Khóa luận Khảo sát hàm lượng Progesterone trong sữa bằng kỹ thuật Elisa để chẩn đoán mang thai sớm, chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu trên bò cho sữa tại công ty cổ phần bò sữa Long Thành và các hộ lân cận tỉnh Đồng Nai

ng chín không bị vỡ vào những ngày qui định của chu kỳ lên giống nên không thành lập hoàng thể, nhƣng chúng tiếp tục lớn dần thành khối u mỏng, cấu trúc khối u mềm. Khi bị u nang, nang noãn tiết rất nhiều folliculin nên con vật biểu hiện mãnh liệt không theo chu kỳ nhất định. Một số trƣờng hợp tế bào thƣợng bì nang noãn bị thoái hóa không hình thành đƣợc folliculin nên con đực không động dục, trên buồng trứng hình thành một hoặc một số u nang trong chứa dịch, kiểm tra qua trực tràng phát hiện u nang nổi lên trên bề mặt buồng trứng. U hoàng thể: thƣờng lớn hơn u nang noãn, có thể xuất hiện một hoặc cả hai bên buồng trứng, khối u rắn chất thành khối u dày hơi nhám, bên trong chứa chất hoàng thể sánh đặc. Biểu hiện của bò không động dục hoặc động dục yếu không theo chu kỳ, một số bò vẫn không động dục nhƣng khi phối giống đúng chu kỳ thì không đậu thai (Cao Thanh Phú, 2003). 2.5.5 Thoái hóa buồng trứng Khi tổ chức tế bào buồng trứng bị thoái hóa, teo lại, các tổ chức tăng sinh thay thế. Nguyên nhân buồng trứng bị viêm không phát hiện và không điều trị kịp thời; đồng thời, cũng có thể nuôi dƣỡng chăm sóc kém, chẩn đoán qua trực tràng sẽ thấy một phần hoặc toàn bộ buồng trứng bị chai cứng, mặt buồng trứng không còn trơn chu mà lồi lõm, thể tích teo nhỏ. Biện pháp điều trị chủ yếu là cải thiện chế độ nuôi dƣỡng chăm sóc, sử dụng kích thích tố sinh dục và bổ sung các vitamin A, D, E giúp cho việc phục hồi cơ năng của buồng trứng, nên loại thải. 17 2.6 Vai trò progesterone trong sinh sản 2.6.1 Nguồn gốc progesterone Progesterone do hoàng thể từ buồng trứng tiết ra. Các tế bào trong nang sau khi rụng trứng vẫn còn dính trong buồng trứng và giữ vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh sản, chúng phát triển to ra, và tăng tiết progesterone. Hoàng thể tổng hợp progesterone từ cholesterol, khi qua gan sẽ bị thoái hóa và biến thành pregnandiol và thải qua nƣớc tiểu. Ngoài hoàng thể thì vỏ thƣợng thận cũng sản xuất một ít progesterone và nhau thai tiết ra ở 5 tháng cuối thời kỳ mang thai (Nguyễn Minh Thanh, 2005). 2.6.2 Bản chất, khối lƣợng phân tử, cấu trúc phân tử Progesterone là một hormone steroid với 21 carbone. Progesterone còn tổng hợp và phân tiết từ nhau thai trong suốt giai đoạn thú cái có mang. Tác dụng sinh học với cƣờng độ mạnh giúp cho thú cái hoàn thành bản năng làm mẹ. Progesterone có công thức phân tử là C12H30O2. Khối lƣợng phân tử là 314,45. Progesterone đƣợc phân tách từ hoàng thể heo nái có cấu trúc phân tử gồm: hai dạng tinh thể là dạng bền vững và không bền vững. Progesterone ở dƣới dạng những tinh thể không màu hay bội kết tinh màu trắng không mùi. Nóng chảy ở 1270C – 1290C. Thực tế không tan trong nƣớc, tan trong cồn, tan trong ete, dễ tan trong chloroform, ít tan trong dầu. Phản ứng màu Zimmernam cho màu đỏ. Phản ứng tạo bis dinitrophenylhyrazon-progesterone. Đun nóng progesterone và dinitro-2,4-phenylhydrazin trong cồn với sự có mặt của HCl thì có sự xuất hiện kết tủa đỏ nâu của bis dinitrophenylhyrazon- progesterone, chất nóng chảy ở 2700C – 2800C (Nguyễn Minh Thanh, 2005). 