Khóa luận Định danh và phân nhóm nấm Trichoderma SPP phân lập tại Việt Nam

, chỉ dựa vào vùng ITS – rDNA sẽ ko hoàn toàn chính xác vì các loài vẫn có sự tƣơng đồng lớn về trình tự vùng này do đây là vùng bảo tồn. Do đó, việc xác định vùng gen chuyên biệt hơn nhƣ vùng gene mã hoá actin (act1), calmodulin (cal1), endochitinase 42 (ech42) và vùng tef1 sẽ giúp việc định danh chính xác hơn, phân biệt đƣợc giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Lại Hà Tố Hoa (2006), khuyếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với 2 cặp primer ITS4 – ITS5 và ElongR – ElongF của dòng Trichoderma T4 (đƣợc TS. Lê Đình Đôn và cs phân lập và định danh bằng hình thái tại bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từ mẫu đất tại huyện Củ Chi, Tp. HCM), giải trình tự và so sánh với những dòng Trichoderma trên cơ sở dữ liệu NCBI và khẳng định tên loài của dòng T4 là Trichoderma asperellum. Có mức độ tƣơng đồng của vùng ITS – rDNA và vùng tef1fw – tef2rev cùng là 98%. 15 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Khóa luận tốt nghiệp này đƣợc thực hiện từ 19/3/2007 đến 8/2007 tại phòng Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Công nghệ môi trƣờng – phòng Công nghệ sinh học thực vật, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu Là 11 dòng Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau ở Việt Nam, đã đƣợc định danh bằng hình thái và xác định tính đối kháng với các nấm gây bệnh hại cây trồng bởi TS. Lê Đình Đôn và cs, tại bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, dựa theo khóa phân loại Trichoderma của Gary J. Samuels (2004) và tiêu bản chuẩn. Bảng 3. 1 Các dòng nấm sử dụng để định danh và phân nhóm trong đề tài Ký hiệu Tên loài định danh dựa vào hình thái Địa điểm phân lập (Quận-Huyện, Tỉnh- Thành phố (đối tƣợng lấy mẫu)) Tính đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng T38 T. virens Quận Thủ Đức, Tp.HCM (đất) Sclerotium rolfsii (+++) * Pythium spp. (+++) Phytophthora spp. (+) * T14 T. harzianum Huyện Đa Oai, Lâm Đồng (sầu riêng) Rhizoctonia solani (+++) Pythium spp. (+++) Pythium spp. (+) Phytophthora spp. (++) * T6 Chƣa xác định Tiền Giang (dứa) Pythium spp. (++) Phytophthora spp. (++) Sclerotium rolfsii (++) 16 T37 T. sinensis Đồng Nai (sầu riêng) Rhizoctonia solani (+++) Phytophthora capsici (+++) T33 T. asperellum Kiên Giang (dứa) Rhizoctonia solani (+++) Phytophthora capsici (+++) T19 T. asperellum Tây Ninh (đậu phụng) Chƣa xác định T2 T. asperellum hoặc T. harzianum Lâm Đồng (trà) Chƣa xác định T42 T. viride Bình Phƣớc (dứa) Chƣa xác định T88 T. asperellum Đồng Nai (đất) Fusarium spp. (+++) Phytophthora spp. (+++) Sclerotium rolfsii (+++) T85 T. harzianum Nghệ An (đất rừng) Fusarium spp. (+) T68 T. atroviride Bình Phƣớc (đất rừng) Sclerotium rolfsii (+++) Rhizoctonia solani (+++) Fusarium spp. (+) (*): (+++) đối kháng mạnh, (++) đối kháng trung bình, (+) đối kháng yếu. 3.2. Hoá chất Môi trƣờng CAM để lƣu trữ nguồn Trichoderma: thành phần gồm bột bắp (30 g), đƣờng dextrose (20 g), agar (15 – 20 g) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Môi trƣờng PGA (Potato Glusose Agar) để phục hồi Trichoderma: thành phần gồm khoai tây (200 g), glucose (20 g), agar (15 – 20 g) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Môi trƣờng nhân sinh khối Trichoderma: thành phần gồm yeast extract (5 g), KH2PO4 (0.5 g), K2HPO4 (0.5 g), MgSO4 (0.5 g), glucose (20 g), CaCl2 (rất ít) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Ly trích DNA tổng số Trichoderma: nitơ lỏng, lysis buffer, phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25: 24: 1), chloroform/ isoamyl alcohol (24: 1), isopropanol, ethanol 70 %, dung dịch TE 1X Hoá chất cho điện di: gel agarose (gồm glucose và agar), đệm TAE 0.5X (dùng 17 để pha gel và làm buffer chạy điện di), ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích) và blue loading dye 6X (Promega) Hoá chất cho phản ứng PCR (Promega): Taq DNA polymerase, 10X PCR buffer, dNTP, MgCl2, forward primer và reverse primer. 3.3. Dụng cụ và thiết bị Bình tam giác (250 ml, 500 ml (Đức)), giấy nhôm, nồi nấp khử trùng Tommy (Mỹ), máy lắc định ôn, máy vortex (IKA Works), ống nghiệm dung tích 15 ml (Đức), bộ cối chày nghiền mẫu (Đức), micropipette (10 l, 100 l, 1000 l (Đức)), tủ lạnh (-70 0C, -20 0C, - 4 0C (Sanyo – Nhật)), máy cất nƣớc 2 lần, máy chụp gel (Biorad – Mỹ), cối sứ và chày giã (Đức), eppendorf (0.2 ml, 05 ml, 1.5 ml (Mỹ), cân phân tích 4 số (Ohaus – Mỹ), máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc), pipet các loại (Nichiryo – Nhật), máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức), bồn ủ nhiệt (Memmert), máy điện di (Cosmo Bio Co. – Nhật) và lò viba (Electrolux – Thụy Điển) 3.4. Phục hồi các dòng Trichoderma: từ những ống nghiệm lƣu trữ nguồn. Cách pha 1 lít môi trƣờng PGA: 200 g khoai tây đƣợc gọt vỏ cắt nhỏ và đun sôi, lọc qua vải để chỉ lấy phần dịch nƣớc. Thêm vào đó lƣợng glucose, agarose nhƣ trên và lƣợng nƣớc cho vừa đủ 1 lít. Đun hỗn hợp trên cho đến khi agarose và glucose tan ra đều. Môi trƣờng PGA đƣợc cho vào bình tam giác và hấp khử trùng ở 121 0C trong 20 phút bằng autoclave. Để môi trƣờng nguội bớt rồi đổ khoảng 15 ml môi trƣờng vào đĩa petri sạch (90 mm), để nguội môi trƣờng sẽ đông cứng lại. Dùng que cấy lấy những bào tử từ ống lƣu trữ nguồn Trichoderma, đặt lên giữa mặt thạch PGA trong đĩa petri. Sau 2 – 3 ngày các khuẩn ty Trichoderma sẽ mọc bên trên bề mặt đĩa. 3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma Nhân sinh khối Trichoderma: trong môi trƣờng nhân sinh khối nấm lỏng lắc. Chuẩn bị môi trƣờng: Tất cả các thành phần môi trƣờng đƣợc cho vào một với lƣợng nƣớc cất vừa đủ dung lƣợng cần thiết, khuấy đều. Cho vào mỗi bình tam giác 100 ml môi trƣờng. Hấp khử trùng trong 20 phút ở 121 0C. Để nguội. Cắt 2 khoảng nhỏ thạch chứa sợi nấm mọc trên môi trƣờng PGA cho vào 18 những bình tam giác trên. Rồi đem lắc với cƣờng độ 150 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng, để sợi nấm tiếp xúc tối đa với môi trƣờng vì thế sợi nấm luôn ở trạng thái sinh trƣởng mạnh nên không mọc bào tử. Lắc liên tục cho đến khi sợi nấm mọc nhiều và đều khắp môi trƣờng (khoảng 2 – 3 ngày), dừng lại và thu lấy sợi nấm. Cách thu lấy sợi nấm: Dùng vải và phễu lọc đã hấp khử trùng và sấy khô để lọc thu lấy phần sợi nấm, vắt kiệt nƣớc rồi bỏ vào giấy bạc, cán mỏng để khi nghiền trong nitơ lỏng đƣợc dễ dàng, bảo quản ở -70 0C. 3.6. Ly trích DNA tổng số Trichoderma Tham khảo tài liệu của Sambrook và cs (1989), chúng tôi ly trích DNA nấm Trichoderma theo phƣơng pháp Lysis buffer có cải tiến cho phù hợp điều kiện nghiên cứu. Lƣợng mẫu cần ly trích chiếm 1/ 3 thể tích mỗi ống nghiệm. Bƣớc 1: Nghiền sinh khối Trichoderma trong nitơ lỏng đến khi mịn, cho vào