Khóa luận Điều chế kháng huyết thanh thỏ và khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối với vi khuẩn Streptococcus sp

quả cuối cùng là cơ thể tạo lượng kháng thể đặc hiệu rất cao chống lại sự xâm nhập của kháng nguyên. Kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin = Ig), có bản chất protein. Ở người và động vật có vú tồn tại 5 lớp Ig: IgA, IgG, IgM, IgD và IgE có chức năng được thể hiện qua bảng 2.3. Các Ig đều là protein hình cầu, có hai chuỗi polypeptide nặng kí hiệu là chuỗi H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L (light chain). Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp Ig với nhau là ở chuỗi nặng. Các chuỗi H hoặc L trên cùng một phân tử kháng thể bao giờ cũng giống nhau hoàn toàn từng đôi một (Lê Văn Hùng, 2002).  Miễn dịch qua trung gian tế bào Là kết quả của sự hoạt hóa các lympho T và đại thực bào bởi kháng nguyên. Khi đưa một lượng nhỏ kháng nguyên đặc hiệu vào cơ thể, thì tại nơi đưa vào sẽ xảy ra phản ứng viêm. Phản ứng viêm do sự tương tác giữa lympho T mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu gọi là sự quá mẫn muộn (delayed hypersensivity). Người ta coi quá mẫn muộn là một biểu hiện của đáp ứng miễn dịch tế bào. 17 Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ kích thích sự hoạt động biệt hóa của dòng tế bào lympho T, các quần thể sau khi được biệt hóa sẽ tăng sinh nhanh chóng và tạo ra một số lượng lớn sẵn sàng làm nhiệm vụ tấn công kháng nguyên. Bảng 2.3 : Chức năng sinh học của 5 lớp Ig (Nguồn : Đặng Đức Trạch và ctv., 1987; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001) Lớp kháng thể Hoạt động hữu ích Hoạt động gây tổn thương. IgG Trung hòa độc tố Ngưng kết Opsonin hóa Tan vi khuẩn (kết hợp với bổ thể) Phức hợp kháng nguyên – kháng thể đọng lại trong cơ thể gây tổn thương. IgM Trung hòa độc tố Ngưng kết Tan vi khuẩn (phối hợp với bổ thể) Thụ thể trên bề mặt lympho bào B dành cho kháng nguyên Như trên IgA Trung hòa độc tố Ngưng kết Opsonin hóa Như trên IgD Thụ thể trên bề mặt lympho bào B dành cho kháng nguyên Như trên IgE Làm thay đổi tính thẩm thấu của thành mao mạch Gây phản vệ quá mẫn tức khắc và toàn thân ngay tại chỗ Những tế bào lympho tham gia vào đáp ứng miễn dịch tế bào thuộc về hai tiểu quần thể lympho T sau: Tiểu quần thể lympho T gây quá mẫn muộn (TDTH = delayed type hypersensivity T lymphocyte) : có chức năng sản xuất các yếu tố hòa tan gọi là lymphokin, tác động đến các loại bạch cầu khác, đặc biệt là đại thực bào. Chúng có vai 18 trò rõ rệt trong đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại các vi sinh vật kí sinh bên trong tế bào, trong hiện tượng mẫn cảm do tiếp xúc, phản ứng thải bỏ mảnh ghép. Tiểu quần thể lympho T gây độc (TC = cytotoxic T lymphocyte) có khả năng tiêu diệt tế bào đích, những tế bào đã bị vi sinh vật gây bệnh đột nhập vào bên trong tế bào chất hoặc nhân. Các quần thể tế bào khác như: tế bào T cảm ứng TI (inducer T lymphocyte), tế bào T hỗ trợ TH, tế bào T ức chế TS (T cell suppressor)... có vai trò điều hòa đáp ứng miễn dịch hoặc điều hòa mối quan hệ phức tạp giữa các tế bào cùng tham gia đáp ứng miễn dịch. Lymphokin: hiện nay phát hiện được hơn 90 loại lymphokin ở thú. Chúng có bản chất là protein do tế bào lympho tiết ra với các chức năng khác nhau, mà một trong những chức năng đó là kích thích khả năng thực bào của các đại thực bào đơn nhân và bạch cầu trung tính (Lê Văn Hùng, 2002). 