Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển (Avicennia marina) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

tuyên truyền giáo dục ngƣời dân nâng cao ý thức bảo vệ rừng… Ban Quản lý khu dự trữ sinh quyển: Ban quản lý khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ dƣới sự quản lý và chỉ đạo trực tiếp của Ủy ban Nhân dân huyện Cần Giờ và Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn với vai trò và nhiệm vụ điều phối tổng thể các hoạt động trên theo đúng tiêu chí của khu dự trữ sinh quyển là kết hợp hài hoà giữa bảo tồn và phát triển kinh tế, đồng thời tạo điều kiện triển khai các đề tài nghiên cứu khoa học, tuyên truyền giáo dục và đào tạo, mở rộng hợp tác quốc tế. 2.3 Cây mắm biển. Tên Việt Nam: Mắm biển Tên La Tinh: Avicennia marina Họ: Verbenaceae Chi: Avicennia Lớp: Magnoliopsida Bộ: Lamiales Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm 2.3.1 Hình thái học Cây mắm có thể đạt đƣờng kính gốc và chiều cao khác nhau, có loài đạt đƣờng kính gốc 60 cm và chiều cao 30 m. Cây mắm trƣớc đây dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc biến chế dƣợc liệu và cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da. Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi (cặc mắm) có nhiệm vụ hấp thụ dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phối cũng là "kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi. 12 Vì thiếu cây giống để trồng bảo vệ ven biển và đất bồi, một số nƣớc đã có lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm, đƣớc và vẹt [19].  Hình dáng: Cây gỗ, cao đến 10 m với đƣờng kính 0,5 m, nhánh thấp, tán rộng, cành non, có lông tơ màu trắng hay xám, thân ít khi thẳng, vỏ không nứt, màu trắng với lớp vỏ cóc có dạng phiến mỏng (giống nhƣ vỏ ổi), rễ phổi đứng.  Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến nguyên láng, mỏng, thƣờng quăn queo, hình xoan, đầu nhọn hay tù, chân nêm, dài 3 – 5 cm, bìa nguyên, hơi dợn sóng và có lông ở gân phụ, cuống dài 0,5 cm, nhiều lông nhỏ.  Rễ: Rễ phổi đứng.  Hoa: Hoa vàng, to 5 – 8 mm, có mùi thơm mạnh, tạo thành tán - gié ở ngọn, thƣờng có 3 nhánh, lá bắc phụ hình bầu dục, lõm, tai đài không bằng nhau và có lông tơ, vành hình ống, ngắn hơn cánh, có thùy bằng nhau, dài 1 – 2 mm, tròn dài, 4 tiểu nhị: (2 dài, 2 ngắn), bầu nhụy hình trụ, tròn ở dƣới, không vòi nhụy. Trổ bông vào tháng 10 - 12 dƣơng lịch.  Quả: Trái hình tim, dài 1,5 – 2 cm, vỏ màu vàng xanh, đầy lông mịn. Cho trái mắm vào tháng 4 - 6 dƣơng lịch. 2.3.2 Nơi sống và sinh thái. Tại rừng sát Cà Mau, thƣờng gặp loài này trên đất bồi đã dẽ chặt, dọc bờ biển ít ngập bởi nƣớc triều, tạo thành quần thụ đơn thuần hoặc hỗn giao với các loài Avicennia officinalis (mắm đen), Excoecaria agallocha (giá) và Ceriop decandra (dà quánh). 2.3.3 Phân bố  Việt Nam: Bà Rịa – Vũng Tàu, Cà Ná, Phan Rang (Bình Thuận).  Thế giới: Thái Lan, Inđônexia, Philippin, Ai Cập, Soudan, Ả Rập, Phi Châu, Bồ Ðào Nha, Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Xri Lanca, Trung Hoa (Hải Nam), Ðài Loan, Hồng Kông, Nhật (Ryukyu), Tân Tây Lan, Madagascar, Úc Châu ... 13 2.4 Quy trình ly trích DNA thực vật Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997)… Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng đƣợc cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Phƣơng pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bƣớc:  Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền). Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thuỷ phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-196oC). Sau đó sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hóa học).  Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/ nƣớc). Mẫu đƣợc lắc nhẹ trong dung dịch phenol/chloroform/iso amylalcohol (tỉ lệ 25/24/1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol, chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.  Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhƣng thông thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận 14 lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: - DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. - Có lẫn tạp RNA trong mẫu DNA. - Có lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA. - Có lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA. 2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm. Sự hấp thụ này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA có trong mẫu ly trích. Sự hấp thụ ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260 nm tƣơng ứng với:  50 g/ml DNA sợi đôi.  40 g/ml DNA sợi đơn hay RNA.  20 g/ml oligonucleotide sợi đơn. ` Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta có thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide trong mẫu ly trích. Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Ngoài đỉnh hấp thụ là 280 nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các acid nucleotide và làm 15 sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide. Để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của mẫu ly trích ngƣời ta tính tỷ lệ OD260 nm/OD280 nm.  Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 thì mẫu ly trích đƣợc xem là sạch.  Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, việc định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lƣợng của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lƣợng DNA ly trích, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel. 2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di Nguyên tắc của kỹ thuật điện di: Trong một điện trƣờng, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lƣợng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngƣợc dấu nhanh hơn. Đối với phân tử DNA, việc điện di đƣợc thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là môi trƣờng xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích thƣớc phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel đƣợc sử dụng tùy theo kích thƣớc và mức độ phân tách của phân tử acid nucleotide: Gel agarose và gel polyacrylamide.  