các ống nghiệm (thể tích 15 ml). Bƣớc 2: Thêm vào 3 ml lysis buffer. Trộn đều, ủ ấm ở 65 0C trong vòng 1 – 2 giờ. Bƣớc 3: Tiếp tục thêm vào 1 ml phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1). Nhẹ nhàn lắc đều. Ly tâm 10 phút với tốc độ 4000 vòng/ phút ở 10 0C. Hút lấy phần dịch nổi ở trên (2 – 3 ml), cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác. Bƣớc 4: Thêm vào 1 ml chloroform/ isoamylalcohol (24: 1). Trộn đều, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút trong 10 phút ở 10 0C. Hút lấy phần dịch nổi ở trên (2 – 3 ml), cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác. Bƣớc 5: Thêm vào một lƣợng isopropanol tỉ lệ khoảng 0.6 tổng thể tích của ống nghiệm. Đảo đều, nhẹ, để qua đêm ở -20 0C (hoặc để nhiệt độ phòng 5 – 10 phút). Bƣớc 6: Dùng que thu DNA tủa thành cụm ở đáy ống Bƣớc 7: Rửa tủa DNA trong ethanol 70 %, lập lại 3 – 4 lần. Bƣớc 8: Phơi tủa DNA thật khô (trong 2 – 3 giờ). Pha loãng bằng 1 ml TE 1X. 3.7. Kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA Để kiểm tra kết quả ly trích có thu đƣợc DNA tổng số hay không và DNA pha loãng có nồng độ thích hợp để thực hiện phản ứng PCR hay chƣa, chúng tôi tiến hành điện di sản phẩm ly trích và pha loãng trên gel agarose 1%. 19 Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1 %, cân 0.25 g agarose cho vào 25 ml TAE 0.5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò viba ở 650 W trong 2 phút. Để chai nguội lại khoảng 50 – 60 0C, đổ vào khuôn thật bằng phẳng có gắn lƣợc 12 – 18 giếng. Chờ gel đông (khoảng 15 phút), lấy lƣợc ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu. Bƣớc 2: Nạp mẫu, xác định các thông số điện di và đọc kết quả Đối với DNA tổng số: Dùng micropipette hút lấy 2 l mẫu, trộn đều với 2 l blue loading dye buffer 6X, hút tổng lƣợng thể tích là 4 l bơm vào 1 giếng trên gel agarose 1 %. Làm tƣơng tự với các mẫu khác. Tiến hành điện di bảng gel đó trong dung dịch đệm TAE 0.5 X, hiệu điện thế 110 V, cƣờng độ dòng điện 400 A trong 20 phút. Sau đó, bảng gel đƣợc chuyển vào thuốc nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 phút, rửa sạch và chụp gel bằng tia tử ngoại (UV) của máy Gel doc 2000 (Biorad) và kết quả đƣợc đọc bằng phần mềm Quality One. Nếu sản phẩm ly trích có DNA tổng số thì trên gel điện di sẽ có band DNA phát sáng dƣới dạng vạch. Mức độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. Từ đó, kết hợp với những hiểu biết về phƣơng pháp định lƣợng nồng độ DNA bằng phân tử Mass (mục 2.8.3, phần 2 tổng quan tài liệu), chúng tôi có thể ƣớc lƣợng nồng độ DNA ly trích đƣợc và dự đoán đƣợc độ pha loãng. Đối với DNA pha loãng: Mỗi mẫu lấy 4 l trộn với 2 l loading buffer 6X, thao tác tiến hành tƣơng tự nhƣ trên. Kết quả thu đƣợc cho phép ta xác định đƣợc nồng độ cần thiết để chọn lấy và thực hiện phản ứng PCR. 3.8. Phản ứng PCR DNA làm khuôn: thu nhận qua quá trình ly trích DNA bộ gen của nấm Trichoderma, sau đó pha loãng đến nồng độ DNA thích hợp cho phản ứng PCR khoảng 15 – 20 ng/ µl. Primer: PCR khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 với primer ITS4 và ITS5 (White và cs, 1990) và dựa vào sơ đồ, cấu trúc primer trên toàn vùng tef1 do Chaverri, P. và cs thiết lập năm 2003, chúng tôi chọn cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R (Carbone và Kohn, 1999) để khuếch đại một phần của vùng tef1. 20 Bảng 3. 