Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

2kb. Gel đƣợc đổ trên giá thể nằm ngang và điện di theo phƣơng nằm ngang. Để phát hiện DNA trên gel ngƣời ta dùng chất nhuộm ethidium bromide, chúng có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại, acid nucleic sẽ hiện ra dƣới dạng các vạch màu đỏ cam có thể chụp ảnh và ghi nhận lại.[8] Dựa vào kết quả điện di: so sánh các băng với băng chuẩn có thể biết chất lƣợng DNA ly trích nhƣ gãy, lẫn tạp. Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thƣớc [8] (Lê Đình Lƣơng, 2001) (Lê Đình Lƣơng, 2001) (Lê Đình Lƣơng, 2001) 2.4. PCR (Polymerase chain reaction) 2.4.1. Khái niệm Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng tỉ bản sao DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu. [6] Loại gel Phạm vi phân tách (bp) 0,3% agarose 50.000 đến 1000 0,7% agarose 20000 đến 300 1,4% agarose 6000 đến 300 4% acrylamid 1000 đến 100 10% acrylamid 500 đến 25 20% acrylamid 50 đến 1 13 2.4.2. Nguyên tắc Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 25-35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: Biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài. Biến tính: đây là bƣớc làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn. Nhiệt độ thiết kế là 940C Gắn mồi: đây là bƣớc primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (sợi đơn). Nhiệt độ thay đổi từ 50 - 600C. Nhiệt độ trong bƣớc này tùy thuộc vào độ dài của cặp primer. Kéo dài: 720C, 60 – 90 giây. Đây là bƣớc kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase. Nhiệt độ 720C là tối ƣu cho hoạt động của Taq polymerase. Sau 25 - 35 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 720C trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR. 2.4.3. Ứng dụng Đánh giá mức độ biến dị di truyền trong một loài sinh vật thông qua mức độ biểu hiện đa hình. Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các giống, giữa quần thể khác loài. Thiết lập bản đồ di truyền thông qua các phƣơng pháp phân tích các kỹ thuật trong sinh học phân tử nhƣ RAPD, STS, SSR, AFLP. Nghiên cứu và phân tích gia phả của sinh vật. Kiểm tra và xác định nguồn gốc con lai. Thiết lập hệ thống phân loại phân tử thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử có liên quan. Giải trình tự DNA. Ứng dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen. Chẩn đoán bệnh trong y khoa, chẩn đoán nhóm máu, phát hiện các bệnh trong y khoa. 14 Phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng triệu năm. [6] 2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm 2.4.4.1. Ƣu điểm Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện đƣợc. 2.4.4.2. Nhƣợc điểm Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính. 2.5. Đa dạng di truyền 2.5.1.Khái niệm Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gene giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gene có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. [18] 2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền Việc nghiên cứu đa dạng di truyền có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến lƣợc quản lý, bảo vệ và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ. Kết quả quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ luôn luôn là kế hoạch dài hạn. Từ 1978 – 1983 trồng phủ xanh bằng cây đƣớc (Rhizophora apiculata), từ 1984 – 1999 trồng đa dạng loài để đạt đa dạng sinh học. Từ năm 2000 trở đi, quan sát động lực phát triển và mối quan hệ với các hệ sinh thái tiếp giáp, theo dõi độ tăng đa dạng sinh học.[5] Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đƣớc để tìm hiểu hệ số đồng dạng di truyền, nhằm điều chỉnh kịp thời độ đa dạng di truyền của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Bởi vì khi hệ số đồng dạng di truyền cao thì ảnh hƣởng của các tác nhân nhƣ sâu bệnh là rất lớn và thiệt hai nếu xẩy ra là vô cùng nghiêm trọng. 15 2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) Là những chỉ thị đƣợc tạo ra nhờ phƣơng pháp cắt DNA bằng enzym giới hạn (Restriction enzyme) hoặc qua PCR. Các chỉ thị phân tử này có thể liên kết với một gen nào đó nằm trên nhiễm sắc thể. Các chỉ thị phân tử có nguồn gốc từ hai nhóm: Chỉ thị phân tử dựa vào phƣơng pháp lai DNA: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), minisatelite. Chỉ thị phân tử dựa vào phƣơng pháp PCR: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequense Repeats/microsatellite repeats), STS (Sequence Tagged Sites), DAF (DNA Amplification Fingerprinting). [7] Bảng 2.2 Các loại chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền [2] (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) Tên đầy đủ AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD Random Amplified Polymorphic DNA DAF DNA Amplification Fingerprinting ALP Amplicon Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism AP-PCR Arbitrary Primer-PCR SNP Single Nucleotide Polymorphism STS Sequence – Tagged Sites 16 2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2.6.1.1. Định nghĩa RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác.