclave Tủ lạnh Bếp từ Tủ ấm 44oC Tủ ấm 30oC Tủ ấm 37oC Tủ sấy 180oC Tủ cấy Bếp đun Bể ổn nhiệt 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu 3.3.1.1 Thu mẫu Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và được mang về phòng thí nghiệm phản ánh dúng tình trạng mẫu cần phân tích Dụng cụ lấy mẫu bằng kim loại vô trùng. Mẫu sau khi lấy cho vào nilon sạch vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Trong trường hợp nơi lấy mẫu quá xa phòng thí nghiệm phải ướp đá để mang về. các mẫu thực phẩm sau khi lấy phải đảm bảo không nhiễm lẩn nhau. Bảo quản mẫu Khối lượng mẫu tối thiểu từ 100-250g tùy vào yêu cầu phân tích. Mẫu lấy tại nhiều vị trí trên bề mặt sản phẩm Sau khi mang về phòng thí nghiêm nếu không phân tích ngay thì mẫu được bảo quản ở 0-4oC và thời gian bảo quản không quá 36 giờ.[6] 3.3.1.3 Chuẩn bị mẫu Rã đông trước khi phân tích: Rã đông phải đảm bảo mẫu vẫn không bị nhiễm.Tránh tình trạng đổi bao đựng cho mẫu. Rã đông thông thường từ 2-5oC trong 18 giờ tuy nhiên thời gian không cho phép nên thường áp dụng biện pháp rã đông ở 45oC trong 15 phút. Khi rã đông ở nhiệt độ cao phải lác đều mẫu nhằm rút ngắn thời gian rã đông và làm nhiệt độ mẫu dồng đều. Cân mẫu: các dụng cụ lấy mẫu cân, đựng mẫu phân tích và nơi cân cần dảm bảo vô trùng. Lượng mẫu cần cân tùy theo loại vi sinh cần phân tích. Trong dề tài này khối khối lượng mẫu cân là 25g. Đồng nhất mẫu khi phân tích: sự phân phối của vi sinh vật không đồng đều nhau, để đảm bảo tính đồng nhất trong mẫu các mẫu lỏng phải lắc đều trước khi phân tích. Nếu là mẫu bán rắn phải cắt mẫu hay nghiền mẫu bằng thiết bị chuyên dùng. Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thích hợp. kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau: Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tế bào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không được dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể phát triển được Chuẩn bị các chuỗi pha loãng : bơm chính xác 9ml dung dịch pha loang vào ống nghiệm có nắp. Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân 25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha loãng như mong muốn.[5] Hình 3.1 Cách pha loãng.[5] 9mẫu 3.3.2 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC)bằng phương pháp đổ đĩa 3.3.2.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. 3.3.2.2 Nguyên tắc Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất váo trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 3 ngày. [1] Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, căn cứ vào độ pha loãng cũng như thể tích cấy để quy về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng mẫu thực phẩm. [5] Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây được độ pha loãng 10-1 Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4. Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ Hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã khử trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm 2 đĩa. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm Tính kết quả: A 3.3.3.3 Quy trình phân tích[5] 3.3.2.4 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu Dịch được đồng nhất xong tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục làm đến độ pha loãng 10-4. Cấy mẫu. Cấy mẫu Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4. Dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoãng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều. Chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ trong tủ 30oC Sau 72 giờ chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đến. Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí 3.3.2.5 Ghi kết quả Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả sau khi đếm khuẩn lạc[1] Nồng độ pha loãng Kết quả 10-2 10-3 10-4 Đĩa 1 Đĩa 2 - Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/g - Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/g - Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc Công thức tính kết quả: Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng 3.3.3 Định lượng Coliforms tổng số bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 3.3.3.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. 3.3.3.2 Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ 37oC sau 24-48 giờ. Ngoài lactose môi trường chọn lọc cho coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương. Trên môi trường này khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính > 0,5cm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL Để phát hiện được bộ phận tế bào bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không phát triển được trong môi trường chọn lọc, do đó trước tiên mẫu phải được cấy vào môi trường tăng sinh không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc.[1] 3.3.3.3 Quy trình phân tích.[6] Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã khử trùng Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ 3.3.3.4 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu. Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa. Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trư