Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây mắm đen (Avecinnia officinalis) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phổi cũng là "kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi [15]. Bên cạnh đó, rừng mắm đen có vai trò quan trọng hơn là làm cân bằng hệ sinh thái, làm dịu mát khí hậu, cung cấp một lƣợng lớn O2 và cùng với đó là hấp thu một lƣợng lớn CO2 làm môi trƣờng trong lành. Ngoài ra, rừng mắm đen là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm. [2] Do vậy, việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây mắm đen là vô cùng quan trọng nhằm giúp cho chúng ta có chiến lƣợc quản lý và bảo vệ để bảo tồn nguồn gene quý hiếm ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Cây mắm đen ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới thật sự chƣa có tài liệu nghiên cứu kĩ về tính đa dạng di truyền của quần thể cây này. 2.4. Các kỹ thuật trong tách chiết DNA 2.4.1. Các thông tin di truyền Theo lý thuyết trung tâm của sinh học phân tử (Crick, 1958), thông tin di truyền đƣợc mang bởi chuỗi DNA (hay RNA ở vài virus), qua các giai đoạn sao chép và dịch mã, sẽ đƣợc chuyển thành các trình tự amino acid của protein. Nucleic acid, vật liệu mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, là một polymer hình thành từ các monomer là nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: Nhóm phosphate, đƣờng pentose (đƣờng 5C) và một base hữu cơ (vì các nucleotide chỉ khác nhau ở base nên ngƣời ta thƣờng dùng từ “base” thay cho “nucleotide”). Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: Các purine gồm Adenine (A) và Guanine (G), các pyrimidine gồm Thymine (T), Cytosine (C) và Uracine (U). Các nucleotide đƣợc nối với nhau bằng liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi dài. Nucleic acid gồm hai loại phân tử có cấu tạo rất giống nhau là deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA). DNA cũng nhƣ RNA đƣợc tạo bởi nhiều nucleotid nối nhau nhờ các cầu nối ester. Tuy nhiên, có ba đặc tính của DNA giúp ta phân biệt DNA và RNA.  Đƣờng của DNA là deoxyribose, trong khi đó đƣờng của RNA là ribose.  Các base tạo nên các nucleotid của DNA là A, G, C, và T. Các base tạo nên nucleotid của RNA là A, G, C và U. 10  Phân tử DNA thông thƣờng đƣợc tạo bởi hai chuỗi nucleotid, trong khi đó RNA thông thƣờng chỉ có một chuỗi. Tuy nhiên, có vài trƣờng hợp ngoại lệ RNA của một số virus có hai chuỗi nucleotide. Ở sinh vật Eucaryote, thông tin di truyền là phân tử DNA, là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide. Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đƣờng deoxyribose và một trong bốn loại base (A, C, G, T). Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ liên kết hydro, giữa NH2 và CO, N và NH. Do đó, A bổ sung cho T có hai nối hydrogen, G bổ sung cho C có ba nối hydrogen, tỷ lệ giữa A/T=1 và G/C=1. Tuy nhiên, tỷ lệ (A+T)/(G+C) rất hay thay đổi giữa các DNA khác nhau và đặc trƣng cho loài. Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hƣớng với một đầu là 5’ phosphate tự do và một đầu là 3’ hydroxyl tự do (hƣớng quy ƣớc là 5’ 3’). Hƣớng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngƣợc nhau và gọi chúng là hai mạch đối song song. Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi tính chất bổ sung. Chính tính chất này giải thích đƣợc cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA, đặc biệt là cách thức tự sao chép để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử. [9] 2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA Phƣơng pháp tách triết DNA cơ bản gồm ba bƣớc: Bƣớc1: Phá màng tế bào và màng nhân (Eucaryote). Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, mô trong hợp chất tẩy (nhƣ SDS, sarcosyl) và Proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phá hủy các protein liên kết với DNA. Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong dung dịch Phenol và Chloroform, dung dịch Phenol và Chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan acid nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nƣớc có chứa acid nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha Phenol:Chloroform. Pha nƣớc có chứa acid nucleic đƣợc thu nhận lại. Bƣớc 3: Tủa acid nucleic. Mục đích tủa là nhằm thu acid nucleic dƣới dạng cô đặc, một mặt bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác ta có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Có hai phƣơng pháp tủa thƣờng dùng : 11  Tủa trong Ethanol (Ethylic alcohol), việc tủa này đƣợc thực hiện trong môi trƣờng có lực ion cao (nồng độ muối cao) và nồng độ Ethanol cao (2,5 dung tích Ethanol/1dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa.  