[9] 2.6.1.2. Phƣơng pháp Phƣơng pháp này cho phép so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn - nhằm tìm hiểu xem có hay không đột biến điểm (Làm mất hoặc xuất hiện vị trí giới hạn) hoặc có hay không sự thay đổi một đoạn trình tự DNA. Trƣờng hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy các band DNA giống nhau hoàn toàn về số lƣợng và kích thƣớc. Ngƣợc lại, nếu có đột biến điểm hoặc có thay đổi một đoạn trình tự DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các band DNA. Sự giống nhau hoặc khác nhau về các band DNA này đƣợc nhận biết qua ảnh phóng xạ tự ghi hoặc đánh dấu probe. 2.6.1.3. Ứng dụng Chỉ thị phân tử RFLP có thể đƣợc sử dụng trong một số nghiên cứu nhƣ: Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể (Ghi nhận qua sự đa hình DNA). Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể Lập bản đồ di truyền (Genetic map) phục vụ công tác chọn tạo giống (Thí dụ nhƣ một số chỉ thị phân tử RFLP liên kết với gen quy định tính trạng số lƣợng). [2] 17 2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 2.6.2.1. Định nghĩa AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. [1] 2.6.2.2. Phƣơng pháp Gồm các giai đoạn: Tách chiết DNA Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn. Thông thƣờng, enzyme cắt giới hạn sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thƣờng xuyên (Tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thƣờng xuyên (Nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt). Nối trình tự DNA với các adaptor (Trình tự tiếp hợp). Sau khi cắt bằng cặp enzyme một trình tự nối mạch đôi Adaptor sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Khuếch đại đoạn cắt giới hạn. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích Chạy điện di các đoạn đƣợc khuếch đại trên gel polyacrylamide. 18 2.6.2.3. Ứng dụng Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể (Ghi nhận qua sự đa hình DNA) Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể (Phylogenetic analysis). Lập bản đồ di truyền (Gennetic map) phục vụ công tác chọn tạo giống. 2.6.2.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của AFLP  Ƣu điểm Lƣợng DNA cần dùng ít Tạo nhiều băng khuếch đại - khả năng đa hình cao. Kết quả có độ tin cậy cao, có khă năng lặp lại. Không cần biết trƣớc trình tự DNA genome.  Nhƣợc điểm Cần DNA có độ tinh sạch cao, không làm tạp nuclease hoặc ức chế nó. AFLP là chỉ thị di truyền trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. 2.6.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 2.6.3.1. Phƣơng pháp Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những chỉ thị để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa 19 trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình phản ứng PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD nhƣ sau: Các mũi tên biểu thị cho các primer (Các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 là các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào. Sản phẩm PCR đƣợc tạo thành: Sản phẩm A: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5. Sản phẩm B: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 3 và 6. Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại. Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hƣớng vào nhau. [17] Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 20 Kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc cơ bản: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thƣờng gặp phải một số vấn đề: Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng. PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau. Taq polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại và nồng độ của Taq polymerase đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm. Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf. 2.6.3.2. Ứng dụng Xác định sự đa dạng di truyền, sự tƣơng quan di truyền. Lập bản đồ di truyền. 2.6.3.3. Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD  Ƣu điểm Không đòi hỏi chất lƣợng DNA mẫu cao, lƣợng DNA mẫu cần ít. Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. 21 Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao. Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.  Nhƣợc điểm Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định. Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. 2.6.4. Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đƣớc 2.6.4.1. Nghiên cứu ngoài nƣớc Năm 1997, Madasamy Parani và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP để nghiên cứu mối quan hệ giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) và cây đƣng (Rhizophora mucronata). Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối quan hệ rất gần giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) và cây đƣng (Rhizophora mucronata). [14] Năm 2002, Mukkamala Lakshmi và cộng sự đã sử dụng RAPD và RFLP nghiên cứu mối quan hệ giữa các cây thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) tại Ấn Độ. Kết quả nghiên cứu cho thấy mối quan hệ di truyền của 10 loài thuộc họ đƣớc trong rừng ngập mặn Ấn Độ. [15] 2.6.4.1. Nghiên cứu trong nƣớc Có rất nhiều nghiên cứu về cây đƣớc tuy nhiên hầu hết liên quan đến đặc điểm hình thái, các tính trạng nông học nhƣ: tăng trƣởng đƣờng kính của Đƣớc tại huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam, 1995). Nghiên cứu sinh khối và năng suất sơ cấp rừng Đƣớc trồng tại Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Sở Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn (Viên Ngọc Nam và Nnk, 1996). 22 Về nghiên cứu đa dạng di của truyền Lâm Vỹ Nguyên (2006) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và điạ điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ 08/05/2007 đến 30/08/2007. 3.1.2. Địa điểm thực hiện Mẫu lá đƣớc đƣợc thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và thực hiện phản ứng RAPD tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.1.2. Mẫu đƣớc đôi Mẫu đƣớc đôi (Rhizophora apilata Blume) đƣợc lấy ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.  Cách thức lấy mẫu: Lấy mẫu đƣớc theo đƣờng chéo, cách 1500m lấy 1 mẫu. Sử dụng xe gắn máy đối với đƣờng bộ và ghe đối với đƣờng sông để thu thập lá của cây đƣớc đôi (Lá già, lá non). Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng lá khác lạ. Ghi nhận nguồn gốc và xác định một số tính trạng về kiểu hình: hình dáng lá, hoa, trái của cây. Chọn mẫu lá từ trên những cây đƣớc đôi có năm tuổi khác nhau. 23 Mỗi mẫu lấy khoảng 15 - 20 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá . Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây đƣợc lấy mẫu theo phiếu thu thâp̣ . (Tham khảo phụ lục 5). Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trêm bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System). Ký hiệu tên mẫu: AXY, BXY với A là đƣờng chéo thứ nhất, B là đƣờng chéo thứ hai, XY là số thứ tự của mẫu. Cách bảo quản mẫu đƣa về phòng thí nghiệm: Mẫu sau khi lấy đƣợc cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. Sau đó chuyển về phòng thí nghiệm trữ mẫu ở nhiệt độ -200C. 3.2.2. Hoá chất thí nghiệm 3.2.2.1 Các hoá chất dùng ly trích DNA CTAB EDTA 0,5M Ethanol 100% Mercaptro Ethanol Ethanol 70% Sodium Acetate 3M Iso Propanol TE 1X Chloroform NaCl 5M Chloroform Tris-HCl 1M Isoamyl Alcohol Polyvidon Hình 3.1 Lá, hoa và trái đƣớc đôi 24 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA TE 1X 3.2.2.3. Các hoá chất dùng trong phƣơng pháp RAPD Buffer dNTP Taq DNA polymerase MgCl2 Primer: OPAC10 và OPA10 Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV 3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả Agarose Ladder 3000 bp TAE 0,5X Ethidium bromide Loading dye 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm Chày và cối (Đức) Bình và khay đựng Nitơ lỏng Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) Tủ lạnh 40C và -200C Máy Vortex (IKA - Đức) Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) 25 Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) Lò Viba (Electrolux) Tủ sấy (Jencons-Anh) Máy điện di (Biorad) Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển) Đầu tuýp các loại (Đức) Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản) Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) Máy PCR (BioRad – Thụy Điển) Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Bố trí thí nghiệm  Giai đoạn 1: Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu đƣớc đôi thu đƣợc. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế.  Giai đoạn 2: tối ƣu hóa kỹ thuật RAPD với các mẫu DNA thu đƣợc. Khảo sát nồng độ Mg2+ Khảo sát nồng độ primer  Giai đoạn 3: thực hiện phản ứng RAPD với các mẫu đƣớc thu đƣợc  Giai đoạn 4: phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc. 3.3.2. Phƣơng pháp ly trích DNA 26 Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng số trên 3 quy trình: Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle (1988) [9] Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến [9] Quy trình 3: Quy trình cải tiến từ quy trình 1 và quy trình 2 3.3.2.1. Quy trình 1 [9] Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988: o Bƣớc 1: cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB (Extraction Buffer) vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút. o Bƣớc 2: thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút, 14.000 vòng/phút ở 100C. o Bƣớc 3: chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. o Bƣớc 4: chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 l RNase, ủ ở 370C trong 1 giờ. o Bƣớc 5: thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C khoảng 30 phút (Nên để qua đêm). o Bƣớc 6: li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 7: cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 1giờ. o Bƣớc 8: thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để -200C trong 30 phút. o Bƣớc 9: li tâm 10 phút 14.000 vòng/phút ở 100 C, đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 