18 2.6.3 Vận chuyển và chuyển hóa progesterone và tác dụng của progesterone Vận chuyển và chuyển hóa: Khi đƣợc vận chuyển trong máu dƣới dạng gắn chủ yếu với albumin huyết tƣơng và các globulin gắn đặc hiệu với progesterone, vài phút sau khi đƣợc bài tiết tất cả progesterone đƣợc thoái hóa thành các steroid khác không còn tác dụng của progesterone. Gan rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa này. Progesterone có sản phẩm cuối cùng là pregnandiol đƣợc bài xuất theo nƣớc tiểu; vì vậy, có thể đánh giá mức độ tạo thành progesterone trong cơ thể thông qua mức bài xuất progesterone qua đƣờng tiểu. Sự tác dụng của progesterone lên tử cung: Kích thích sự bài tiết của niêm mạc tử cung ở trạng thái sẵn sàng đón trứng đã thụ tinh và làm tổ. Kích thích tế bào tuyến niêm mạc tử cung bài tiết một lớp dịch quánh dày và tác dụng lên vòi Fallope, progesterone kích thích tế bào niêm mạc, vòi Fallope bài tiết dịch chứa chất dinh dƣỡng để nuôi dƣỡng trứng đã thụ tinh, thực hiện quá trình phân chia trong khi di chuyển vào buồng tử cung. Tác dụng lên tuyến vú: Làm phát triển tuyến thùy kích thích tế bào tuyến vú tăng sinh và trở nên có khả năng bài tiết. Tác dụng lên cân bằng điện giải: Steroid khác progesterone với nồng độ cao có thể tăng sự tái hấp thu với Na+, Cl- và nƣớc ở ống lƣợn xa. Thực tế cho thấy, progesterone thƣờng gây bài xuất ion Na+ và nƣớc; vì, progesterone có khả năng cạnh tranh với aldosterone để gắn vào thụ thể sẽ làm tăng tái hấp thu ion và nƣớc, tác dụng này của progesterone lại yếu hơn nhiều so với aldosterone; cho nên, cơ thể mất nƣớc và muối thì không đƣợc tái hấp thu, sự tăng ion Na + đƣợc bài xuất nên lại đƣợc tăng tiết aldosterone từ tuyến vỏ thƣợng thận, hiện tƣợng này thƣờng gặp ở thời kỳ có thai. Ảnh hƣởng thân nhiệt: Nhiệt độ của cơ thể tăng từ 0,3 – 0,50C do sự tác động của progesterone, nhƣng cơ chế làm tăng nhiệt độ của progesterone thì chƣa rõ. Có ý kiến cho rằng progesterone tác dụng lên trung tâm điều nhiệt ở vùng dƣới đồi. Điều hòa bài tiết: Progesterone chịu ảnh hƣởng điều khiển trực tiếp của hormone LH, do tuyến yên bài tiết. Nếu nồng độ LH tăng trong máu, hoàng thể sẽ 19 đƣợc nuôi dƣỡng và bài tiết nhiều progesterone. Ngƣợc lại, nếu mà tuyến yên bài tiết ít LH, hoàng thể sẽ bị thoái hóa và progesterone sẽ đƣợc bài tiết ít. Tóm lại, progesterone có tác dụng đặc biệt quan trọng nó làm cho quá trình có thai xảy ra bình thƣờng và có các tác dụng nhƣ sau: Phát triển tế bào nội mạc tử cung, những tế bào này đóng vai trò quan trọng trong việc nuôi dƣỡng bào thai ở thời kỳ đầu. Progesterone giảm co bóp tử cung khi có thai, do đó ngăn cản sẩy thai. Progesterone làm tăng bài tiết dịch và niêm mạc tử cung để cung cấp dinh dƣỡng cho phôi. Progesterone ảnh hƣởng đến quá trình phân chia của trứng đã thụ tinh. Progesterone có tác dụng làm phát triển thùy và bọc tuyến vú. Với những tác động trên, gọi