Khóa luận Khảo sát ảnh hưởng của dịch nấm Phytophthora capsici và các tác nhân hóa lý đến sự sinh trưởng và khả năng tạo đột biến của cây Tiêu (Piper nigrum L.) nuôi cấy mô

rên môi trƣờng bổ sung dịch chiết thực hiện trong điều kiện: Cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s, mô sẹo đƣợc cấy trên môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l và BA 3 mg/l với nồng độ dịch nấm là 0, 20, 30 và 40%. Nhiệt độ: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%. Đặt trên máy lắc trong suốt quá trình thí nghiệm. Thời gian theo dõi thí nghiệm 3 tuần. Giải phẫu, nhuộm mẫu mô sẹo tiêu và xem kết quả dƣới kính hiển vi Sau 1, 2 và 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng lắc có dịch nấm, tiến hành cắt lát mỏng mô sẹo, nhuộm mẫu và xem kết quả dƣới kính hiển vi với nhiều vật kính khác nhau. 30 Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm: Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng nhạt hay tím nhạt nếu màng tế bào bằng chất cellulose pectic. Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất gỗ (ligin) hay bần (suberin). Quy trình nhuộm: Cắt lát mỏng mô sẹo. Ngâm trong nƣớc Javel trong 15 phút để loại nội dung tế bào. Rửa nƣớc cho sạch Javel. Ngâm mẫu trong acid acetic trong 5 phút để loại Javel còn lại. Rửa nƣớc cho sạch acid acetic. Nhuộm bằng phẩm nhuộm hai màu trong 3 phút. Rửa nƣớc cho sạch phẩm thừa.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên , 3 lần lặp lại. Thí nghiệm thực hiện với môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BA và các nồng độ dịch nấm khác nhau. Tổng số bình: 36. Tổng số mẫu cấy: 144. Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora capsici trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu STT Tên nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 P0 0 3 4 2 P1 20 3 4 3 P2 30 3 4 4 P3 40 3 4  Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ mẫu sống ở mỗi nghiệm thức Tỉ lệ mẫu tạo sẹo Trạng thái mô sẹo Xem và so sánh sự khác biệt (hình dạng, kích thƣớc) giữa các mô giải phẫu của các mẫu ở mỗi nghiệm thức khác nhau. Các chỉ tiêu trên đƣợc ghi nhận 7 ngày một lần. 31 3.4.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu  Phƣơng pháp thí nghiệm Sử dụng mô sẹo đã tạo ra ở thí nghiệm 1 để tiến hành thí nghiệm. Pha môi trƣờng nghiệm thức là môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng với nồng độ khác nhau. Các chất kích thích đƣợc dùng trong thí nghiệm này gồm: BA, IBA và TDZ. Lấy mô sẹo cấy vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng. Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng. pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml. Cƣờng độ ánh sáng: 50 µmol/m2/s. Nhiệt độ: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 4 tuần. Sau 2, 3 và 4 tuần nuôi cấy thì giải phẫu, nhuộm mẫu mô sẹo tiêu và xem trên kính hiển vi nhƣ ở thí nghiệm 1.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Số bình của mỗi nghiệm thức: 3. Số mẫu trong 1 bình: 4. Tổng số bình: 63. Tổng số mẫu cấy: 252 Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm của các môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy mô sẹo tiêu Nghiệm thức Môi trƣờng cơ bản Chất kích thích sinh trƣởng (mg/l) BA IBA TDZ K0 MS 3 0 0 K1 MS 10 1 0 K2 MS 20 1 0 K3 MS 1 10 0 K4 MS 1 20 0 K5 MS 0 1 1 K6 MS 0 1 2 32 3.4.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu  Phƣơng pháp thí nghiệm Mô sẹo và chồi của tiêu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Mô sẹo đƣợc đặt trong môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Còn chồi đƣợc đặt trong môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA. Sau 3 tuần nuôi cấy, tiến hành chiếu xạ với liều xạ 20, 40 và 60 Gy tại Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lat. Sau 2, 3 và 4 tuần chiếu xạ thì tiến hành giải phẫu, nhuộm và xem mẫu trên kính hiển vi. Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar, 30 g/l đƣờng saccharose, 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D với sự thay đổi về liều xạ gamma, môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút. Tƣơng tự, chồi tiêu cũng đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar, 30 g/l đƣờng saccharose và BA 3 mg/l. pH môi trƣờng: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml /bình 250 ml. Cƣờng độ ánh sáng: 50 µmol/m2/s. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày. Nhiệt độ nuôi: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian thí nghiệm là 60 ngày.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm này đƣợc chia làm hai thí nghiệm gồm: Thí nghiệm chiếu xạ gamma trên mô sẹo tiêu Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số bình: 64. Tổng số mẫu cấy: 256. Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến mô sẹo tiêu STT Tên nghiệm thức Liều xạ gamma (Gy) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 S0 0 4 4 2 S1 20 4 4 3 S2 40 4 4 4 S3 60 4 4 33 Thí nghiệm chiếu xạ gamma trên chồi tiêu Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số bình: 64 Tổng số mẫu cấy: 256 Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến chồi tiêu STT Tên nghiệm thức Liều xạ gamma (Gy) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 C0 0 4 4 2 C1 20 4 4 3 C2 40 4 4 4 C3 60 4 4  Chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2 và 3 Tỉ lệ mẫu sống ở mỗi nghiệm thức Tỉ lệ mẫu xuất hiện chồi Trạng thái mô sẹo Xem và so sánh sự khác biệt (hình dạng, kích thƣớc) giữa các mô giải phẫu của các mẫu ở mỗi nghiệm thức khác nhau. Các chỉ tiêu trên đƣợc ghi nhận 7 ngày một lần 3.5. Phân tích thống kê Xử lý số liệu thống kê bằng cách phân tích ANOVA sử dụng phần mềm Statgraphics 7.0 34 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu 4.1.1. Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro Sau 2 tuần nuôi cấy trong bóng tối tại những vết cắt (ở mép lá) bắt đầu xuất hiện những vết sần là dấu hiệu mô sẹo bắt đầu hình thành. Sau 3 tuần tiếp tục phát triển ở điều kiện chiếu sáng (cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s), mô sẹo đã phát triển ở toàn bộ mẫu lá. 4.1.2. Nuôi cấy mô sẹo tiêu trong môi trƣờng có bổ sung dịch chiết nấm Phytophthora capsici Sử dụng mô sẹo cấy vào môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch nấm với các nồng độ là 0, 20, 30 và 40%. B A Hình 4.1 Mô sẹo hình thành từ lá cây tiêu in vitro trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D. A: Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện tối; B: Mô sẹo tiếp tục đƣợc nuôi cấy ở cƣờng độ ánh sáng nhẹ 50 µmol/m2/s 35 Tỉ lệ sống Sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng dịch nấm lỏng lắc, chúng tôi nhận thấy mô sẹo trong nghiệm thức P0 (đối chứng), P1, P2 và P3 vẫn phát triển bình thƣờng và bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng mẫu bị đen ở phần tiếp xúc với môi trƣờng. Tuy nhiên, ở nghiệm thức P0 mô sẹo phát triển hơn hẳn các nghiệm thức còn lại. Sau 2 tuần nuôi cấy: các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê. Chúng tôi nhận thấy hầu hết các mô sẹo trong môi trƣờng có dịch nấm đều bị đen và môi trƣờng nuôi cấy cũng có màu đen nhạt. Các mẫu bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng chết đen đặc biệt là những phần mô sẹo thì bị đen nhiều. Ở nghiệm Hình 4.2 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 1 tuần nuôi cấy. P0: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D. P1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 20%. P2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 30%. P3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 40%. P0 P1 P2 P3 36 thức đối chứng mẫu sống sót tốt hơn so với các nghiệm thức khác và không có dấu hiệu bị đen. Điều này cho thấy rằng dịch nấm đã có những ảnh hƣởng nhất định đến khả năng sống sót của mô sẹo. Còn sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng có dịch nấm thì các mẫu mô sẹo ở nghiệm thức P2 và P3 đều bị chết hoàn toàn, chỉ có nghiệm thức P1 mẫu vẫn còn sống nhƣng bên ngoài đều bị đen. Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy có sự rất khác biệt giữa các nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng về phƣơng diện thống kê. Điều này có thể giải thích là nồng độ dịch nấm đã tác động rất lớn đến khả năng sống của mô sẹo và mô sẹo chỉ có thể sống sót ở nồng độ dịch nấm thấp (< 20 %). P0 P1 P2 P3 Hình 4.3 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 2 tuần nuôi cấy. P0: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D. P1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 20%. P2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 30%. P3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 40%. 37 Bảng 4.1 Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến tỉ lệ sống của mô sẹo Nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Tỉ lệ sống (%) 1 tuần sau cấy 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy P0 0 100 a 100 a 100 a P1 20 100 a 66,7 b 25,0 b P2 30 91,7 b 50,0 c 0,0 c P3 40 91,7 b 33,3 d 0,0 c Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 P1 P0 P2 P3 Hình 4.4 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 3 tuần nuôi cấy. P0: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%. 38 Tỉ lệ tạo sẹo Sau 2 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức P0 và P1 mẫu vẫn tiếp tục tạo sẹo còn lại hai nghiệm thức P2 và P3 thì không tạo sẹo thêm mà mẫu có dấu hiệu đen và chết dần. Mẫu bị đen ở phần tiếp xúc với môi trƣờng và xung quanh mô sẹo nhƣng khi cắt mẫu thì phần bên trong mẫu vẫn còn xanh. Sau 3 tuần quan sát chúng tôi thấy các nghiệm thức có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê. Hiện tƣợng mẫu mô sẹo chết đen rất rõ và mẫu ở các nghiệm thức đều không tạo sẹo trừ nghiệm thức đối chứng. Bảng 4.2 Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici lên mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy Nghiệm thức Dịch nấm (%) Tỉ lệ mô bị đen (%) Tỉ lệ tạo sẹo (%) P0 0 0,0 c 66,7 a P1 20 83,3 b 16,7 b P2 30 100 a 0,0 c P3 40 100 a 0,0 c Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Thông thƣờng hiện tƣợng đen của mô sẹo và sự thay đổi màu (bị đen) của môi trƣờng có thể là do hết chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy hay là do nuôi cấy mô sẹo dƣới cƣờng độ ánh sáng cao. Ở đây cả hai nguyên nhân trên đều không phải vì thời gian nuôi cấy chỉ mới 3 tuần (sau khi nuôi cấy khoảng 10 tuần thì dinh dƣỡng trong môi trƣờng mới bắt đầu hết) và điều kiện chiếu sáng khoảng 50 µmol/m2/s (cƣờng độ ánh sáng khá yếu). Mặt khác, ở cùng điều kiện thì ở nghiệm thức không có bổ sung dịch nấm thì hiện tƣợng mô sẹo bị đen và môi trƣờng chuyển màu không xảy ra. Có thể kết luận hiện tƣợng trên là do dịch nấm bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đã ảnh hƣởng đến quá trình phát triển của mô sẹo. Dịch nuôi cấy nấm Phytophthora capsici chứa các trao đổi chất của nấm Phytophthora capsici, các hợp chất đó bao gồm các độc tố của loại nấm này đối với ký chủ của loại nấm này. Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, các tế 39 bào mô sẹo phân chia liên tục, đặc biệt ở các tế bào còn non hiện tƣợng phân chia tế bào rất mạnh mẽ (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Trong quá trình phân chia tế bào sẽ làm cho cấu trúc tế bào kém ổn định. Rất có thể độc tố nấm có trong dịch nấm đã tác động và làm ảnh hƣởng tới quá trình phân bào của mô sẹo. Có thể các tế bào tiếp xúc với môi trƣờng bị đen (các tế bào chết) là do các tế bào này đã tiếp xúc và chịu ảnh hƣởng trực tiếp từ dịch nấm. Vậy thì có hay không có các phản ứng của tế bào mô sẹo đối với độc tố của nấm Các tế bào mô sẹo sẽ có các phản ứng để chống lại với sự ảnh hƣởng của độc tố nấm. Tế bào sẽ sản sinh ra những chất để chống lại độc tố của nấm. Cơ chế phòng vệ của tế bào mô sẹo có thể là do 2 cơ chế: (1) các chất chống lại tác động của độc tố nấm là do các phản ứng sinh hóa phòng vệ của tế bào để chống chịu lại với các điều kiện bất lợi; (2) các chất chống lại tác động của độc tố nấm đƣợc sinh ra là do sự điều