2.7. Khái quát về hệ thống miễn dịch của cá Lớp cá là lớp động vật có xương sống nguyên thủy nhất, được coi là gạch nối quan trọng giữa các loài động vật không xương sống và các loài động vật có xương sống bậc cao hơn (Stoskopf S.K., 1993). Ở cá tồn tại cơ chế thực bào với các tế bào thực bào đơn nhân và tế bào hạt của động vật không xương sống, chúng cũng là các sinh vật đầu tiên thể hiện được hai cơ chế miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào như ở các loài hữu nhũ (Stoskopf S.K., 1993). Ngoại trừ một số loài cá sống ở nhiệt độ thấp không phát triển hệ thống đáp ứng miễn dịch (Fox, 2005). Cũng như tất cả các cơ thể sống khác, cá có đặc tính quan trọng là nhận biết và dung nạp những cái của bản thân, đồng thời nhận biết và thải bỏ những cái không phải của bản thân, xa lạ với cơ thể (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Dưới một phức hệ phức tạp tương tác giữa các tế bào được biết đến là hệ thống miễn dịch, chúng nhận biết tác nhân gây bệnh và các chất lạ rồi khởi động một loạt các phản ứng khác nhau nhằm loại bỏ chúng ra khỏi cơ thể. Đó còn được gọi là sự đáp ứng miễn dịch. Những đáp ứng miễn dịch nói chung được chia thành 2 lớp lớn: các đáp ứng miễn dịch tự nhiên (không đặc hiệu) và các đáp ứng miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu). 2.7.1. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá Là các đáp ứng miễn dịch nhờ vào các hàng rào cơ học và sinh học một cách không đặc hiệu. 19 Các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên Đây là các tế bào quan trọng nhất trong đáp ứng miễn dịch ở cá (Fox, 2005). Bạch cầu đơn nhân chỉ có số lượng giới hạn trong vòng tuần hoàn máu ngoại vi, trong khi đại thực bào có nhiều trong các mô. Chúng tham gia vào sự thực bào và sản sinh ra các yếu tố tương tự cytokine như: interleukin-1 (IL – 1), yếu tố hoại tử khối u (TNF – tumor necrosis factor) kích hoạt các đáp ứng tiếp theo (Fox, 2005) Neutrophil: là các tế bào thứ cấp xuất hiện trong giai đoạn sớm của sự viêm (Manning, 1994; trích bởi Stoskopf S.K., 1993.), nó sản sinh cytokine để lôi kéo các tế bào có chức năng miễn dịch khác tới vùng đã bị nhiễm (Fox, 2005) . Tế bào giết tự nhiên ( Natural killer cell) có các thể nhận (receptor) gắn bám vào tế bào đích và li giải nó. Các tế bào này quan trọng trong sự đáp ứng miễn dịch với mầm bệnh virus và kí sinh trùng (Fox, 2005). Ngoài ra còn có một số tế bào tham gia vào sự thực bào khác như: bạch cầu có hạt ưa acid (Mainwaring và Rowley, 1985), tiểu cầu (Ferguson, 1976; Lester và Budd, 1979), tế bào lớp lót nội mô của xoang máu, tế bào hình trụ ở mang cá (Chilmonczyk và Monge, 1980), tế bào nội mô ở dạ dày (Woodhead, 1981) và các đại thực bào trong tâm nhĩ (Ferguson, 1975) (Trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Sự thực bào Sự thực bào là cơ chế phòng vệ nguyên thủy nhất (Fox, 2005), khởi nguyên của nó là một chức năng phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng ở động vật cấp thấp, nó đã tiến hóa độc lập thành chức năng phòng vệ ở động vật có xương sống (Stoskopf S.K., 1993). Cơ chế của sự thực bào bao gồm: nhận biết tác nhân ngoại nhiễm, gắn bám vào tác nhân ngoại nhiễm, hút nuốt và tiêu hóa. Cơ chế của việc nhận biết và gắn bám với tác nhân ngoại nhiễm không được hiểu biết rõ. Ở cá xương, thận và lách là hai cơ quan chính bắt giữ kháng nguyên cho tế bào thực bào hoạt động chức năng. Có hai loại tế bào thực bào: Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào. Bạch cầu có hạt. Da và lớp nhớt của cá Không như lớp da của động vật có xương sống bậc cao, da cá được cấu tạo bởi các tế bào sống không được keratin hoá (Robert và Bullock, 1980; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Da cá cũng mau lành hơn nếu có thương tổn . Sự tồn tại của lớp chất nhớt 20 phía mặt ngoài da cá là một điều đặc biệt mà các lớp động vật khác không có được. Nó ức chế sự phát triển của các vi sinh vật. Người ta tìm thấy trong chất nhớt của da các chất: lysozyme, bổ thể, kháng thể tự nhiên, bacteridosin (Diconza, 1970; Fletcher và White, 1973; Ourth, 1980; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Các kháng thể tự nhiên trong lớp nhớt này đặc hiệu với các epitope có chứa thành phần carbohydrate của vách tế bào kháng nguyên. Trong lớp nhớt còn phát hiện có cả kháng thể đặc hiệu. Các phân tử hòa tan trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Gồm một số chất sau: lectines, lytic enzyme, transferrin/lactoferrin, ceruloplasmin, protein C – raeactive, interferon (IFN) đảm nhận các chức năng bổ trợ cho các đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Bổ thể Bổ thể là một kháng thể không đặc hiệu có trong huyết thanh tươi của các loài động vật, có tác dụng làm tan vi khuẩn đã được kháng thể cảm ứng. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1979; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001.) Trong huyết thanh cá tồn tại khoảng hơn 20 loại bổ thể khác nhau, chúng hoạt động qua hai cơ chế: hoặc tương tác với kháng thể đặc hiệu, hoặc hoạt động một cách không đặc hiệu với các phân tử ở bề mặt vật kí sinh (Sakai, 1992; trích bởi Fox, 2005.). 2.7.2. Đáp ứng miễn dịch thu đƣợc ở cá ( miễn dịch đặc hiệu) Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu có tính đặc hiệu cao đối với tác nhân gây bệnh . Sự đáp ứng này càng hoàn thiện sau mỗi lần tiếp xúc với tác nhân gây bệnh. Hệ thống miễn dịch đặc hiệu có thể ghi nhớ lại tác nhân gây bệnh và ngăn cản tác động gây bệnh của chúng ở lần tiếp xúc lặp lại tiếp theo (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bao gồm: Miễn dịch thể dịch: Với vai trò tham gia quan trọng của các tế bào lympho B. Ở cá, do thiếu tủy sống, sự trưởng thành và tăng sinh của các tế bào lympho B diễn ra ở lách và phần trước của thận (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Cá chỉ tổng hợp được một lớp Ig (immunoglobulin) tương đương với IgM ở thú. IgM ở cá xương có dạng tetreametric, ở cá sụn có dạng pentametric, trong khi ở cá mập và