progesterone là hormone an thai… Vì lý do nào đó nồng độ progesterone giảm đi, và sự phát triển bào thai sẽ bị ảnh hƣởng. Cơ quan sinh dục chuẩn bị là tổ hợp tử nuôi dƣỡng bào thai, progesterone làm cho tử cung yên tĩnh; đồng thời, giúp cho lớp niêm mạc tử cung phát triển và làm cho các tuyến ống thẳng phân nhánh, xoắn lại để chuẩn bị tiết sữa sau này. Khi hàm lƣợng progesterone tăng cao trong máu ngoại biên chúng tỏ có sự hiện diện của hoàng thể trong buồng trứng. Hiện nay, kiểm soát sinh sản ở thú cái progesterone là chỉ tiêu cần kiểm tra, chủ yếu là tính ổn định về nồng độ phản ánh ở giai đoạn của chu kỳ động dục và sự ổn định của bào thai (Nguyễn Minh Thanh, 2005). 2.6.4 Động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng, mang thai 2.6.4.1 Động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng Hàm lƣợng progesterone thấp nhất vào ngày động dục với mức nhỏ hơn 1 ng/ml. Sau đó tăng dần lên từ ngày thứ 3 của chu kỳ. Hàm lƣợng progesterone đạt đỉnh cao từ ngày 9 đến ngày 18 của chu kỳ động dục với mức lớn hơn 3 ng/ml. Đỉnh cao của hàm lƣợng progesterone không cố định vào một ngày nào trong khoảng thời gian từ ngày thứ 9 đến ngày thứ 18 của chu kỳ động dục. Từ ngày thứ 20 19 của chu kỳ thì hàm lƣợng progesterone giảm xuống rất nhanh và đạt mức thấp nhất vào ngày thứ 20 đến ngày thứ 21 của chu kỳ với mức nhỏ hơn 1 ng/ml. Từ việc xác lập động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng đã cho chúng ta rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn, đặc biệt là việc xác lập động thái progesterone trong các trƣờng hợp khác nhau của rối loạn sinh sản do nội tiết, từ đó biết đƣợc tình trạng hoạt động của buồng trứng. Hình 2.3 Động thái progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng ở bò (Chung Anh Dũng, 2002) 2.6.4.2 Động thái progesterone lúc mang thai Số liệu thống kê cho thấy có khoảng 27,4% số bò cái không thụ thai sau khi gieo tinh nhân tạo, nhƣng vẫn không phát hiện đƣợc triệu chứng động dục trở lại cho đến ngày 60 khám thai qua trực tràng sau khi gieo tinh nhân tạo. Nhƣ vậy, nếu chỉ với biện pháp khám thai qua trực tràng nhƣ hiện nay thì số bò này đã có khoảng cách tăng đáng kể giữa 2 lứa đẻ, ít nhất là tăng 2 tháng. Trong khi đó, các nghiên cứu cũng chứng minh rằng việc khám thai qua trực tràng tốt nhất cũng nên thực hiện sớm nhất vào ngày thứ 60 sau khi gieo tinh nhân tạo. Nếu thực hiện kỹ thuật này sớm hơn, trong giai đoạn 40 ngày sau khi gieo tinh nhân tạo sẽ làm tăng đáng GIAI ÑOÏAN NGHÆ NGÔI (Anestrus phase) GIAI ÑOÏAN TIEÀN ÑOÄNG DUÏC (Proestrus phase) GIAI ÑOAÏN ÑOÄNG DUÏC (Estrus phase) GIAI ÑOAÏN SAU ÑOÄNG DUÏC (Post estrus phase) P ro ge st e ro n tr o n g m aù u (n g/ m l) Ngaøy trong chu kyø ñoäng duïc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 P ro ge st e ro n tr o n g m aù u (n g/ m l) 21 kể tỷ lệ sẩy thai từ 10% đến 11%. Đo hàm lƣợng progesterone trong máu hoặc sữa vào ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 sau khi gieo tinh để có thể xác định tình trạng có hay không có thai ở bò cái. Cơ sở của việc ứng dụng hàm lƣợng progesterone vào ngày thứ 