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng Primer Trình tự primer theo chiều 5’- 3’ ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G EF1 – 728F CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG EF1 – 986R TAC TTG AAG GAA CCC TTA CC Hình 3. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5 Hình 3. 2 Sơ đồ các primer trên toàn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Các thành phần phản ứng PCR đƣợc phối trộn theo thứ tự đƣợc liệt kê ở bảng bên dƣới để đảm bảo hiệu quả cho phản ứng do Taq DNA polymerase khi trộn vào hỗn hợp phản ứng PCR sẽ hoạt động ngay. 21 Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lƣợng dùng cho một phản ứng Thành phần Thể tích sử dụng ( l) Nồng độ cuối Nƣớc cất 31.75 PCR buffer 10X 10.00 1.0X MgCl2 3.00 1.5 mM dNTP 0.50 0.2 mM Primer 1 1.50 10.0 pmol/ l Primer 2 1.50 10.0 pmol/ l Khuôn DNA 1.50 15.0 ng/ l Taq DNA polymerase 0.25 5.0 U/ l Tổng cộng 50.00 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: tham khảo, kết hợp và cải tiến quy trình của Wang C. Z. (2002), White và cs. (1990), Carbone và Kohn (1999) và VBI – CLF (2002) cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Bảng 3. 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR Cặp primer ITS4 và ITS5 Cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 95 3 phút 1 95 3 phút 2 – 31 95 1 phút 2 – 31 95 1 phút 58 45 giây 58 45 giây 72 1 phút 72 1 phút 31 72 10 phút 31 72 10 phút 3.9. Đánh giá kết quả PCR Thực hiện tƣơng tự nhƣ phần đánh giá DNA pha loãng ở mục 3.7 (kiểm tra kết quả ly trích và pha loãng DNA). Các dòng nấm khác nhau đƣợc khuếch đại cùng 22 một cặp primer, trên band điện di không thể phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa các dòng này, do đó cần phải giải trình tự sản phẩm PCR để phân tích. 3.10. Định danh tên loài 11 dòng Trichoderma Sản phẩm PCR của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng nấm Trichoderma khảo sát đƣợc giải trình tự ở công ty Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma khảo sát đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI. Dựa vào độ tƣơng đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài của 11 dòng Trichoderma khảo sát. Dữ liệu trên NCBI đƣợc chúng tôi so sánh với nhau (bằng phần mềm Clustal X 1.83) trong phạm vi từng loài để chọn ra trình tự ổn định nhất (không có đột biến) và 1 – 2 trình tự đột biến phổ biến (không có đột biến điểm đơn lẻ). Việc làm này nhằm loại bỏ hiện tƣợng trình tự dòng khảo sát có tỉ lệ tƣơng đồng cao với trình tự đột biến của loài khác, sẽ làm nhiễu kết quả so sánh trình tự. Các loài đƣợc sử dụng cho so sánh dựa theo tiêu chí Loài đƣợc định danh dựa vào hình thái. Loài có đặc điểm gần giống về hình thái với loài định danh dựa vào hình thái. Bảng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dòng Trichoderma trên NCBI Tên loài Mã số truy cập Địa điểm phân lập Thời gian công bố Tác giả T. asperellum AY266673 Trung Quốc 01-04-2003 Zhang,C.L. và Xu,T. AY380912 Mỹ 03-09-2003 Samuels,G.J. và cs T. atroviride AY585878 Hungary 08-07-2004 Kredics,L. và cs Z48818 Đức 29-03-1995 Kuhls,K. T. hamatum AJ507086 Úc 28-08-2002 Wuczkowski,M. và Kubicek,C.P. Z48816 Đức 29-03-1995 Kuhls,K. T. harzianum AF455502 Úc 04-12-2001 Buzina,W. và cs 23 AF362101 Hàn Quốc 19-03-2001 Park,D.S. và cs T. koningii DQ313146 Canada 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs DQ313135 Brazil 