cá đuối có dạng monometric (Ambrosius và ctv., 1982; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). IgM là dạng Ig chủ yếu được tạo ra trong các đáp ứng miễn dịch thì đầu ở 21 thú. Ở cá không có kháng thể IgG. IgM có vai trò hoạt hóa bổ thể, có vai trò trong sự opsonin hóa, trung hòa virus và sự ngưng kết (Tizard, 1987; trích bởi Stoskopf S.K., 1993). Ở lớp nhớt của cá cũng có sự có mặt của các kháng thể loại IgM và Ig tương tự như IgA ở thú (St-Louis-Cornier và ctv., 1984; Lobb, 1987; trích bởi Stoskopf, 1993). Miễn dịch qua trung gian tế bào: Các lympho bào T sinh ra từ tuyến ức của cá giúp cho sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào . Sau các đáp ứng của đại thực bào, các lympho bào T – helper sẽ được kích hoạt, trưởng thành thành các tế bào effector. Nó nhận diện được kháng nguyên và gắn bám vào kháng nguyên thông qua các thể nhận trên bề mặt của các đại thực bào, từ đó kích thích đại thực bào sản sinh các loại cytokine. Cytokine tác động gián tiếp gây ra một loạt các phản ứng nhờ các quần thể tế bào khác. 2.8. Giới thiệu về chất bổ trợ 2.8.1. Nguyên lý tác dụng của chất bổ trợ Cơ chế tác động của chất bổ trợ dùng trong vaccine được giải thích như sau: Chất bổ trợ có tác dụng gây viêm, kích thích quá trình thực bào, giúp quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra mạnh hơn. Các chất bổ trợ hấp thu kháng nguyên và thải kháng nguyên từ từ ra từ chỗ tiêm. Chất bổ trợ còn có tác dụng lên tế bào lympho T hỗ trợ (TH). 2.8.2. Các loại chất bổ trợ thông dụng Các nhà khoa học đã tìm ra hàng trăm chất có tác dụng như chất bổ trợ cho vaccine. Tuy nhiên đa số trong các chất này, ngoài tính làm tăng khả năng miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch cho vaccine, chúng lại có độc tính tương đối cao, vì thế không được sử dụng rộng rãi mà chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu và trong phòng thí nghiệm. Để chọn chất bổ trợ ta nên cân nhắc giữa độ an toàn và tính kích thích miễn dịch sao cho phù hợp. Hiện nay các chất bổ trợ được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất vaccine gồm các nhóm:  Nhóm chất vô cơ Nhôm hydroxit (Al(OH)3) – keo phèn 22 Nhôm phosphat (AlPO4) Nhôm kali sulfat (AlK(SO4)2.12H2O) – phèn chua  Nhóm chất hữu cơ Gồm những chất chủ yếu như protamin, mỡ động vật, dầu thực vật, dầu khoáng. Qua nhiều thực nghiệm cho thấy: một chất bổ trợ được chọn dùng để chế vaccine, ngoài hoạt tính kích thích sinh miễn dịch không đặc hiệu mạnh mẽ còn phải có tính an toàn cao, nghĩa là không gây phản ứng phụ sau khi tiêm (Nguyễn Mạnh Thắng, 2003). 2.9. Một số nét về vaccine phòng bệnh cho cá 2.9.1. Nguyên tắc ứng dụng vaccine Nguyên tắc của việc ứng dụng vaccine là dựa vào hai đặc tính cơ bản của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Đó là tính đặc hiệu và sự ghi nhớ miễn dịch. Các tế bào ghi nhớ cho phép hệ thống miễn dịch phát triển sự đáp ứng mạnh hơn khi có lần tiếp xúc lặp lại với kháng nguyên. Sự đáp ứng thứ cấp này đồng thời nhanh hơn và có hiệu quả hơn sự đáp ứng ban đầu. Nguyên tắc của vaccine là sử dụng các vi sinh vật (vi khuẩn, virus) hoặc độc tố của chúng đã