Gel agrose: Lỗ có đƣờng kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thƣớc 300 - 10000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau. Bảng 2.1. Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose với các nồng độ khác nhau Nồng độ gel agarose (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (kb) 0,6  0,8 0,9  1,2 1,2  1,5 1 20 0,5  7 0,5  5 16  Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 500bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide. (Lƣu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi sử dụng. Bảng 2.2. Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau Nồng độ gel polyacrylamide (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (bp) 4 5 8 11 200  800 80  200 40  100 10  50 Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp phát hiện nhƣ sau: Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết đƣợc chất lƣợng của DNA ly trích nhƣ gẫy, lẫn tạp… 2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền 2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác 17 với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là tính đa dạng di truyền [2]. Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài. Ngƣời ta thƣờng tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra đƣợc sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị.[2]. Có 3 loại chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng: - Chỉ thị hình thái. - Chỉ thị isozyme. - Chỉ thị phân tử. 2.5.1.1 Chỉ thị hình thái Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ đƣợc liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà ngƣời ta có thể phát hiện đƣợc. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lƣợng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện đƣợc, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp. 2.5.1.2 Chỉ thị isozyme Là những chỉ thị protein. Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một vài gene, do vậy ngƣời ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị. Dựa vào hàng loạt những enzyme giống nhau đƣợc mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một locus. Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, isozyme có thể đƣợc phân tách bằng điện di. Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ. Kết quả mà chỉ thị isozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lƣợng chỉ thị có thể phát hiện đƣợc nhiều hơn, tuy nhiên số lƣợng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng [2]. 18 2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA. Là những chỉ thị phân tử DNA đƣợc tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử. Có thể nói rằng kể từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học do số lƣợng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Càng ngày ngƣời ta càng tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị, tuy nhiên có thể đƣợc chia ra làm 2 nhóm:  Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…  Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA nào đó trong ống nghiệm, phƣơng pháp này có ba axit nucleic: một DNA dây đôi cần phải khuyếch đại, hai sợi đơn đóng vai trò mồi (primer) với kích thƣớc rất ngắn chạy theo chiều thuận và chiều nghịch trên DNA nền, thêm vào là DNA polymerase, dNTP và một muối Mg2+. 2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR Đƣợc miêu tả qua 3 giai đoạn:  Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao (khoảng 92oC – 96oC) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng DNA mạch đôi tạo ra nó.  Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung. Primer là các oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn nào đó trên DNA khuôn. Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 50oC – 56oC. 19  Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ nucleotide cuối cùng của primer ở đầu 3’ do tác dụng của enzyme polymerase gắn các nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những nucleotide của mạch khuôn (DNA template). Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về chiều dài và trình tự các nucleotide. Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở 70oC – 72oC. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA template), các dNTP, enzyme polymerase, các primer, MgCl2, dung dịch đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ. Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất: Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR: Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 45 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài 20  Nồng độ enzyme: Thƣờng sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung dịch phản ứng. Nếu nhƣ nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme.  Các dNTP: Hàm lƣợng các dNTP trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu. Bốn loại dNTP (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tƣơng đƣơng nhau.  Hàm lƣợng MgCl2: Nồng độ tối ƣu của MgCl2 cho kết quả PCR tốt. Ion Mg + có thể ảnh hƣởng đến: - Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn. - Quá trình bắt cặp của primer: MgCl2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn. - Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác. - Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Thông thƣờng hàm lƣợng ion Mg+ cần thiết từ 0,5 – 2,5 mM. Chu trình nhiệt:  Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94oC trong 5 phút để hầu nhƣ tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau.  