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs T. longibrachiatum AY328038 Hungary 08-07-2004 Kredics,L. và cs DQ297053 Mexico 15-11-2005 Sanchez,V. và cs T. reesei X93938 Đức 04-12-1995 Kuhls,K. và cs T. sinensis DQ083012 Đài Loan 01-06-2005 Samuels,G.J. T. tomentosum AY154932 Iran 24-09-2002 Zafari,D. DQ085432 Canada 03-06-2005 Samuels,G.J. T. virens AF057599 Hoa Kỳ 31-03-1998 Ospina,M.D. và cs AF099008 Hoa Kỳ 16-10-1998 Samuels,G.J. và cs. T. viride DQ313155 New Zealand 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs DQ315439 Anh 02-12-2005 Samuels,G.J. và cs Bảng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dòng Trichoderma trên NCBI Tên loài Mã số truy cập Địa điểm phân lập Thời gian công bố Tác giả T. asperellum AY376058 Hoa Kỳ 28-08-2003 Holmes,K.A. và cs AY857274 Úc 13-12-2004 Druzhinina,I.S. và cs T. atroviride AF348112 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs DQ307550 Sri Lanka 28-11-2005 Samuels,G.J. T. harzianum AF348101 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs AF348103 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs T. koningii DQ288997 Ecuador 14-11-2005 Samuels,G.J. và cs DQ289002 Brazil 14-11-2005 Samuels,G.J. và cs 24 T. longibrachiatum AY937412 Hoa Kỳ 17-02-2005 Samuels,G.J. DQ297066 Mexico 15-11-2005 Sanchez,V. và cs T. saturnisporum AY937414 Nam Phi 14-09-2004 Samuels,G.J. T. sinensis AY750888 Đài Loan 14-09-2004 Samuels,G.J. T. tomentosum AY750882 Canada 14-09-2004 Samuels,G.J. Gliocladium flavofuscum AY750891 Hoa Kỳ 14-09-2004 Samuels,G.J. Hypocrea virens AY750894 Cote d'Ivoire 14-09-2004 Samuels,G.J. T. viride AF348116 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs DQ307555 CH. Czech 28-11-2005 Samuels,G.J. và cs 3.11. Phân nhóm xác điṇh mối quan hê ̣di truyền giữa 11 dòng Trichoderma Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma. Chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6 từ đó phân nhóm xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. 3.12. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dòng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đó xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. 25 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả ly trích DNA tổng số Trichoderma Ly trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó là yếu tố quan trọng hàng đầu quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Đối với Trichoderma, việc ly trích gặp nhiều khó khăn do thành tế bào rất mỏng và mềm vì đƣợc cấu tạo chủ yếu bằng chitin thay vì cellulose nhƣ ở thực vật do đó rất dễ vỡ trong quá trình nghiền, bên trong tế bào chất lại chứa hàm lƣợng lớn polysaccharide, protein và lipid. Qui trình ly trích DNA của chúng tôi đơn giản nhƣng vẫn thu đƣợc DNA có độ tinh khiết cao. Do ở qui trình này, mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng (giúp bảo vệ thành tế bào) đến khi thật mịn để các tế bào tách rời nhau ra, tạo điều kiện thuận lợi cho lysis buffer tác dụng phá thành tế bào. Mặt khác, việc sử dụng phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1), sau đó thêm bƣớc sử dụng chloroform/ isoamylalcohol (24: 1) giúp DNA tách ra khỏi protein và loại hết loại bỏ hết protein, polysaccharide, lipid, RNA có trong mẫu và phenol còn sót lại. Đồng thời, chúng tôi ly tâm tốc độ thấp (4000 vòng/ phút) kết hợp với kéo dài thời gian vừa phải (10 phút) ở