được cải biến (làm yếu, gây chết) làm cho chúng trở nên một tác nhân không gây bệnh nhưng không làm mất tính kháng nguyên của chúng (Nguyễn Đình Bảng và Nguyễn Thị Kim Hương, 2003). Miễn dịch học cá có lịch sử ngắn hơn nhiều so với miễn dịch học người và thú. Báo cáo đầu tiên về vaccine trên cá là nghiên cứu về vaccine phòng bệnh furunculosis của Duff vào năm 1942 (Souter, 1983), đến nay đã có nhiều công trình nghiêu cứu về vaccine cho cá. Đặc biệt từ khi nhiều nhược điểm của các biện pháp phòng trị bệnh theo con đường hoá trị liệu bộc lộ nhiều nhược điểm, gây tác hại đến người tiêu dùng và môi trường, việc nghiên cứu và sử dụng vaccine phòng bệnh cho cá càng thêm sự khích lệ. Nhưng để đạt được một loại vaccine hiệu quả cả về mặt kinh tế và môi trường thật là khó (Aasjord và Slinde, 1994). Kể từ năm 1976 cho đến năm 1993, trong vòng gần 20 năm chỉ có 3 loại vaccine cho cá được thương mại hoá, đó là: vaccine phòng bệnh enteric – redmouth, vaccine phòng bệnh furunculosis, vaccine phòng bệnh do vibrio (Souter, 1983). 2.9.2 Các dạng vaccine dùng cho cá Vaccine chết (killed vaccine) là dạng vi sinh vật đã được bất hoạt thông qua các phương pháp xử lí hoá – lí. Hầu hết các vacine được thương mại hiện nay để phòng 23 các bệnh trên động vật thuỷ sản đều dựa vào phương pháp xử lí bằng formalin (Austin, 1984; trích bởi Stoskopf S. K., 1993). Ngoài ra còn sử dụng một số hoá chất như: chloroform và phenol, hoặc các tác nhân vật lí như: sodium hydroxide, sodiumdodecyl sulfate, nhiệt độ để giết chết vi sinh vật (Stoskopf S. K., 1993). Vaccine nhược độc (attenuated vaccine): dùng các vi sinh vật đã được làm yếu, bằng cách: xử lí vi sinh vật với hoá chất ở nồng độ cận ngưỡng chết, xử lí nhiệt độ thấp. Phương pháp thông thường là nuôi cấy chúng ở môi trường không thích hợp hoặc với nhiệt độ không thuận lợi cho sự sinh trưởng. Tuy nhiên vaccine dạng này vẫn chưa được thương mại hóa vì những e ngại là vi sinh vật dùng chế vaccine có thể trở nên có độc lực mạnh hơn . Hiện nay ngoài hai dạng vaccine phổ biến trên, các nhà nghiên cứu đang hướng đến sản xuất vaccine tiểu đơn vị (subunit vaccine) và các loại peptide tổng hợp dùng làm vaccine phòng bệnh cho cá. 2.9.3. Các phƣơng pháp chủng vaccine cho cá Việc chủng vaccine trên cá có nhiều sự lựa chọn hơn so với trên thú và con người. Hiện nay hầu hết các loại vaccine sử dụng cho động vật có xương sống là ở dạng tiêm (injection) , có thể tiêm dưới da, tiêm cơ hay tiêm xoang bụng (Souter, 1983; Stoskopf S. K., 1993). Ở cá, sự tiêm xoang bụng (intraperitoneal = i.p.) cho hiệu giá kháng thể cao hơn với nhiều loài vi khuẩn và virus (Austin, 1984; Wolf, 1988), nhưng nếu tiêm chủng với số lượng cá lớn sẽ không khả thi. Các đường chủng khác như chủng qua đường miệng thông qua thức ăn hoặc qua đường hậu môn. Tuy nhiên phương pháp này không hiệu quả bởi vì vaccine bị phá hủy ở đường tiêu hóa của cá (Austin và Austin, 1987). Vì vậy, việc cấp qua lỗ hậu môn sẽ tránh được tác động phân hủy vaccine ở đường ruột cá nhưng tốn nhiều công nên chẳng ưu việt hơn phương pháp cấp bằng đường tiêm vào xoang bụng. Để chủng vacine với số lượng cá lớn, phương pháp ngâm và tắm là thích hợp nhất. Các phương pháp này thích hợp với cá nhỏ, nhưng cũng không nên chọn cá quá nhỏ vì sẽ tạo đáp ứng miễn dịch kém do hệ thống miễn dịch chưa trưởng thành (Tatner và Horne, 1984; Manning và Mugal, 1985, trích bởi Aasjord và Slinde, 1994). 