khiển của một gene nào đó. Sự tác động của độc tố nấm lên quá trình phân chia tế bào có thể tạo ra một đột biến giúp tế bào có khả năng chống chịu với độc tố nấm. Giải phẫu mô sẹo Các mẫu mô ở các nghiệm thức đều có hình thái giải phẫu giống nhau, các tế bào có cấu trúc, hình dạng đồng đều, nằm sát nhau không tìm thấy sự khác biệt về tế bào sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng có dịch nấm và môi trƣờng không có dịch nấm. Hình 4.5 Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) 40 Sau 2 tuần nuôi cấy, tiến hành cắt mẫu nhuộm phần mô sẹo trên (phần nằm trên môi trƣờng có màu xanh, trắng hay vàng xám) và phần mô sẹo dƣới (phần tiếp xúc với môi trƣờng). Kết quả nhuộm mẫu cho thấy: Phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng của tất cả các nghiệm thức đều cho kết quả nhuộm mẫu giống nhau. Các tế bào xếp sát nhau, hƣớng tâm (hƣớng về phần lõi trong của mẫu mô). Phần mô sẹo nằm dƣới môi trƣờng của nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy có kết quả nhuộm mẫu giống với phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng. Kết quả nhuộm mẫu mô sẹo phần dƣới của các nghiệm thức có chủng dịch nấm cho kết quả khác biệt so với kết quả nhuộm mẫu của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Các tế bào phía trong gần lõi sắp xếp thƣa hơn còn tế bào ở mép bìa lại xếp dày đặc có kích thƣớc nhỏ hơn, tế bào không đồng đều và kích thƣớc tế bào cũng lớn hơn so với các tế bào phần trên và phần dƣới mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Mặt khác, cũng có sự khác biệt giữa các tế bào trong từng nghiệm thức, ở nghiệm thức nồng độ dịch nấm 20 % các tế bào có kích thƣớc và hình dạng gần với nghiệm thức đối chứng, ở nồng độ dịch nấm 30 % và 40 % tế bào có kích thƣớc khác so với các nghiệm thức dịch nấm 20 % và đối chứng. Sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng dịch nấm, tiến hành cắt và nhuộm mẫu mô sẹo. Mẫu ở nghiệm thức P2 và P3 đã bị đen và chết hoàn toàn nên không giải phẫu đƣợc bởi mô bị mềm và rã ra. Do đó, chỉ có hình của hai nghiệm thức đối chứng và P1. Hình thái tế bào ở nghiệm thức đối chứng vẫn không có sự thay đổi còn nghiệm thức có dịch chiết nấm 20% cấu trúc tế bào không đồng đều (to, nhỏ, tròn ,méo) và các tế bào rời rạc. 41 P0 Hình 4.7 Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng đối chứng (P0) và môi trƣờng P1 sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10). P0: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%. P1 P0 Hình 4.6 Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10). P0: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%. P2 P3 P1 42 4.2. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu Tỉ lệ sống Những mẫu mô sẹo đƣợc sử dụng trong nghiệm thức này là những mô non, khả năng sống rất tốt nhƣng khi cấy vào môi trƣờng nghiệm thức thì có một số mẫu đã bị đen chết còn một số thì tạo ra mô xốp và cũng chết dần. Bảng 4.3 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến tỉ lệ sống của mô sẹo Nghiệm thức Tỉ lệ sống (%) 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy 4 tuần sau cấy K0 100 a 100 a 100 a K1 97,7 a 91,7 b 75,0 b K2 100 a 91,7 b 66,7 c K3 91,7 a 91,7 b 50,0 d K4 91,7 a 66,7 c 16,7 f K5 100 a 91,7 b 41,7 e K6 100 a 91,7 b 33,3 g Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Kết quả xử lý số liệu cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về tỉ lệ sống của mô sẹo ở các nghiệm thức chủ yếu là do nồng độ của các chất kích thích sinh trƣởng BA, IBA và TDZ. Sau 2 tuần nuôi cấy: các nghiệm thức chƣa có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở thời gian nuôi cấy 3 tuần: các nghiệm thức có sự khác biệt về về mặt thống kê. Các mô sẹo đƣợc xử lý chất điều hòa sinh trƣởng BA, IBA và TDZ có sự khác biệt với nghiệm thức đối chứng. Ở thời điểm khảo sát này chúng tôi nhận thấy đã có nhiều mẫu bị đen và chết có nghĩa là các mô đã có phản ứng mạnh với nồng độ chất kích thích sinh trƣởng cao. Ở thời gian 4 tuần nuôi cấy: kết quả cho