10: rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng/phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 11: lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút. 27 o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở 40C. 3.3.2.2. Quy trình 2 [9] Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988 đƣợc cải tiến bởi Lâm Vỹ Nguyên, 2006. o Bƣớc 1: lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf. o Bƣớc 2: thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600-800 vòng/phút). Ủ qua đêm ở 550C. o Bƣớc 3: ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi. o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi. o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu đƣợc V l dịch nổi. o Bƣớc 6: thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -200C trong 90 phút. o Bƣớc 7: ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa. o Bƣớc 8: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 9: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 10: phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng. o Bƣớc 11: hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C đến khi kết tủa tan hoàn toàn (Có thể ủ qua đêm). o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở -200C. 3.3.2.3. Quy trình 3 28 o Bƣớc 1: lấy 0,3 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf. o Bƣớc 2: thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ 650 trong 1 giờ. o Bƣớc 3: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi. o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi. o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu dịch nổi. o Bƣớc 6: thêm 250 µl Isopropanol lạnh, đảo trộn kỹ. Ủ -200C qua đêm o Bƣớc 7: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong o Bƣớc 8: cho vào 300 µl TE 1X, ủ 370 C trong 1 giờ. o Bƣớc 9 : thêm 20 µl sodium acetate 3M và 640 µl Ethanol 100% trộn đều và ủ -200 C trong 1 giờ. o Bƣớc 10 : ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút , đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 11: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 12: lặp lại bƣớc 11. Phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng. o Bƣớc 13: hòa tan kết tủa trong 50 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút o Bƣớc 14: bảo quản mẫu ở -200C. 3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích 3.3.3.1. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di DNA sau khi đƣợc ly trích sẽ đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, do tích điện âm (Do tính chất của nhóm phosphate) nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực 29 cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose. [8] Sau khi chạy điện di, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA để quan sát. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel.  Cách tiến hành: Pha gel agarose với nồng độ 1%: cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba dƣới bƣớc sóng 650W trong 2 phút. Đổ gel, chờ 30 phút để agarose đông. Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 100 mg/ml trong 20 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di thể hiện nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. 3.3.3.2. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Các mẫu DNA li trích sau khi đã định tính đƣợc kiểm tra độ tinh sạch và ƣớc lƣợng hàm lƣợng DNA bằng cách đo mật độ quang OD (optical density) với bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm (OD260) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch 30 DNA thƣờng đo giá trị OD280. Khi giá trị OD260/OD280 = 1.8 – 2.2 thì dịch trích DNA đƣợc coi là tinh sạch. [10] Hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức: DNA (ng/ l) = [(62.9 * OD260 nm) – (36 * OD280 nm)] * Độ pha loãng  Cách tiến hành : Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: hút 5 l dung dịch DNA hòa tan với 495 µl TE 1X. Cho vào Curvette để tiến hành đo OD. Sản phẩm DNA tổng số sau khi tách chiết đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di và đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ kế. Từ đó ta sẽ chọn ra quy trình ly trích DNA tổng số tốt nhất dựa trên độ sáng, độ rõ, không bị gãy của các băng DNA và không bị nhiễm protein. 3.3.4. Kỹ thuật RAPD 3.3.4.1. Primer Sử dụng 2 primer: primer OPA 10 và primer 0PAC10 để chạy RAPD Trình tự của primer OPA 10: 5’ AGTGAACGCC 3’ và Tm = 30,70C Trình tự của primer OPAC 10: 5’AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 340C 3.3.4.2. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1 Sử dụng OPAC10 khảo sát quy trình RAPD Mục đích thí nghiệm: khảo sát quy trình RAPD Phƣơng pháp tiến hành: chọn 3 mẫu DNA chất lƣợng tốt thực hiện phản ứng RAPD với mồi OPAC10 theo bảng 3.1 và bảng 3.2. Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di. Bảng 3.1 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD [6] 31 (Đƣợc trích từ Nguyễn Thị Lang, 2002) Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong ph