Tủa trong Isopropanol, điểm khác biệt so với phƣơng pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích Isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA có phân tử trọng lƣợng nhỏ không bị tủa. Do đó, có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa trong Isopropanol. Trong hai phƣơng pháp trên có thể thu acid nucleic bằng ly tâm. Sau đó cặn tủa rửa trong Ethanol 70% để loại các muối hoặc Isopropanol còn dính lại trên mẫu. [5] Một số vấn đề gặp phải khi ly trích DNA:  Có lẫn tạp RNA trong mẫu.  Lẫn tạp chất Polysaccharide trong mẫu DNA.  DNA bị đứt gẫy. 2.4.3. Đánh giá chất lƣợng DNA 2.4.3.1. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Phƣơng pháp này cho phép ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi ly trích đƣợc. Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang (OD: Optical density) ở bƣớc sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tƣơng quan: 1 đơn vị OD260nm tƣơng ứng với nồng độ 50 µg/ml cho dung dịch chứa DNA mạch kép và 40 µg/ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn. Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị OD280nm. Tại bƣớc sóng 280 nm, protein có mức hấp thụ cao nhất, nhƣng các protein cũng hấp thu bƣớc sóng ở 260 nm nhƣ các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Tỉ số OD260nm /OD280nm là tỉ số cho thấy độ tinh sạch của DNA. [5] Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1,8 đối với DNA tinh khiết. Tỉ số OD260nm /OD280nm = 2 đối với RNA tinh khiết. 12 2.4.3.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào đặc tính của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của các phân tử này đƣợc phân tích trên bảng gel, nó phụ thuộc vào hai yếu tố: Khối lƣợng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel. Việc lựa chọn các loại gel cũng nhƣ nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thƣớc trung bình của các đoạn phân tử nucleic acid cần phân tách.  Gel agarose: Là loại gel thông dụng nhất, dùng để phân tách những đoạn DNA có kích thƣớc từ 0,5 – 200 kb. Dùng điện di phƣơng ngang.  Gel polyacrylamide: Đƣợc dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc nhỏ, dƣới 1000 bp. Dùng điện di phƣơng thẳng đứng. 2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng PCR do K. B. Mullis (Nobel hóa học, 1993) phát minh ra năm 1985. Đây là phƣơng pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một khối lƣợng mẫu ban đầu rất nhỏ. Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ sinh học phân tử, chẩn đoán, di truyền quần thể và phân tích pháp y. 2.5.1. Nguyên tắc Tất cả Taq DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung đầu 3’ của khuôn. Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để hình thành sợi mới. Hiện tƣợng trên chính là cơ sở của phản ứng PCR. Nếu đƣợc cung cấp hai mồi (mồi xuôi và mồi ngƣợc) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của một trình tự DNA, phản ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai mồi này. 13 Hình 2.4. Nguyên tắc phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm 3 bƣớc: Bƣớc 1: Biến tính. Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94 – 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới. Bƣớc 2: Bắt cặp. Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer bắt cặp với các mạch của DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với DNA khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 – 700C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn lai. Bƣớc 3: Kéo dài dây mới nhờ primer. Nhiệt độ đƣợc tăng lên 720C giúp cho Taq DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Một chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả sau cùng ta có thể thu nhận số lƣợng lớn bản sao trình tự DNA. Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR đƣợc tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m * 2n m: Số bản sao ban đầu của DNA mẫu. 14 n: Số chu kỳ. 2.5.2. Thành phần cơ bản của phản ứng PCR  DNA bản mẫu (DNA template).  Mồi xuôi (primer forward) và mồi ngƣợc (primer reverse).  dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).  Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (PCR buffer).  MgCl2.  Taq DNA polymerase.  Nƣớc cất 2 lần, khử ion. 2.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới PCR  Tỷ lệ lí tƣởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% GC để nhiệt độ bắt cặp của mồi là không quá thấp.  Các đoạn mồi không nên chứa hơn ba nucleotid giống nhau xếp liên tiếp.  