21 sau khi gieo tinh để xác định sớm sự mang thai của bò cái. Hình 2.4 Động thái progesterone giúp chẩn đoán sớm có thai (Chung Anh Dũng, 2002) 2.6.5 Các chỉ định và ứng dụng của xét nghiệm progesterone trong sữa 2.6.5.1 Chẩn đoán bò mang thai và không mang thai Việc chẩn đoán có thai sớm bằng progesterone chính xác khoảng 80%, 20% sai sót là do sự khác nhau về độ dài của chu kỳ động dục giữa các bò, các nhầm lẫn trong phát hiện động dục, bệnh tử cung nhƣ bọc mủ tử cung, hoạt động khác thƣờng của buồng trứng nhƣ u nang thể vàng hoặc nang trứng và phôi chết sớm. Việc sử dụng progesterone để chẩn đoán có thai cần phải kết hợp với khám thai 40 ngày, hoặc muộn hơn sau khi phối giống. Tuy nhiên, với một loạt các mẫu lấy vào ngày 0 (ngày phối tinh) và các ngày thứ 21 và 24, việc chẩn đoán sự không có thai có thể Chaån ñoùan coù thai döïa vaøo haøm löôïng progestron … … … … Khoâng coù thai P ro g e st e ro n tr o n g m a ùu (n g /m l) Ngaøy trong chu kyø ñoäng duïc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Coù thai P ro g e st e ro n tr o n g m a ùu (n g /m l) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 22 đạt tới độ chính xác 95 – 100%. Do vậy, progesterone vốn đƣợc coi là công cụ để chẩn đoán có thai sớm nên đƣợc sử dụng cho mục đích chẩn đoán không có thai và từ đó có thể xác định đƣợc tình trạng có thai hay không có thai của gia súc. Việc sớm xác định không có thai này sẽ tránh đƣợc sự bỏ lỡ cơ hội phối giống tiếp theo (Chung Anh Dũng, 2002). 2.6.5.2 Xác nhận động dục Bò cái thƣờng không có dấu hiệu động dục rõ ràng dẫn đến việc quyết định phối giống sai. Vào thời điểm phối tinh có tới 15 – 20% bò sữa không động dục. Ở một số trang trại, tỷ lệ phát hiện động dục sai có thể cao tới 50% hoặc hơn. Progesterone trong sữa có thể dùng để xác định động dục ở bò. Nếu mẫu sữa kiểm tra cho thấy hàm lƣợng progesterone cao thì có thể bò không động dục và cần đƣợc theo dõi cẩn thận cũng nhƣ kiểm tra lại các mẫu lấy vào thời điểm muộn hơn. Có thể tiến hành đơn giản bằng cách giữ lại mẫu sữa vào thời điểm bò đƣợc đƣa ra để phối tinh cho đến khoảng 2 tuần hoặc một tháng sau. Nếu nhiều hơn 10% số bò đƣợc phối tinh vào thời điểm có hàm lƣợng progesterone cao thì có thể chứng minh đƣợc là việc phát hiện động dục không chính xác. Các stress với môi trƣờng có tác động rất lớn đến hiệu quả sinh sản. Đặc biệt, stress nhiệt là nguyên nhân dẫn đến việc giảm nghiêm trọng tỷ lệ có thai, tăng tỷ lệ chết phôi sớm, giảm độ dài và cƣờng độ của các biểu hiện động dục và làm giảm thể trọng bé sinh ra. Ngày nay ngƣời ta đã sử dụng progesterone trong sữa để trợ giúp cho các chƣơng trình phối giống trong điều kiện gia súc bị stress do môi trƣờng (Chung Anh Dũng, 2002). 