Nhiệt độ biến tính: 94oC – 96oC trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trƣớc tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo.  Nhiệt độ bắt cặp: 55oC (50oC – 56oC) trong 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp). 21  Nhiệt độ nối dài: 72oC trong 90 giây. Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài. Ba bƣớc này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ.  Chu kì cuối cùng kết thúc bằng một khoảng thời gian nối dài ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR sau đó sẽ đƣợc bảo quản ở 4oC hay –20oC. 2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trƣng riêng. Các biện pháp tối ƣu đó liên quan đến những vấn đề.  Trình tự của primer: Trình tự của primer xác định kích thƣớc, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ƣớc lƣợng đƣợc nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thƣờng chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs).  Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2oC, trong đó: Tm = 2 o C x (A+T) + 4 oC x (G+C) (Suggs và ctv, 1981). Với A, T, G, C là số lƣợng các nucleotide tƣơng ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ƣớc lƣợng.  Nồng độ MgCl2: ảnh hƣởng lớn đến kết quả phản ứng, ngƣời ta thƣờng thay đổi nồng độ của MgCl2 trƣớc tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.  Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thƣờng khoảng 200 μM.  Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl).  Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thƣờng là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA. 22  Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dƣ thừa.  Tỉ lệ primer/DNA khuôn: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng dimer – primer sẽ xuất hiện do lƣợng DNA khuôn thấp và lƣợng primer quá cao. Ngƣợc lại, sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản. 2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này đƣợc lai với những đoạn dò (probe) đƣợc đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn dò chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [2], [6]. 2.5.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến [2], [6]. Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải đƣợc biết rõ trƣớc khi chuẩn bị các primer 23 tƣơng ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thập kỷ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991). Hình 2.4: Nguyên lý chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thƣờng primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhƣng số lƣợng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản đƣợc (thƣờng 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ đƣợc nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này đƣợc quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tƣơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thƣớc ngắn nên dễ tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phƣơng pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá 24 thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tƣơng, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000). Các ƣu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trƣớc trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lƣợng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lƣợng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thƣờng dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại. Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bƣớc nhƣ sau:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.  Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.). Các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử dụng cho những mục đích sau:  Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó nhƣ tính trạng chất lƣợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni và ctv., 1996; Winter và ctv., 1995).  Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.  In dấu vân tay (DNA fingerprinting).  Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhƣng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế nhƣ sau: 25  Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt đƣợc những gen lặn hay cá thể dị hợp tử.  Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thƣờng không thống nhất.  Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.  Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân. 2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD  Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu.  Thao tác đơn giản.  Chất lƣợng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao.  Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.  Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp.  Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [1]. 2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD  Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao.  Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao.  Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. 2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:  Đánh giá đa dạng di truyền: Đã đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,… 26  Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tƣơng quan giữa kiểu gene và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv., 1999). 27 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện. 3.1.1 Thời gian nghiên cứu. Đề tài đƣợc nghiên cứu từ 20/04/2007 đến 30/08/2007. 3.1.3 Địa điểm thực hiện. Mẫu lá mắm đƣợc thu thập tại khu dự trữ rừng ngập mặn Cần Giờ. Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và chạy RAPD tại Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm. Mẫu lá mắm thu thập tại 3 tiểu khu 17, tiểu khu 18 và tiểu khu 21 ở khu dự