Tránh sử dụng các đoạn mồi nhân các đoạn gen phụ.  Hai đoạn mồi không có trình tự bổ sung lẫn nhau.  Độ dài của đoạn mồi là 17 - 25 nucleotide (cho PCR bình thƣờng). 2.5.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm  Ƣu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, đặc hiệu, chỉ cần một lƣợng mẫu nhỏ có thể thực hiện.  Nhƣợc điểm: Có thể cho phản ứng dƣơng tính dã, không phân biệt đƣợc sinh vật sống hay chết. 2.6. Một số chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học 2.6.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Trong số các chỉ thị phân tử, chỉ thị RFLP đƣợc sử dụng đầu tiên trong việc lập bản đồ gen của con ngƣời (Botstein và ctv, 1980), sau đó đƣợc cải biên để ứng dụng cho việc lập bản đồ (mapping) ở cây trồng. RFLP là thể đa hình đáng tin cậy nhất, có thể đƣợc dùng cho những phân tích chính xác về kiểu gen. RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình về chiều dài các đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn. 15 Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (đƣợc đánh dấu phóng xạ). Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra các phân đoạn cắt khác nhau. Hình 2.5. Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP Chỉ thị RFLP có khả năng sử dụng rất phong phú, vì là chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp và dị hợp. Ƣu điểm khi dùng RFLP:  Thích hợp cho phân tích đa dạng di truyền đối với DNA có kích thƣớc nhỏ.  Chi phí áp dụng thấp.  Kỹ thuật này rất có ý nghĩa trong nghiên cứu dịch tễ học. Nhƣợc điểm khi dùng RFLP:  Dùng một lƣợng mẫu DNA lớn.  Môi trƣờng đệm đặc biệt quan trọng đối với hiệu quả hoạt động của enzyme cắt khi mà phối hợp giữa các enzyme cắt với nhau.  Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định. Ứng dụng:  Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể.  Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.  Lập bản đồ di truyền phục vụ công tác chọn giống. Vị trí cắt Điện di Lai Đột biến = một vị trí cắt mới Thấm tách 16 2.6.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn chỉ khoảng 10 nucleotid, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu là bƣớc đầu đánh giá các tính trạng của sinh vật. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình phản ứng PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Hình 2.6. Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD Ƣu điểm của phƣơng pháp RAPD:  Không đòi hỏi chất lƣợng DNA mẫu cao, lƣợng DNA mẫu cần ít.  Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản.  Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao. Điện di sản phẩm PCR Vị trí bắt cặp primer Sản phẩm khuếch đại Nhiễm sắc thể 17  Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao. Nhƣợc điểm:  Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định.  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp. Ứng dụng:  Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể.  Đánh giá sự tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.  Chọn giống. 2.6.3. Chỉ thị AFLP Phƣơng pháp AFLP đƣợc xây dựng bởi công ty KeyGene và là phƣơng pháp kết hợp giữa RFLP và RAPD. Phƣơng pháp AFLP bao gồm các giai đoạn.  Tách chiết DNA.  Cắt DNA bằng enzyme giới hạn.  Nối trình tự các đoạn DNA đƣợc cắt với các adapter.  Khuếch đại các đoạn cắt giới hạn.  Chạy điện di các đoạn khuếch đại trên gel polyarylamide hay gel agarose. Ở phƣơng pháp này mồi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adapter và đƣợc gắn thêm 1 nucleotide chọn lọc ở đầu 3’, gọi là primer+1: Là primer tiền chọn lọc. Adapter gắn 2 - 3 nucleotide thì gọi là primer chọn lọc. Một nucleotide chọn lọc có thể là A, C, G, T. Hai nucleotide chọn lọc là những tổ hợp của A, C, T, G nhƣ là: AA, AG, AT,…. Ba nucleotide có thể là: AAA, ATG, ACC,…. DNA mẫu đƣợc khuếch đại hai giai đoạn:  Giai đoạn 1: Giai đoạn khuếch đại tiền chọn lọc với primer+1.  Giai đoạn 2: Giai đoạn khuếch đại chọn lọc với primer+2(3). Sự chọn lọc ở đây có ý nghĩa:  Chỉ những trình tự DNA nào gắn với adapter mới đƣợc khuếch đại.  Sự khuếch đại tiền chọn lọc giúp chọn lọc bƣớc đầu các trình tự DNA cần đƣợc khuếch đại. 18  Sự khuếch đại chọn lọc giúp chọn lọc chặt chẽ hơn các trình tự DNA cần đƣợc khuếch đại. Trong phƣơng pháp AFLP việc ly trích thành phần DNA là khâu hết sức quan trọng, để mà có đƣợc DNA tinh khiết ít bị tạp nhiễm. Cùng với đó những thành phần làm dung dịch đệm cho enzyme cắt và enzyme gắn cũng quyết định sự thành công của kỹ thuật này. Sự thiết kế mồi dựa trên các adapter, mồi đƣợc thiết kế phải phù hợp sao cho có sự cân đối giữa các thành phần theo tỷ lệ: %G + C = 60%, kích thƣớc 17 – 28 base = L Tm = 59,9 + 0,41*(%G,C) – 600/L. Tanneal = Tm-primer - 4 0 C. Tm-product – Tanneal >= 30 0 C. Tm: Nhiệt độ nóng chảy. Tanneal: Nhiệt độ bắt cặp. Tm-primer: Nhiệt độ nóng chảy của mồi. Tm- product : Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm. Ƣu điểm:  Lƣợng DNA cần dùng ít.  