2.7 Nguyên lý kỹ thuật ELISA (Progesterone – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Phản ứng ELISA thƣờng kết hợp kháng nguyên – kháng thể không thể phát hiện bằng mắt thƣờng, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng đặc tính hấp thụ tự nhiên của protein lên polyethylen đã gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên giá rồi cho kháng nguyên hoặc kháng thể tƣơng ứng có đánh dấu enzyme và tạo phản ứng. 23 Bỏ chất đánh dấu không kết hợp, cho thêm vào hỗn hợp chất hiện màu. Cũng nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O từ oxy hóa hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch. Nhƣ vậy, kỹ thuật ELISA gồm có 3 thành phần tham gia phản ứng (kháng nguyên, kháng thể và chất hiện diện màu) đồng thời thực hiện có 2 bƣớc: Trong phản ứng miễn dịch: là sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. Trong phản ứng hóa học:nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng [O] vì chính [O] này oxi hoá chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị thay đổi màu có nghĩa là chứng minh sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể. Có 2 loại kỹ thuật ELISA chính: kỹ thuật ELISA trực tiếp và kỹ thật ELISA gián tiếp. – Kỹ thuật ELISA trực tiếp: khi kháng nguyên đƣợc gắn vào đáy giếng phản ứng sau đó phủ lên kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Khi rửa để loại bỏ kháng thể gắn enzyme không kết hợp với kháng nguyên và cho vào giếng chất hiện màu. Đọc kết quả bằng phổ kế sau 10 phút. Kết quả có 2 trƣờng hợp xảy ra: Kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng [O] từ H2O2 để oxy hóa chất hiện màu, kết quả làm thay đổi màu hỗn dịch trong giếng. Kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể thì không xảy ra sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể, enzyme bị rửa trôi, kết quả là hỗn dịch trong giếng phản ứng không thay đổi màu. – Kỹ thật ELISA gián tiếp: Theo nguyên tắc kỹ thuật ELISA trực tiếp và gián tiếp không khác nhau, nhƣng kỹ thuật gián tiếp có thêm một bƣớc phản ứng. Conjugate trong kỹ thuật trực tiếp là kháng thể đặc hiệu gắn với enzyme, trong khi đó, conjugate của phản ứng gián tiếp là kháng thể khác với enzyme và đọc kết quả xảy ra 2 trƣờng hợp: 24 Nếu nhƣ kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể, sẽ có sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể và sự kết hợp giữa conjugate với phức hợp kháng nguyên kháng thể, trong giếng hỗn dịch có enzyme để giải phóng [O] từ H2O2, oxy hoá chất hiện màu làm thay đổi màu hỗn dịch (phản ứng dƣơng tính). Khi kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể thì không có sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể bị rửa trôi, đồng thời, conjugate không kết hợp với kháng nguyên cũng bị rửa trôi, hỗn dịch không có sự kết hợp với kháng nguyên với kháng thể, kháng thể bị rửa trôi và conjugate không kết hợp với kháng nguyên cũng bị rửa trôi, hỗn dịch sẽ không có enzyme để giải phóng enzyme [O] từ H2O2, chất hiện màu không bị oxy hoá, hỗn dịch không thay đổi màu (phản ứng âm tính). (Ngô Phƣơng Nghị, 2003) 25 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian Từ tháng 03/2007 đến tháng 07/2007. 