thấy các mẫu mô sẹo đối chứng cho tỉ lệ sống cao hơn hẳn các mô sẹo trong môi trƣờng nghiệm thức có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng. Nghiệm thức K1 (BA 10mg/l và IBA 1mg/l) 43 cho tỉ lệ sống cao hơn các nghiệm thức K2, K3, K4, K4 và K6. Trong khi đó nghiệm thức K4 (BA 1mg/l và IBA 20mg/l) cho tỉ lệ sống sót của mô sẹo là thấp nhất. Tỉ lệ tạo phôi Mô sẹo ở tất cả các nghiệm thức đều tạo phôi, có sự khác biệt giữa các nghiệm thức và tỉ lệ tạo phôi khác nhau ở từng giai đoạn phát triển. Bảng 4.4 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo phôi của mô sẹo tiêu Nghiệm thức Tỉ lệ tạo phôi (%) 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy 4 tuần sau cấy K0 41,7 c 58,3 b 66,7 ab K1 58,3 b 75,0 a 75,0 ab K2 97,0 a 75,0 a 66,7 ab K3 33,3 d 41,7 c 50,0 b K4 8,3 f 16,7 f 16,7 a K5 16,7 e 33,3 d 41,7 ab K6 16,7 e 25,0 e 16,7 a Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Nhìn chung tỉ lệ tạo phôi của mô sẹo tiêu khá cao ở cả 3 thời điểm. Có một số nghiệm thức (K2 và K6) tỉ lệ sau phôi giảm sau thời gian nuôi cấy do sau 4 tuần nuôi cấy có một số mô sẹo tạo ra mô xốp, mô mềm và những mô bị chết dần dần. Hai tuần sau cấy: nghiệm thức K2 (MS + BA 20mg/l + IBA 1mg/l) cho tỉ lệ tạo phôi cao nhất còn tỉ lệ tạo phôi thấp nhất là nghiệm thức K4 (BA 1mg/l + IBA 20mg/l). Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy: theo bảng số liệu cho thấy hầu hết các nghiệm thức đều tăng tỉ lệ tạo phôi trừ nghiệm thức K2. Ở nghiệm thức K1 (BA 10mg/l + IBA 1mg/l ) cho tỉ lệ phôi cao và tạo phôi nhiều sau 1 tuần quan sát. Tỉ lệ phôi sau 4 tuần nuôi cấy: có 3 nghiệm thức có tỉ lệ tạo phôi tăng (K0, K3 và K5) còn lại các nghiệm thức thì tỉ lệ phôi giữa nguyên (K1 và K4) hoặc giảm xuống (K2 và K6). 44 Tỉ lệ tạo chồi Thông thƣờng tạo chồi auxin với nồng độ thấp phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao và tỉ lệ này thƣờng là cytokinin/auxin = 10/1. Do đó, nghiệm thức K1 (BA 10mgl + IBA 1mg/l) cho hệ số nhân chồi cao hơn hẳn, kế đến là nghiệm thức K2 (BA 20mg/l + IBA 1mg/l). Hầu hết các loại thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi auxin lại có vai trò ức chế việc tạo chồi (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch, 1968) điều này đƣợc thể hiện rõ ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Ảnh hƣởng của chất kích thcíh sinh trƣởng đến khả năng tạo chồi của mô sẹo tiêu Nghiệm thức Tỉ lệ tạo chồi (%) 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy 4 tuần sau cấy K0 16,7 c 33,3 b 66,7 e K1 16,7 c 50,0 c 50,0 d K2 33,3 e 66,7 d 50,0 d K3 25,0 d 50,0 c 25,0 c K4 0,0 a 8,3 a 0,0 a K5 16,7 c 8,3 a 8,3 b K6 8,3 b 8,3 a 0,0 a Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Từ kết quả xử lý số liệu chúng tôi nhận thấy hầu hết các nghiệm thức đều tạo chồi chỉ trừ nghiệm thức K4. Tỉ lệ tạo chồi từ mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy thấp vì ở giai đọan này chủ yếu là mô tăng sinh mô sẹo nhiều hơn. Sau 3 tuần nuôi cấy: các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê. Tỉ lệ tạo chồi cao ở nghiệm thức K1, K2 và K3 còn lại tất cả các nghiệm thức đều tạo chồi nhƣng hệ số nhân chồi rất thấp. Tỉ lệ chồi sau 4 tuần nuôi cấy: tất cả các nghiệm thức có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng đều cho hệ số nhân chồi thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng 45 (MS + BA 3mg/l) và có hai nghiệm thức (K4 và K6) cho hệ số nhân chồi là 0 vì ở giai đọan này hầu hết các mẫu đều bị đen ngay cả chồi vẫn bị đen và chết. K0 K1 K2 K4 K5 K3 K6 Hình 4.8 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 2 tuần nuôi cấy. K0: Môi trƣờng gồm MS bổ sung 3 mg/l BA. K1: Môi trƣờng MS bổ sung 10 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K2: Môi trƣờng MS bổ sung 20 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K3: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 10 mg/l IBA. K4: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 20 mg/l IBA. K5: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6: môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. 