2.10. Giới thiệu về phản ứng ngƣng kết dùng trong chẩn đoán miễn dịch học 2.10.1. Định nghĩa kháng nguyên và kháng thể 24 Kháng nguyên (Antigen) Kháng nguyên là những dị chất đối với cơ thể, có đặc tính khi vào cơ thể sẽ kích thích sinh ra những chất phản ứng đặc hiệu, đối lập với chúng, gọi là kháng thể. Kháng thể sinh ra sẽ phản ứng một cách đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1979). Kháng thể (Antibody) Kháng thể là các protein của huyết thanh được gọi tên chung là globulin miễn dịch (immunoglobulin), được sinh ra trong huyết thanh khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể phản ứng bằng cách sản sinh ra kháng thể để chống lại kháng nguyên. Tính chất đặc hiệu của kháng thể là kết hợp một cách đặc hiệu với kháng nguyên đã sinh ra nó (Đặng Đức Trạch và ctv., 1987; trích bởi Hoàng Hải Hóa, 2001). 2.10.2 Phản ứng ngƣng kết Là sự dính các vi khuẩn vào nhau thành đám nhờ có kháng thể tương ứng và khi có mặt dung dịch nước muối sinh lí (chất điện phân) (Vương Thị Việt Hoa và ctv., 1999). Đối với các kháng nguyên hữu hình như xác vi khuẩn, khi gặp kháng thể đặc hiệu, các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn, mắt thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp. Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu. Khi cho kháng nguyên hữu hình (tế bào vi khuẩn đã chết) trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, các vi khuẩn phân tán rời xa nhau trong hỗn dịch, sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám ngưng kết lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng. Trong thực tế, phản ứng ngưng kết xảy ra được còn phụ thuộc nhiều điều kiện khác nhau. (Lê Văn Hùng, 2002). Kháng thể gây ngưng kết gọi là kháng thể ngưng kết, còn kháng nguyên kích thích sinh ra kháng thể ngưng kết gọi là kháng nguyên ngưng kết. Phản ứng tạo ra cặn lợn cợn. Không phải chỉ có vi khuẩn có khả năng ngưng kết mà cả hồng cầu, nấm men, nấm mốc, tinh trùng... cũng có khả năng gây ngưng kết (Vương Thị Việt Hoa và ctv., 1999 25 III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian Từ ngày 1/3/2005 đến ngày 15/7/2005 3.1.2. Địa điểm Địa điểm thu mẫu: tại các bè nuôi xảy ra dịch bệnh. Địa điểm thí nghiệm: Trại thực nghiệm thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. Địa điểm phân tích mẫu: Phòng Bệnh học, Khoa Thủy sản, Trường đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu  Dụng cụ Đĩa petri Que cấy Lame và lamelle Ðèn cồn Erlen, bình tam giác Ống nghiệm Bơm tiêm Kéo Kẹp Ðĩa microplate 96 giếng (dạng hình chữ "U"). Pipetman và pipette  Thiết bị Kính hiển vi Tủ lạnh Cân phân tích Bể xi măng nuôi 0,75 m3 Máy sục khí Máy lắc (Stuart Scientific) 26 Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen)  Vật liệu Vi khuẩn Streptococcus sp. phân lập từ cá bị nhiễm bệnh do Streptococcus sp. tại thời điểm thực hiện đề tài. Thỏ Cá rô phi đỏ  Hóa chất Nước cất Dầu khoáng Cồn 96o Nước muối sinh lý 0,9% Môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutrient Agar) Môi trường canh dinh dưỡng NB (Nutrient Broth) Glycerol Thuốc gây mê (Ethylenglycol monophenylether – C2H10O2) Dung dịch formalin 36% (Xưởng sản xuất thực nghiệm, Công ty hóa chất vật liệu điện và vật tư khoa học kỹ thuật - Bộ Thương mại) . 