3.1.2 Địa điểm Đề tài thực hiện tại các hộ chăn nuôi bò sữa và Công ty Cổ Phần Bò Sữa huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai. Mẫu sữa xét nghiệm đƣợc phân tích tại Trung Tâm Phân Tích Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng khảo sát – 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) nhóm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 sinh sản bình thƣờng. – 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) nhóm máu 50 và 75% HF sau khi sinh từ 90 ngày trở lên thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 không động dục hoặc phối giống nhiều lần không đậu. 3.3 Nội dung khảo sát Lấy mẫu sữa của bò đƣợc phân theo nhóm máu, lứa đẻ ở các ngày thứ nhất lúc gieo tinh; ngày thứ 7, ngày thứ 14, ngày thứ 21 và ngày thứ 24 sau khi gieo tinh để khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa. 3.4 Phƣơng pháp tiến hành Khảo sát 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) sinh sản bình thƣờng và 20 con bò sữa chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa đẻ 1, 2, 3 và 4. 26 3.4.1 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo nhóm máu Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò sinh sản bình thƣờng theo nhóm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1 Số mẫu sữa khảo sát trên bò sinh sản bình thƣờng Nhóm máu Số bò (n) Số mẫu sữa thu thập (N) 50% 10 40 75% 10 40 Tổng cộng 20 80 Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.2 Bảng 3.2 Số mẫu sữa khảo sát trên bò chậm động dục Nhóm máu Số bò (n) Số mẫu sữa thu thập (N) 50% 10 40 75% 10 40 Tổng cộng 20 80 3.4.2 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo các lứa đẻ Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò sinh sản bình thƣờng theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bò sinh sản bình thƣờng Lứa đẻ Số bò (n) Số mẫu thu thập (N) 1 4 16 2 7 28 3 4 16 4 5 20 Tổng cộng 20 80 27 Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không dậu theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.4. Bảng 3.4 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bò chậm động dục Lứa đẻ Số bò (n) Số mẫu thu thập (N) 1 4 16 2 7 28 3 4 16 4 5 20 Tổng cộng 20 80 3.4.3 Lấy mẫu sữa và ly tâm 3.4.3.1 Lấy mẫu Vệ sinh lọ đựng sữa có thể tích khoảng 50 ml. Rửa sạch và lau khô bầu và núm vú của bò sữa. Vắt sữa bò bình thƣờng đƣợc khoảng vài lít, sau đó hứng sữa cho vào lọ để đạt thể tích khoảng 50 ml. Sữa đƣợc lấy vào buổi chiều đối với cả hai nhóm bò sinh sản bình thƣờng và bò chậm sinh. 3.4.3.2 Ly tâm và trữ mẫu Mẫu sữa đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút. Phần màu vàng đục và đặc ở trên là béo và phần cặn sữa ở dƣới đáy ống nghiệm phải đƣợc loại bỏ. Sử dụng kim chích đâm xuyên qua phần béo rồi hút phần sữa trong bên dƣới cho vào ống đựng mẫu ghi số hiệu và bảo quản trong tủ đông -300C. 3.4.4 Kỹ thuật ELISA Chuẩn bị xét nghiệm: Bộ kít progesterone (Bovine progesterone ELISA Test. Endocrine technologies, INC. USA ) đƣợc bảo quản ở 2 đến 80C nếu không sử dụng. Tuyệt đối không trữ đông, các mẫu sữa xét nghiệm đƣợc đƣa về nhiệt độ phòng để chuẩn bị pha dung dịch pha loãng và TBM theo tỷ lệ 1A/1B trong một ống nghiệm sạch trƣớc khi xét nghiệm từ 5 đến 10 phút. Những chất xét nghiệm dƣ phải đƣợc loại bỏ. 28 3.4.4.1 Thành phần bộ kít – 96 lỗ giếng đƣợc phủ sẵn kháng thể IgG của thỏ. – Nồng độ progesterone chuẩn: 0; 0,5; 3,0; 10; 25 và 50 ng/ml