46 Trong quá trình sinh trƣởng và phátt triển ở gian đọan thí nghiệm thì mô sẹo đã xuất hiện nhiều hiện tƣợng bất thƣờng nhƣ mô sẹo sau một thời gian nuôi cấy bị xốp, đen và bở. Hơn nữa, sau khoảng 4 tuần nuôi cấy thì nhiều mẫu đã tự tiết ra phenol làm đen cả K6 K4 K0 K5 K3 K2 K1 Hình 4.9 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy . K0: Môi trƣờng gồm MS bổ sung 3 mg/l BA. K1: Môi trƣờng MS bổ sung 10 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K2: Môi trƣờng MS bổ sung 20 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K3: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 10 mg/l IBA. K4: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 20 mg/l IBA. K5: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6: môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. 47 mẫu lẫn môi trƣờng nuôi cấy và dần dần mẫu đen chết kể cả những mô bị xốp và bở cũng chết. Theo Ceriani và cộng sƣ, 1992 thì nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhƣng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc. K0 K6 K1 K2 K3 K4 K5 Hình 4.10 Mô sẹo trên môi trƣờng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy. K0: Môi trƣờng gồm MS bổ sung 3 mg/l BA. K1: Môi trƣờng MS bổ sung 10 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K2: Môi trƣờng MS bổ sung 20 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K3: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 10 mg/l IBA. K4: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 20 mg/l IBA. K5: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6: môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. 48 Giải phẫu mẫu Các mẫu mô sẹo sau khi nuôi cấy trong môi trƣờng nghiệm thức 2, 3 và 4 tuần thì đƣợc giải phẫu, nhuộm và xem trên kính hiển vi để xem cấu trúc tế bào mô tiêu. Sau 2 tuần nuôi cấy thì các tế bào ở các nghiệm thức chƣa có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng. Các tế bào nằm sát nhau, có hình dạng và kích thích tƣơng đối giống nhau. Hình 4.11 Mô xốp trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy Hình 4.12 Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chấtt kích thích sinh trƣởng sau 2 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) 49 Cắt mẫu sau thời gian 3 tuần nuôi cấy thì chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt về tế bào ở các nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng. Các tế bào có kích thƣớc, hình dạng không đồng đều và xếp thƣa hơn so với tế bào ở nghiệm tức đối chứng. Mẫu sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy có sự khác biệt về tế bào của từng nghiệm thức và khác so với nghiệm thức đối chứng. Các tế bào to hơn hẳn, hình dạng tế bào bị móp méo và xếp lộn xộn ở phần ngoài mô có nhiều tế bào bị biến dạng và ngay cả phần gần lõi cũng có những tế bào tƣơng tự. Đặc biệt là ở nghiệm thức có chất kích thích sinh trƣởng TDZ ở nồng độ 1mg/l kết hợp với IBA nồng độ 1 mg/l và nghiệm thức TDZ ở nồng độ 2 mg/l kết hợp với IBA nồng độ 1 mg/l, chúng tôi nhận thấy cấu trúc tế bào thƣa hơn nhiều và nhiều tế bào đã bị biến đổi hình dạng. A Hình 4.13 Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10). A: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng đối chứng sau 3 tuần nuôi cấy; B: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy. B 50 K0 Hình 4.14 Mặt cắt mô sẹo tiêu trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10). K0: Môi trƣờng gồm MS bổ sung 3 mg/l BA. K1: Môi trƣờng MS bổ sung 10 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K2: Môi trƣờng MS bổ sung 20 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K3: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 10 mg/l IBA. K4: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 20 mg/l IBA. K5: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6: Môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6 K5 K3 K4 K2 K1 51 4.3. Ảnh hƣởng của tia ph