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu cá bệnh Dụng cụ: túi nylon, bình oxy. Nguyên tắc thu mẫu: Ghi các triệu chứng cá bệnh trước khi thu mẫu. Không thu mẫu cá đã chết, mẫu thu phải có những biểu hiện bệnh lí đặc trưng. Số lượng mẫu thu: 5 – 10 mẫu. 3.3.2. Phƣơng pháp bảo quản và vận chuyển mẫu Mẫu cá bệnh được cho vào túi nylon chứa từ 1/3 – 1/2 lượng nước, sau đó bơm khí oxy vào rồi cột chặt túi lại. Vận chuyển mẫu cá bệnh đến nơi phân tích (Phòng thí nghiệm) càng nhanh càng tốt. 27 3.3.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh Phương pháp chung được thể hiện qua sơ đồ dưới đây: Mẫu cá Mổ khám Ghi nhận các dấu hiệu bệnh tích Lấy mẫu vi khuẩn (gan, thận, não) Cấy mẫu lên môi trường NA Xem xét khuẩn lạc Ghi nhận kết quả  Phƣơng pháp kiểm tra dấu hiệu bên ngoài và mổ khám bệnh tích -Kiểm tra các dấu hiệu bên ngoài: quan sát cách cá bơi, mắt, vảy, da, vây bụng, hậu môn và mang của cá bệnh, nhận định sự khác biệt so với cá khỏe. -Mổ khám bệnh tích bên trong: +Mổ xoang bụng cá: trước khi tiến hành mổ cá, cá cần được đánh vẩy sạch tại vị trí cần mổ, sau đó dùng bông tẩm cồn 70o sát trùng thật kĩ tại khu vực mổ để tránh sự nhiễm tạp của các vi khuẩn từ bên ngoài. -Đặt cá với phần bụng quay về phía người mổ. -Cắt bỏ vây lưng và vây ngực. -Mổ xoang bụng cá bằng 3 đường cắt: Đường thứ nhất: bắt đầu từ phía trước hậu môn cho đến phần đầu, dừng trước nắp mang. Đường thứ hai: bắt đầu từ trước hậu môn hướng lên phía trên theo thành bụng tiếp giáp thân về phía đầu đến phần mở của mang cá. Đường thứ ba: nối hai đường cắt trên. 28 Não cá (màu trắng đục) Hình 3.1 : Đƣờng cắt giải phẫu xoang cơ thể cá. -Dùng kẹp đã khử trùng gắp bỏ phần cơ bụng cá đã cắt. -Quan sát các mô và cơ quan sau: Quan sát dịch nhầy xoang bụng và màu của dịch nhầy, chất dịch có nhiều hay ít. Gan: kiểm tra màu sắc, bề mặt, rìa của gan. Lách: như trên Thận: kiểm tra màu sắc, kích cỡ. + Mổ phần đầu cá: dùng kéo cắt một đường ngay phía sau mắt cá, một đường ngay trên đỉnh nắp mang sao cho đối xứng qua sống lưng cá. Chiều dài đường cắt khoảng 1 cm. Cắt bỏ phần cơ và sụn giữa hai đường cắt, sẽ bộc lộ phần não của cá. Hình 3.2 : Giải phẫu não cá 29  Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Mẫu vi khuẩn thường được lấy ở gan, thận và não. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn mẫu từ thận và não cá vì sẽ hạn chế được sự nhiễm tạp các vi sinh vật không mong muốn từ bên ngoài. Dùng kẹp gạt các phần nội tạng sang một bên, thận cá nằm sâu trong xoang bụng cá, ngay phía dưới xương sống. Dùng mũi kéo đã khử trùng cắt một vết nhỏ trên thận. Đưa que cấy vòng nhúng vào chỗ cắt, sau đó cấy ria trên môi trường thạch NA. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 18 – 24 h. Đối với mẫu cấy từ não cũng thực hiện tương tự như khi lấy mẫu ở thận.  Phƣơng pháp xác định vi khuẩn Streptococcus sp. có trong mẫu Sau 24h nuôi cấy mẫu, ta tiến hành quan sát màu sắc, hình thái và mật độ của khuẩn lạc đã mọc. Khuẩn lạc Streptococcus sp. trên môi trường NA có màu trắng đục, hình tròn, rìa đều, bóng, lồi thấp, tâm hơi đậm, đường kính từ 0,5 – 0,7 mm. Chọn khuẩn lạc có đặc điểm trên cấy chuyền sang đĩa môi trường NA mới, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 h để phân lập dòng vi khuẩn. Từ đĩa cấy chuyền thu được, tiến hành lưu trữ vi khuẩn làm giống trong môi trường canh NB có bổ sung 50% glycerol (v/v). Để quan sát hình thái vi khuẩn, ta thực hiện bằng cách: dùng que cấy lấy một ít khuẩn từ một khuẩn lạc có hình thái đặc trưng trên cho lên lam kính có sẵn một giọt nước muối sinh lí, quan sát hình thái vi khuẩn với vật kính 40 của kính hiển vi. Streptococcus sp. có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp hoặc tạo thành chuỗi dài. Trong môi trường canh, Streptococcus sp. có dạng chuỗi dài hơn trong môi trường thạch. 3.3.4. Phƣơng pháp nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn Streptococcus sp. dạng FKC (Formalin Killed Cell)  Phƣơng pháp nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn Dùng que cấy vòng đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống vi khuẩn gốc cấy lên đĩa môi trường NA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h. Đây là bước tăng sinh sơ khởi (tiền tăng sinh) để chọn được khuẩn lạc như mong muốn và số lượng cần thiết. 30 Chọn khuẩn lạc mong muốn cấy vào bình môi trường NB. Nút chặt bình, nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng trong 24h. Yêu cầu là bình nuôi cấy phải lớn để có thể thu được sinh khối vi khuẩn mong muốn.  Phƣơng pháp tạo FKC Sau 24 h nuôi cấy, môi trường trở nên đục do vi khuẩn phát triển nhiều. Để kiểm tra sự tạp nhiễm, lấy mẫu cho lên lam kính, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40, xem xét hình thái đặc trưng của vi khuẩn và các vi sinh vật có hình thái khác. Dùng pipette hút dung dịch formalin 36% với số thể tích bằng 0,5% thể tích môi trường có trong bình (Theo Aasjord P. M. và Slinde E., 1994). Trộn đều, để qua đêm. Với nồng độ trên, formalin sẽ giết chết hết số vi khuẩn có trong bình. Đem li tâm huyền dịch vi khuẩn ở 6000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ phần nước nổi. Rửa lại bằng nước muối sinh lí 0,9% liên tiếp 3 lần để xả sạch hết formalin. Xác vi khuẩn thu được sẽ có màu trắng, đựơc gọi là vi khuẩn dạng FKC. Số vi khuẩn thu được đem cân để xác định khối lượng, rồi pha loãng bằng nước muối sinh lí để thu được huyễn dịch FKC có nồng độ 10 mg/ml. Để kiểm chứng vi khuẩn đã bị tiêu diệt hoàn toàn, dùng que cấy vòng lấy một ít mẫu cấy từ bình nuôi NB đã cho formalin lên đĩa môi trường NA, đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát sự xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn trong một tuần liên tục. Nếu không thấy bất kì khuẩn lạc xuất hiện thì vi khuẩn đã hoàn toàn bị tiêu diệt. 3.3.5. Phƣơng pháp cấp huyền dịch vi khuẩn dạng FKC và gây cảm nhiễm cho c