chất lỏng pha sẵn, mỗi chai là 0,5 ml. – Dung dịch pha loãng mẫu, 25 ml. – Thuốc thử màu TMB, 12 ml. – Dung dịch chuẩn độ (2N HCL), 6 ml. – Chất đệm rửa 20 X, 20 ml. – Stop Solution (3N HCL): 10 ml. 3.4.4.2 Dụng cụ thực hiện – Máy ly tâm 3000 vòng/phút. – Ống nghiệm bằng nhựa (5 ml). – Bông thấm nƣớc. – Thùng đá bảo quản mẫu. – Pipette chính xác hút đƣợc 25, 50, 100, 200 μl và 1 ml – Nƣớc cất. – Ống nghiệm bằng thủy tinh để pha chất nền màu A, B. – Giấy thấm. – Băng keo trong. – Máy đọc đĩa vi chuẩn độ. – Giấy vẽ đồ thị tuyến tính. – Tủ sấy 370C. – Parafine để bịt kín đĩa. – Đầu hút gắn vào pipette sử dụng một lần. 29 3.4.4.3 Các bƣớc xét nghiệm – Trƣớc khi xét nghiệm lấy các mẫu sữa ra, để rã đông ở nhiệt độ phòng rồi mới tiến hành xét nghiệm. – Tất cả thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phòng 180C đến 250C trƣớc khi sử dụng. – Lấy pipette chuẩn độ 50 μl hút mẫu vật xét nghiệm và mẫu đối chứng vào các lỗ giếng thích hợp. – Lấy 100 μl dung dịch kết hợp enzyme progesterone vào mỗi lỗ giếng (ngoại trừ những lỗ giếng để trống, lắc lỗ giếng 30 giây, ủ ở 370C trong 1giờ. Nên dùng parafin để che những lỗ giếng hoặc sử dụng túi thích hợp để cất giữ những đĩa trong suốt quá trình ủ ấm. – Bỏ những chất còn tồn đọng bên trong lỗ giếng và rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa (250 đến 300 μl/giếng). Lật ngƣợc đĩa, kiểm tra bằng giấy thấm để lấy đi nƣớc ẩm còn xót lại. – Thêm 100 μl dung dịch TMB vào tất cả các giếng theo thứ tự. – Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng từ 18 đến 280C trong 10 phút, không đƣợc di chuyển. – Dừng phản ứng bằng cách cho thêm 50 μl chất chuẩn độ vào các giếng theo thứ tự giống nhau để cơ chất thêm vào tác động từ từ. – Đọc bƣớc sóng hấp thu ở 450 nm với máy đọc vi lƣợng. Chú ý: Ủ cơ chất phải đƣợc giữ trong nhiệt độ từ 25 đến 280C. Nếu ngoài nhiệt độ giới hạn này, thời gian ủ ấm phải đƣợc tính lại cho đúng. 3.4.4.4 Tính toán kết quả – Tính độ hấp thu trung bình mỗi loại: Mẫu chuẩn, mẫu đối chứng, mẫu sữa xét nghiệm. – Vẽ đƣờng cong chuẩn trên giấy vẽ đồ thị tuyến tính. Độ hấp thu của chuẩn để ở trục tung (Y). Nồng độ chuẩn tƣơng ứng ở trục hoành (X). – Tính toán nồng độ progesterone của mẫu sữa dựa vào đƣờng cong chuẩn trên. 30 3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu – Số liệu đƣợc trình bày dƣới dạng trung bình và sai số của mẫu ( X ± SE). – Trung bình cộng: N X ... XX N2 1X Trong đó: X1, X2, … XN là hàm lƣợng progesterone của mẫu sữa khảo sát N: là số mẫu sữa khảo sát – Độ lệch chuẩn: SX = 1 - N x( - i 22 )ix 31 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Qua thời gian khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa của 20 bò sinh sản bình thƣờng và 20 bò chậm động dục bằng kỹ thuật ELISA ở các thời điểm lấy mẫu lúc phối giống; 7; 14; 21 và 24 ngày sau khi phối giống, đồng thời sau đó 60 ngày khám thai qua trực tràng để chẩn đoán bò đƣợc mang thai hay không sau khi phối đã cho các kết quả sau. 4.1 Hàm lƣợng progesterone trong sữa bò sinh sản bình thƣờng Kết quả khảo sát hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa qua các thời điểm kiểm tra của 20 bò sinh sản bình thƣờng đƣợc trình bày qua Bảng 4.1 và Hình 4.1. Bảng 4.