nhiệt độ thấp (10 0C) giúp giảm sự gãy của DNA nhƣng vẫn đảm bảo sự phân lớp và tác dụng của các hóa chất. Ngoài ra, việc tủa DNA bằng isopropanol (lạnh) để qua đêm và bƣớc dùng que thu tủa DNA mà không cần ly tâm giúp DNA bớt gãy vụng và thu đƣợc DNA tinh hơn. Do đó, DNA ly trích đƣợc với độ tinh khiết cao, đảm bảo cho phản ứng PCR đƣợc xảy ra. Dựa vào những hiểu biết về phƣơng pháp “định lƣợng DNA bằng phân tử Mass” (mục 2.8.3), chúng tôi định lƣợng DNA ly trích đƣợc khoảng 150 ng/ µl. 26 Hình 4. 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút Dựa vào band DNA thu nhận đƣợc từ kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, tiến hành pha loãng DNA tổng số đến nồng độ thích hợp thực hiện phản ứng PCR. Nồng độ DNA sau khi pha loãng khoảng 15 ng/ µl Hình 4. 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc sau khi pha loãng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút 4.2. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 Dựa vào thang ladder cho thấy qui trình PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4/ ITS5 và một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F/ EF1 – 986R cho kết quả thể hiện bằng điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, có kích thƣớc lần lƣợt là 600 bp và 320 bp. Tất cả các mẫu đều xuất hiện band mong muốn và hoàn toàn không có band phụ, chỉ có 1 trong tổng số 11 mẫu với cặp 27 primer ITS4 và ITS5 cho band mờ (mẫu T88), mẫu này khi thực hiện PCR lại chúng tôi tăng lƣợng DNA khuôn lên gần gấp đôi (2.5 ml) thì kết quả PCR cho band sáng rõ, không có band phụ. Hình 4. 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, có kích thƣớc 600 bp Hình 4. 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R, có kích thƣớc 320 bp 4.3. Kết quả định danh tên loài Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dòng Trichoderma khảo sát đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI. Dựa vào độ tƣơng đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đó xác định tên loài của 11 dòng Trichoderma khảo sát. Dòng T37: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. sinensis, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T37 là Trichoderma longibrachiatum. 28 Bảng 4. 1 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T37 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) (mã số truy cập-tên loài-địa điểm phân lập) 1: X93938-T.reesei-Đức 100 99 99 99 99 99 98 2: AY328038-T.longibrachiatum-Hunrary 99 100 99 99 99 99 98 3: DQ297053-T.longibrachiatum-Mexico 99 99 100 100 100 99 99 4: T37-T.sinensis-ITS_rDNA-Việt Nam 99 99 100 100 100 99 99 5: Z48726-T.saturnisporum-Đức 99 99 100 100 100 100 99 6: AF048744-T.saturnisporum-Hàn Quốc 99 99 99 99 100 100 99 7: DQ083012-T.sinensis-Đài Loan 98 98 99 99 99 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: DQ297066-T.longibrachiatum-Mexico 100 100 99 78 78 81 84 2: T37-T.sinensis-tef1-Việt Nam 100 100 99 67 67 69 75 3: AY937412-T.longibrachiatum-Hoa Kỳ 99 99 100 76 75 80 84 4: AY750888-T.sinensis-Đài Loan 78 67 76 100 99 85 79 5: AY750889-T.sinensis-Đài Loan 78 67 75 99 100 85 78 6: AY937414-T.saturnisporum-Nam Phi 81 69 80 85 85 100 78 7: Z23012-T.reesei-Phần Lan 84 75 84 79 78 78 100 Dòng T42: Với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái là T. viride, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T42 