Tạo nhiều band khuếch đại khả năng đa hình cao.  Kết quả có độ tin cậy cao, có khả năng lặp lại.  Không cần biết trƣớc trình tự genome. Nhƣợc điểm:  Chi phí cao.  Không kiểm soát hết sự bắt cặp của các adapter.  Enzyme cắt và gắn có thể hoạt động không tốt.  Cần chất lƣợng DNA mẫu cao. Ứng dụng của phƣơng pháp này:  Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể.  Đánh giá sự tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.  Lập bản đồ di truyền, chọn giống. 19 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Nội dung đề tài Đề tài đƣợc thực hiện với hai nội dung sau:  Thu thập mẫu cây mắm đen tại rừng ngập mặn Cần Giờ.  Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen bằng kỹ thuật RAPD. 3.2. Thời gian thực hiện đề tài Thời gian bắt đầu thực hiện đề tài từ ngày 1 tháng 5 năm 2007 đến ngày 1 tháng 9 năm 2007 tại rừng ngập mặn Cần Giờ và phòng CNSH thực vật của Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Mẫu mắm đen Mẫu mắm đen (Avicennia officinalis) đƣợc lấy ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Cách thức lấy mẫu:  Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).  Thu thập lá của cây mắm đen nhiều hình dạng nhƣ: Lá già, lá non, lá bánh tẻ, lá bị thủng lổ, lá bị sâu bọ ăn, lá nhỏ, lá to.  Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: Thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng, lá khác lạ v/v.  Chọn mẫu lá từ trên những cây mắm đen có năm tuổi khác nhau (cây có gốc lớn, cây có gốc lớn sống cằn cỗi, cây có gốc nhỏ có sức sống tốt, cây có gốc nhỏ sống cằn cỗi). 20  Mỗi cây lấy khoảng 5 - 10 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá. Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây đƣợc lấy mẫu.  Mẫu sau khi lấy đƣợc cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. Sau đó, nên chuyển ngay về phòng thí nghiệm cho vào tủ lạnh -200C. 3.3.2. Hóa chất thí nghiệm 3.3.2.1. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA  Chloroform:Isoamyl alcohol = 24:1.  Polyvinyl pyrrolidone (PVP).  Sodium acetat 3 M.  Ethanol 100%.  Isopropanol.  Ethanol 70%.  Dịch trích DNA (EB). Bảng 3.1. Thành phần dung dịch ly trích DNA (EB). Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 100ml) CTAB (hexade- cyltrimethylammoniumbromide) EDTA 0,5 M β - mercaptroethanol NaCl 5 M Tris – HCl 1 M Nƣớc 2 g. 4 ml. 1 ml. 28 ml. 10 ml. Thêm cho đến 100 ml. 21  TE 1X (Tris-HCl, EDTA). Bảng 3.2. Thành phần dung dịch TE 1X. Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 250 ml) Tris – HCl 1 M EDTA 0,5 M 1 ml. 0,2 ml 3.3.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA  Nƣớc cất 2 lần khử ion (đã hấp khử trùng).  TE 1X. 3.3.2.3. Hóa chất dùng trong định tính DNA  Agarose.  Ethidium bromide.  TAE. 3.3.2.4. Hóa chất dùng để cho phản ứng RAPD-PCR  PCR buffer.  dNTP.  Taq DNA polymerase (promega)  MgCl2.  Primer OPA5, primer OPA10, primer OPD18, primer l, primer OPAC10.  DNA mẫu.  Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV. 3.3.3. Trang thiết bị - Chén sứ và chày giã (Đức) - Máy Vortex (IKA - Đức) - Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) - Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) - Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) - Tủ sấy (Jencons-Anh) - Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) - Máy điện di (Biorad) - Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) - Lò Viba (Electrolux) - Máy chụp ảnh DNA (Biorad-Thụy Điển) - Đầu típ các loại (Đức) - Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) - Máy PCR (PTC 100 - MJ) - Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) - Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) 22 - Pipet các loại (Nichiryo - Nhật Bản) 3.4. Phƣơng pháp 3.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của đề tài là DNA đƣợc ly trích từ mẫu lá của cây mắm đen. 3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp RAPD-PCR để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây mắm đen. 3.4.3. Cách bố trí thí nghiệm  Giai đoạn1 : Tách triết DNA từ các mẫu mắm đen đƣợc thu thập. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di và định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp đo quang phổ.  