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bò sinh sản bình thƣờng Hàm lƣợng progesterone theo nhóm n Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) của ngày Chẩn đoán mang thai 60 ngày khám qua trực tràng 0 7 14 21 24 n % Cao 10 0,61 0,25 1,08 0,24 1,69 0,42 2,31 0,46 2,55 0,41 8 80 Thấp 10 0,34 0,26 0,58 0,39 1,12 0,43 0,87 0,53 0,80 0,49 0 0 32 2,55 0,800,61 1,08 1,69 2,31 0,34 0,58 1,12 0,87 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 7 14 21 24 Ngày lấy mẫu H àm lư ợn g pr og es te ro ne (n g/ m l) Cao Thấp Hình 4.1 Hàm lƣợng progesterone sữa bò sinh sản bình thƣờng Qua khảo sát chúng tôi nhận thấy tỷ lệ đậu thai trên bò sinh sản bình thƣờng là 40%. Kết quả này thấp hơn kết quả tỷ lệ thụ thai của Lê Xuân Cƣơng và ctv (1999) là 68%, Chung Anh Dũng (2002) là 68,4%, Nguyễn Văn Tìm và ctv (1997) là 55,5% - 58,8%. Kết quả nêu trên chứng tỏ còn nhiều yếu tố hạn chế hiệu quả trong gieo tinh nhân tạo và khả năng thụ thai của bò sữa tại nơi khảo sát. Qua Bảng 4.1 và Hình 4.1 cho thấy ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao đã có hàm lƣợng progesterone trung bình vào ngày thụ tinh nhân tạo thấp 0,61 ng/ml, tăng nhanh từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 lần lƣợt là 1,08 và 1,69 ng/ml và tiếp tục tăng từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 lần lƣợt là 2,31 và 2,55 ng/ml. Kết hợp với việc kiểm tra hàm lƣợng progesterone ở ngày thứ 21 và 24 và kỹ thuật khám thai qua trực tràng đã cho thấy tỷ lệ đậu thai là 80%. Trong lúc đó bằng kỹ thuật khám thai qua trực tràng đã cho thấy hoàng thể tồn lƣu là 2 bò chiếm tỷ lệ là 20% trong nhóm có hàm lƣợng progesterone cao. Kết quả này thấp hơn kết quả của Phan Văn Kiểm và ctv (2006) khi chẩn đoán mang thai sớm bằng ELISA với hàm lƣợng progesterone trung bình trong sữa ở bốn thời điểm tƣơng ứng lần lƣợt là 0,17; 1,45; 2,64 và 2,88 ng/ml và tỷ lệ đậu thai là 84,84% trong nhóm bò có hàm lƣợng progesterone cao. Điều này cho thấy, bò động dục có rụng trứng, đậu thai, thể vàng phát triển tốt. Trong lúc đó có hai bò không đậu thai do hoàng thể hình thành nhƣng 33 không tiêu biến mà vẫn còn tồn tại làm cho hàm lƣợng progesterone cao trong sữa. Khi khám qua trực tràng chúng tôi nhận thấy bò này có hoàng thể to, cứng. Ngoài ra, kết quả khám thai qua trực tràng sau 60 ngày đã cho thấy tỷ lệ này tƣơng đƣơng với khoảng biến thiên so với kết quả khảo sát của Nakao và ctv (1982) khi chẩn đoán mang thai sớm bằng ELISA với độ chính xác biến thiên từ 80 đến 85%. Từ những kết quả mà chúng tôi khảo sát so với kết quả của các tác giả trƣớc đó đã cho thấy rằng việc sử dụng kỹ thuật ELISA kiểm tra hàm lƣợng progesterone sữa dễ dàng xác định bò có hàm lƣợng progesterone thấp ở ngày thứ 21 là những bò không đậu thai nhƣng đối với những bò có hàm lƣợng progesterone sữa cao đã cho thấy rất khó xác định là chúng đã mang thai hay tồn lƣu hoàng thể. Ở nhóm bò có hàm lƣợng progesterone thấp đã có hàm lƣợng progesterone trung bình ở thời điểm lấy mẫu lú