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 2 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T42 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY585878-T.atroviride-Hungary 100 100 100 100 99 99 99 98 99 2:Z48818-T.atroviride-Đức 100 100 100 100 100 99 98 98 98 3:DQ313146-T.koningiopsis-Canada 100 100 100 100 100 99 99 98 99 4:DQ313135-T.koningiopsis-Brazil 100 100 100 100 100 99 99 98 99 5:DQ313155-T.viride-New Zealand 99 100 100 100 100 100 98 98 98 6:DQ315439-T.viride-Anh 99 99 99 99 100 100 98 98 98 7:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 99 98 99 99 98 98 100 100 100 8:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 98 98 98 98 98 100 100 100 9:T42-T.viride-ITS_rDNA-Việt Nam 99 98 99 99 98 98 100 100 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 100 99 90 91 89 88 86 77 84 2:DQ307555-T.viride-CH.Czech 99 100 89 92 89 89 85 78 84 3:AF348112-T.atroviride-Hoa Kỳ 90 89 100 96 88 89 87 79 86 4:DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 91 92 96 100 90 91 87 85 88 5:DQ288997-T.koningii-Ecuador 89 89 88 90 100 96 84 78 85 6:DQ289002-T.koningii-Brazil 88 89 89 91 96 100 84 78 84 7:AY857274-T.asperellum-Úc 86 85 87 87 84 84 100 92 100 8:T42-T.viride-tef1-Việt Nam 77 78 79 85 78 78 92 100 92 9:AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 84 84 86 88 85 84 100 92 100 Dòng T38: Với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các loài trên NCBI, chúng tôi xác định dòng T38 chỉ có thể 29 là T. virens hay Gliocladium flavofuscum (là một teleomorph của T. virens) hoặc Hypocrea virens (cũng là một teleomorph của T. virens) nhƣng kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái (là T. virens), chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T38 là Trichoderma virens. Bảng 4. 3 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T38 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY154935-T.spirale-Iran 100 100 99 99 98 98 98 2: DQ083014-T.spira-Thái Lan 100 100 99 99 98 98 98 3: AF099008-T.virens-Hoa Kỳ 99 99 100 100 98 98 98 4: T38-T.virens-ITS_rDNA -Việt Nam 99 99 100 100 98 98 98 5: AF362101-T.inhamatum-Hàn Quốc 98 98 98 98 100 99 99 6: AF455502-T.inhamatum-Úc 98 98 98 98 99 100 99 7: AF057599-T.virens-Hoa Kỳ 98 98 98 98 99 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY750890-T.spirale-Thái Lan 100 97 89 84 89 85 86 2: AY750896-T.spirale-Canada 97 100 89 84 89 86 86 3: AY750894-H.virens-Cote.d'Ivoir 89 89 100 96 99 85 85 4: T38-T.virens-tef1-Việt Nam 84 84 96 100 96 76 76 5: AY750891-G.flavofuscum-Hoa Kỳ 89 89 99 96 100 85 85 6: AF348101-T.harzianum-Hoa Kỳ 85 86 85 76 85 100 93 7: AF348103-T.harzianum-Hoa Kỳ 86 86 85 76 85 93 100 Dòng T19: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA với các loài trên NCBI, chúng tôi khẳng định tên loài chính xác của dòng T19 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 4 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dòng T19 với các loài trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:DQ313155-T.viride-New Zealand 100 100 100 99 98 98 98 97 97 2:DQ315439-T.viride-Anh 100 100 99 99 97 97 97 97 97 3:Z48818-T.atroviride-Đức 100 99 100 100 97 97 98 97 97 4:AY585878-T.atroviride-Hungary 99 99 100 100 98 98 98 97 97 5:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 97 97 98 100 100 100 99 99 6:T19-T.asperellum-ITS_rDNA-Việt Nam 98 97 97 98 100 100 100 99 99 7:A