Giai đoạn 2 : Khảo sát các thành phần tối ƣu hóa phƣơng pháp RAPD-PCR trong phân tích đa dạng di truyền của các mẫu mắm đen đƣợc thu thập. Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ mồi và nồng độ muối đến phản ứng RAPD-PCR.  Giai đoạn 3 : Khảo sát tính đa dạng di truyền của các mẫu mắm đen thu đƣợc và phát hiện ra chỉ thị phân tử.  Giai đoạn 4 : Đánh giá đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc. 3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA 3.4.4.1.Quy trình ly trích mẫu tƣơi Doyle và Doyle (1988)  Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch ly trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ, ủ ở 650C trong 45 phút.  Bƣớc 2: Thêm 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol, khuấy bằng vortex 10 phút, ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 100C.  Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.  Bƣớc 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 µl RNase, ủ ở 370C trong 1 giờ.  Bƣớc 5: Thêm vào 250 µl dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bƣớc 6: Ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 100C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 7: Cho vào 300 µl TE 1X, ủ ở 370C trong 1 giờ. 23  Bƣớc 8: Thêm 20 µl muối Sodium acetate 3 M và 640 µl Ethanol 100%, trộn đều và để –200C trong 30 phút.  Bƣớc 9: Ly tâm 10 phút 14000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 µl TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút.  Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở 40C. 3.4.4.2. Quy trình ly trích DNA bằng nitơ lỏng  Bƣớc1 : Nghiền 0,3 g lá trong nitơ lỏng và cho vào eppendort 1,5 ml.  Bƣớc 2 : Cho 1,3 ml dịch EB đã đƣợc ủ nóng ở 650C vào eppendort rồi vortex thật kỹ.  Bƣớc 3 : Mẫu đƣợc ủ trong 1 giờ ở 650C và sau đó ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 100C, hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.  Bƣớc 4 : Sau đó cho 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) đảo nhẹ và lắc đều.  Bƣớc 5 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 100C, hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.  Bƣớc 6 : Cho tiếp 500 µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) đảo nhẹ và lắc đều ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút hút lấy dịch trong cho vào một eppendort mới.  Bƣớc 7 : Cho 300 µl Isopropanol lạnh và ủ 1 giờ ở -200C (nên để qua đêm).  Bƣớc 8 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 9 : Cho 300 µl TE 1X ủ 370C trong 1 giờ, sau đó cho tiếp 20 µl Sodium acetate và 640 µl Ethanol 100% để tủa 30 phút ở -200C.  Bƣơc 10 : Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11 : Rửa tủa với 400 µl Ethanol 70%, ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, lập lại 1 lần nữa. Phơi mẫu 370C sau đó cho 100 µl TE 1X vào ủ 37 0C trong 30 phút.  Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu 40C. 24 3.4.4.3. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Để định tính DNA, điện di các mẫu DNA đã ly trích trên gel agarose. Trong điện trƣờng, DNA di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dƣơng, vì DNA mang điện âm (do tính chất của nhóm phosphate). Khi DNA di chuyển qua các lỗ của gel agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh. Do đó, DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy, có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose dựa vào kích thƣớc phân tử. Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA đƣợc phân ra tùy theo trọng lƣợng phân tử. Mà có thể quan sát DNA bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu với Ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV. Cách tiến hành:  Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba cho agarose tan thật đều.  Đổ gel và chờ agarose đông.  Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 µl loading dye và 4 µl DNA mẫu.  Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút.  Nhuộm Ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. 3.4.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Trên nguyên tắc sự hấp thu ánh sáng khác nhau của các base nitơ của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn, có thể xác định hàm lƣợng của DNA trong dung dịch. Giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm (OD260nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch DNA thƣờng đo giá trị OD280nm. Do protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bƣớc sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm gây nên sự sai lệch khi tính nồng độ của acid nucleic. Khi giá trị OD260/OD280 = 1,8 – 2,2 thì dịch trích DN